专利名称:用于从肟基酸生产氨基酸衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及从肟基酸(hydroxyimino acid)生产氨基酸衍生物的方法，具体涉及通过酶促还原从羟亚胺酸(hydroxyimine acid)生产氨基酸衍化物的方法。
背景技术：
氨基酸在工业中作为例如药物、食品、试剂以及化学合成中间体是非常重要的组分。用于生产氨基酸的方法大致分成四种方法，即提取法、发酵法、酶法以及化学合成法。酶法是将具有与目的氨基酸相似结构的前体作为起始原料经过酶反应的一个至几个阶段而快速转变为氨基酸的方法。通常，酶法可得到具有高纯度、副产物量很少的氨基酸。当可以廉价得到作为底物的前体时，酶法是非常有效的生产方法。
Monatin，一种氨基酸衍化物，是天然存在的、甜味的氨基酸分离物，并可从南非的灌木根中提取。Monatin具有比蔗糖高出数十倍至数千倍的甜度，并预期用作甜味剂。
作为用于生产Monatin的化学合成法的实例，现有的方法是将吲哚乙酸(indolacetic acid)衍生物和天冬氨酸卤化物作为合成酮衍化物的起始原料，并由此获得氰醇(cyanohydrin)衍生物，其随后在碱性条件下水解(例如，专利文献1)。作为酶法的实例，现有的方法是从吲哚-3-丙酮酸生成作为中间体的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-酮戊二酸(也称为IHOG)，然后在酶的存在下由此生成Monatin(例如，专利文献2)。还有在酶的存在下生产上述IHOG的已知方法(例如，专利文献3)。
作为从IHOG生成Monatin的另一种方法，现有的方法是IHOG用来生产IHOG-肟(或4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚胺戊二酸)，其随后在还原催化剂例如铑的存在下转变为Monatin(例如，专利文献4)。然而，没有用于在微生物或酶的存在下从比IHOG更稳定的IHOG-肟中生产Monatin的任何已知的方法。
在专利文献5和非专利文献1至4中描述了通过微生物或酶(酶促还原)来还原肟(羟亚胺)。例如，专利文献5描述了用于从苯乙酮肟生产α-甲基苄胺的方法。然而，没有在微生物或酶的存在下用于还原肟基酸来生产氨基酸的任何已知的方法。
引用的参考文献列表专利文献1日本专利申请公开(Laid-open)号2003-171365；专利文献2国际公开WO2003/056026单行本(Pamphlet)；专利文献3国际公开WO2004/018672单行本；专利文献4国际公开WO2003/059865单行本；专利文献5日本专利申请公开号H4-234993A；非专利文献1Pharmacology，13，234(1975)；非专利文献2Clement等，Arch.der Parmazie，321，955(1998)；非专利文献3Clement等，JBC，272，19615(1997)；非专利文献4Gibbs等，Tetrahedron Lett.，31，555(1990)。
发明内容
发明所要解决的问题通过化学合成法来生产氨基酸衍生物的方法可用于生产难以分离和提取的氨基酸衍生物。然而，就工业生产规模的成本而言，化学合成法有许多缺点，例如设备费用高并且需要使用昂贵的催化剂。相反，利用微生物或酶的方法可用于工业上许多方面以生产氨基酸衍生物。在这种情况下，本发明目的在于提供用于生产氨基酸衍生物的工业上有利的方法。
解决问题的方法本发明者对生产氨基酸衍生物例如Monatin的新方法进行了广泛研究。结果，他们已发现通过使用微生物和/或酶还原肟基酸来生产氨基酸衍生物的方法，从而完成本发明。也就是说，本发明提供用于生产氨基酸衍生物的下列方法。
(1)生产氨基酸衍生物的方法，该方法包括如下步骤在微生物和/或酶的存在下从由下列通式(I)表示的肟基酸
其中R1表示选自下列取代基任选取代的C2至C6烷基、任选取代的C6至C14的芳基、任选取代的C6至C10的环烷基、任选取代的C7至C19的芳烷基、任选取代的C2至C10的烷氧基烷基、任选取代的基团，其与上述任何一个基团相同，除了在其碳架中含有杂原子，和下列通式(II)表示取代基R3 其中R4表示选自下列的取代基任选取代的C2至C6的烷基、任选取代的C6至C14的芳基、任选取代的C6至C10的环烷基、任选取代的C7至C19的芳烷基、任选取代的C2至C10的烷氧基烷基、任选取代的基团，其与上述任何一个基团相同，除了在其碳架中含有杂原子；X1和X2独立地表示羟基或羰基，R2表示C1至C3的烷基或氢原子；以及n是0或1，反应产生由下列通式(III)表示的氨基酸衍生物 其中R1和n具有与通式(I)中R1和n相同的含义，其中微生物和/或酶能催化该反应。
(2)根据(1)所述的方法，其中n是0，并且由此产生的氨基酸衍生物是α-氨基酸衍生物。
(3)根据(1)所述的方法，其中由此产生的氨基酸衍生物是α-L-氨基酸。
(4)根据(1)所述的方法，其中由此产生的氨基酸衍生物是α-D-氨基酸。
(5)根据(1)所述的方法，其中n是1，并且由此生成的氨基酸衍生物是β-氨基酸衍生物。
(6)根据(1)所述的方法，其中芳基是任选取代的苯基或萘基。
(7)根据(1)所述的方法，其中芳烷基是任选取代的苯烷基或萘烷基。
(8)根据(1)所述的方法，其中在碳架中含有杂原子的基团是任选取代的吡啶基或吲哚基。
(9)用于生产Monatin的方法，包括在微生物和/或酶的存在下，从由通式(IV)表示的IHOG-肟 反应生成由下列通式(V)表示的Monatin 其中微生物和/或酶能催化该反应。
(10)用于生产β-苯基-β-丙氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下从由通式(VI)表示的BAE-肟 反应生成β-苯基-β-丙氨酸，其中微生物和/或酶能催化该反应。
(11)用于生产色氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下从由通式(VII)表示的吲哚-3-丙酮酸-肟 反应生成色氨酸，其中微生物和/或酶能催化该反应。
(12)根据(1)、(9)、(10)以及(11)中任意一项所述的方法，其中微生物是属于选自下组的任何属的一种或多种微生物柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)以及红球菌属。
(13)根据(1)、(9)、(10)以及(11)中任意一项所述的方法，其中微生物选自下组弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、中间埃希氏菌(Escherichiaintermedia)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及海生红球菌(Rodococcusmarinonascens)。
(14)根据(1)、(9)、(10)以及(11)中任意一项所述的方法，其中将选自NADH、NADPH、吡哆醛-5′-磷酸以及MgCl2中的一种或多种化合物加入由通式(I)表示的化合物产生由通式(III)表示的化合物的反应溶液。
发明效果根据本发明，提供了容易地生产氨基酸的方法，其在成本方面是有利的。
实施发明的最佳方式在根据本发明所述的生产氨基酸衍生物的方法中，通过微生物和/或酶的催化作用将通式(I)的肟基酸转变成通式(III)的化合物。在本说明书中，“氨基酸衍生物”包括氨基酸自身及其衍生物。
在本发明中使用的具有催化此反应的能力的微生物优选实例，包括属于选自下组的任何属的微生物柠檬酸杆菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属(Corynebacterium)、红球菌属、沙门氏菌属(Salmonella)以及欧文氏菌属(Erwinia)。更优选的微生物实例包括弗氏柠檬酸杆菌、中间柠檬酸杆菌(Citrobacter intermedius)、中间埃希氏菌、大肠杆菌、马棒杆菌(Corynebacteriumequi)、海生红球菌(Rohodococcus marinonascens)、沙门氏菌属的菌种、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)以及肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。
更具体地说，可举例说明下列菌株作为优选的微生物，其菌株名称及保藏单位如下所示(1)弗氏柠檬酸杆菌IFO 13546(i)保藏号IFO 13546(iii)保藏单位(地址)独立行政法人制品评价技术机构生物技术本部生物遗传资源部门(2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba 292-0818，日本)。
(2)中间埃希氏菌AJ 2607(i)保藏号FERM BP-10401(由FERM P-20215转来)
(ii)原始保藏日期2004年9月8日；(iii)保藏单位(地址)独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本)。
(3)大肠杆菌ATCC 13070(i)保藏号ATCC 13070(iii)保藏单位(地址)美国典型培养物保藏中心，邮政信箱1549，Manassas，VA 20110，美国(4)大肠杆菌ATCC 12814(i)保藏号ATCC 12814(iii)保藏单位(地址)美国典型培养物保藏中心，邮政信箱1549，Manassas，VA 20110，美国(5)海生红球菌AJ110354(i)保藏号FERM BP-10400(由FERM P-20213转来)(ii)原始保藏日期2004年9月8日；(iii)保藏单位(地址)独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本)。
从上述微生物等可分离和纯化本发明所用的酶。术语“在微生物和/或酶的存在下”是指使微生物和/或酶存在于将由通式(I)表示的肟基酸转变成由通式(III)表示的氨基酸衍生物的反应系统中的操作。只要具有本发明要求的活性，并不具体限制“微生物和/或酶”的来源、制备方法等等。作为微生物，不仅能使用催化本发明反应的上述微生物，而且能使用以编码催化反应的酶的基因(包括重组基因)转化的宿主微生物、或由所述宿主微生物产生的酶。也就是说，只要将由通式(I)表示的肟基酸转变成由通式(III)表示的氨基酸衍生物，微生物和/或酶能以任何形式存在于反应系统中。可使用微生物或酶，或它们两者。
本发明的生产方法中使用的“微生物和/或酶”可具有下列形式。具体形式的实例可包括微生物的培养产物、从培养产物分离的微生物细胞以及通过处理微生物细胞而得到的物质。微生物的培养产物是通过培养微生物而得到的物质，具体地可以是含有微生物细胞、用于培养微生物的培养液以及微生物产生的物质的混合物。可洗涤微生物细胞并用作洗涤的微生物细胞。通过处理微生物细胞而得到的物质可包括通过破碎、溶解或冻干微生物细胞而得到的物质，以及在处理微生物细胞后回收的粗酶。通过处理微生物细胞而得到的物质还包括通过进一步纯化粗酶而得到的纯化酶。纯化酶可包括通过任何多种纯化方法而得到的部分纯化的酶，和固定化酶(即通过共价连接、吸附、包合(inclusion)等而固定的酶)。所用的一些微生物在培养期间被部分溶解。在这种情况下，培养液的上清也可被用作上述的“微生物和/或酶”。
本发明的生产方法中使用的“微生物和/或酶”也包括遗传工程构建的菌株，这些菌株表达用于将由通式(I)表示的肟基酸转变成由通式(III)表示的氨基酸衍生物的酶；通过处理所述的微生物细胞而得到的物质，所述处理包括丙酮处理和冻干法；以及固定化微生物细胞或通过共价连接、吸附、包合等固定的固定化微生物处理的物质。
本发明的生产方法包括以通式(I)的肟基酸作为起始原料的反应。通式(I)中的R1的具体实例可包括下列基团。
作为R1的C2至C6烷基的具体实例包括乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基以及异己基。
作为R1的C6至C14芳基的具体实例包括苯基、甲苯基、二甲苯基、联苯基、萘基、蒽基以及菲基，并优选苯基和萘基。
作为R1的C6至C10环烷基的具体实例包括环己基、环庚基(cycloheptanyl)、环辛基(cyclooctanyl)、环壬基(cyclononanyl)以及环癸基(cyclodecanyl)。
作为R1的C7至C19芳烷基的具体实例包括苯烷基(例如苯甲基、二苯甲基、苯乙基和三苯甲基)、肉桂基、苯乙烯基以及萘烷基，并且优选苯烷基和萘烷基。
作为R1的C2至C11烷氧基烷基的具体实例包括用选自下组的基团取代的C1至C10烷基甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基、苯氧基、庚氧基(heptoxy)、辛氧基(octoxy)、壬氧基(nonanoxy)、癸氧基(decanoxy)以及十一烷氧基(undecoxy)。
作为R1在上述基团碳架中含有杂原子的基团的一个实施方案可为含有杂环的烃基。“含有杂环的烃基”是在环状化合物的环上掺入杂原子的环状烃基。含有杂环的烃基可以是杂芳基。含有杂环的烃基并不限于有或没有芳香性。含有杂环的烃基可以是单环的或多环的。含有杂环的烃基的具体实例包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基(piperidyl)、哌啶子基(piperidino)、吗啉代基、吲哚基以及用上述的任何杂环基取代的烷基，其优选的实例包括吡啶基和吲哚基。
可用选自下列的至少一种取代基进一步取代上述的R1卤原子、羟基、C3或更短的烷基、C3或更短的烷氧基以及氨基。
R2表示C1至C3的烷基或氢原子。C1至C3的烷基实例包括乙基、甲基、正丙基以及异丙基。
R4的烷基、芳基、环烷基、芳烷基、烷氧基烷基、在上述基团的碳架中含有杂原子的基团以及上述基团、以及上述基团可任选具有的取代基，都与上述R1的情况相同。
通过各种生成肟的反应(即，将对应于肟基的CO基团转变成CNOH基团的反应)可获得由通式(I)表示的化合物。具体地说，通过在国际公开WO2003/056026单行本、WO2004/018672单行本以及WO2003/059865单行本中描述的方法，可获得化合物(I)。
在中性或碱性的条件下，通过将由下列通式(VIII)表示的胺化合物或其盐与相应的酮基化合物反应，来进行用于生产肟(用于生产肟基的转变)的方法，其中R5表示氢原子、烷基、芳基或芳烷基H2N-OR5...(VIII)当R5是烷基、芳基或芳烷基时，优选R5是C1至C3的烷基、芳基或芳烷基。就结晶而言，优选R5选自甲基和苯甲基。
使用通式(VIII)的羟胺(其中R5是氢原子)很容易实施生产肟的方法。举例来说，在中性或弱碱性条件下，通过将盐酸羟胺加到含有酮基化合物的溶液中，然后在室温至约10℃的条件下搅拌溶液0.5至60小时，即可生成肟。优选在pH 6至10，更优选在pH 7至9来进行用于生产肟的转化反应。不必具体限定将酮基化合物转变成相应肟的反应条件，并且本领域技术人员通过简单初试可测定产生肟的转化的反应条件。
在本发明的生产方法中，将由通式(I)表示的化合物转变成由通式(III)表示的化合物产物。通式(III)中的R1、n及其它定义与上述通式(I)中的相同。
当通式(I)中n是0时，可得到作为通式(III)中的化合物的α-氨基酸衍生物。当n是1时，得到β-氨基酸衍生物。例如，通过选择通式(I)中的L-或D-化合物，可生成通式(III)中的L-或D-化合物。当得到作为L和D化合物混合物的化合物(III)时，可从混合物分离并纯化其中的任意一种。
根据待用的微生物、酶和起始原料的具体种类，可适当调节使用微生物和/或酶的反应系统的条件。所用的微生物量和/或酶量可以是显示目的效果的量(有效量)。本领域技术人员在简单的初步实验中，可容易地确定有效量。例如，当使用酶时，其优选量可以是约0.01至100单位(U)。当使用洗涤的微生物时，其优选量可以是约0.1至500g/L。通常在所用的酶具有活性的温度下进行反应，温度优选在10至50℃、更优选在20至40℃、以及更加优选在25至37℃的范围内。通常将酶反应溶液的pH值调节到2至12、优选7至11、更优选8至9的范围内。
在本发明的生产方法的优选实施方案中，可加入选自NADH、NADPH、吡哆醛-5′-磷酸(在下文可称为PLP)以及MgCl2的一种或多种化合物。通过加入这些添加剂，可提高由通式(III)表示的氨基酸衍生物的生产量。
根据微生物种类等等，适当选择四种添加剂的组合。其优选的组合是含有至少三种添加剂的组合NADH、NADPH以及PLP，并且更优选含有全部四种添加剂的组合。如下所示反应液中各种添加剂的优选量NADH的量优选是0.01至200mM，更优选是0.1至50mM；NADPH的量优选是0.01至200mM，更优选是0.1至50mM；MgCl2的量优选是0.01至10mM，更优选是0.1至1mM；以及PLP的量优选是0.01至10mM，更优选是0.1至1mM。
本发明的生产方法优选用于生产R1是芳环或含有杂环基团的氨基酸衍生物，并且更优选用于生产Monatin、色氨酸、苯丙氨酸等。为了生产Monatin，将IHOG-肟用作由通式(I)表示的化合物。为了生产色氨酸，将IPA-肟(吲哚-3-丙酮酸-肟)用作由通式(I)表示的化合物。为了生产苯丙氨酸，将BAE-肟(3-肟基-3-苯基-丙酸甲酯)用作由通式(I)表示的化合物。BAE是苯甲酰乙酸乙酯(benzoyl acetate ethyl ester)的缩写。
实施例参考下列实施例将详细描述本发明，但本发明并不限于这些实施例。
在实施例中，使用由GL Sciences，Inc.制造的Inertsil ODS-80A(5μm，6×150mm)，通过高效液相色谱法进行Monatin的定量。分析条件如下所示。
流动相12％(v/v)乙腈/0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速1.5ml/min；
柱温30℃；以及检测UV 210nm。
在上述的分析条件下，对(2S，4S)-Monatin和(2R，4R)-Monatin进行分级并在保留时间12.1分钟时定量，而(2S，4R)-Monatin和(2R，4S)-Monatin在保留时间9.7分钟时定量。
如果需要，也可用光学拆析柱(optical resolution column)CROWNPAKCR(+)(4.6×150mm)(由Daicel Chemical Industries，Ltd.制造)通过高效液相色谱法进行分析。分析条件如下所示。
流动相高氯酸水溶液(pH1.5)/10％(v/v)甲醇；流速0.5ml/min；柱温30℃；以及检测UV 210nm。
在上述的分析条件下，可对Monatin光学异构体进行分级，并分别在保留时间42、57、64和125分钟时按(2R，4S)、(2R，4R)、(2S，4R)以及(2S，4S)的顺序进行定量。
生产实施例1IHOG-肟二铵盐(4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚胺戊二酸二铵盐)的生产加入73.8g(352mmol)吲哚-3-丙酮酸并溶于917g的1.6wt％氢氧化钠水溶液。调节反应溶液温度至35℃。当用30％氢氧化钠水溶液将溶液pH保持在11.1时，经过2小时逐滴加入310.2g(1761mmol)的50％丙酮酸水溶液。另外将反应混合物反应4.5小时来获得含有4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-酮戊二酸的反应溶液。当用30％氢氧化钠水溶液将反应溶液的pH保持在7时，向其中加入367.2g(2114mmol)的40％盐酸羟胺水溶液，并将混合物在5℃搅拌17.5小时。用浓盐酸将反应溶液的pH值调节至2，然后用乙酸乙酯提取其有机物质。用饱和的盐水洗涤有机层，然后浓缩得到残余物(residue)。将残余物在60ml 28％氨水和1350ml 2-丙醇中进行重结晶，来获得43.4g 4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚胺戊二酸二铵盐(142mmol；相对于吲哚-3-丙酮酸，产率为40％)作为晶体。
生产实施例2IHOG-肟二钾盐(4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚胺戊二酸二钾盐)的生产将生产实施例1所生产的10g 4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚胺戊二酸二铵盐溶于20ml水，然后流过100ml阳离子交换树脂DIAION PK228(钾型，由Mitsubishi Chemical公司制造)充填的柱子，来将化合物转变成期望的离子。将洗脱液浓缩成20g浓缩物，以获得4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚胺戊二酸二钾盐的含水溶液。
生产实施例3吲哚丙酮酸肟的生产将4.06g(0.02mol)吲哚丙酮酸和1.32g(0.02mol)的85％氢氧化钾溶于50ml水，并在其中加入1.53g(0.022mol)盐酸羟胺。另外在其中加入1.45g(0.022mol)的85％氢氧化钾，并在室温下过夜搅拌混合物。用盐酸将反应溶液调节至pH2，并通过过滤收集析出的晶体。干燥所得的湿晶体来获得3.34g吲哚丙酮酸肟。相对于吲哚丙酮酸，产品的产率是76.5％，并获得ESI-MS219.1[M+H]+信号。
生产实施例4苯甲酰乙酸乙酯肟的生产将3.84(0.02mol)苯甲酰乙酸乙酯溶于50ml的MeOH，并在其中加入1.53g(0.022mol)盐酸羟胺。在其中加入2.23g(0.022mol)三乙胺，并在室温下过夜搅拌混合物。在减压条件下浓缩反应溶液。然后将水加入残余物，并通过过滤收集析出的晶体。由此获得3.27g干燥的苯甲酰乙酸乙酯肟。相对于苯甲酰乙酸乙酯，产率是78.9％，并获得ESI-MS208.2[M+H]+信号。
(分析条件)防护柱(Guard column)Shodex IC YK-G(Showa Denko K.K.)柱Shodex IC YK-421(Showa Denko K.K.)检测电导检测器洗脱液4mM磷酸+5mM 18-Crown-6流速0.6ml/min；分析温度40℃实施例1筛选还原IHOG-肟的微生物筛选具有还原4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-肟基戊二酸(IHOG-肟)活性的微生物菌株，即可从底物IHOG-肟生产Monatin的菌株。
将样品微生物(细菌或酵母)接种到肉汤平板(bouillon plate)(EikenChemical Co.Ltd.制造)，并于30℃培养24小时。将所得的培养物接种到平板上，该平板含有0.5g/dl甘油、0.5g/dl富马酸、0.3g/dl酵母提取物、0.2g/dl蛋白胨、0.5g/dl硫酸铵、0.3g/dl K2HPO4、0.1g/dl KH2PO4、0.05g/dlMgSO4·7H2O、0.2g/dl IHOG-肟二铵盐以及2g/dl琼脂粉(pH6.5)。然后将微生物在30℃培养24小时。将所得微生物细胞接种到下列两种反应溶液中的每一种，使所得的湿微生物细胞重量为约1％(w/v)，然后将反应混合物在30℃反应24小时。
反应溶液1100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM IHOG-肟二铵盐、1mMMgCl2、1mM吡哆醛-5’-磷酸(PLP)、20mM NADH、20mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
然后通过TLC定性分析由此生产的Monatin。将1μl反应溶液点样到TLC硅胶板60F254(由Merck制造)上，然后将这样得到的平板浸入由正丁醇∶乙酸∶水(＝4∶1∶2)组成的溶液中并用茚三酮(ninhydrin)显色。可在Rf约0.39的位置将Monatin检测为粉色斑点。
为了定量分析产生的Monatin，用HPLC分析已经确认产生了Monatin的反应溶液。结果，确定了用表1所示的菌株产生了Monatin。也就是说，通过微生物转化，从IHOG-肟生产了Monatin。
表1从IHOG-肟形成的Monatin
实施例2从底物IHOG-肟二钾盐生产Monatin将如表2所示的菌株用于转化底物IHOG-肟二钾盐。以与实施例1相同的方式，实施制备微生物细胞的方法。使用如下所示的反应溶液2和3作为反应溶液。在30℃反应24小时后，通过HPLC定量测定Monatin的生产量。结果，如表2所示，证实也可从IHOG-肟二钾盐生产Monatin。由反应溶液3和反应溶液4之间的比较，发现通过将NADH、NADPH、MgCl2、吡哆醛-5′-磷酸(PLP)等加入反应溶液，可提高Monatin的生产量。
反应溶液2100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM IHOG-肟二钾盐、1mM MgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
反应溶液3100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM IHOG-肟二钾盐以及1％(v/v)甲苯。
表2从底物IHOG-肟二钾盐生产的Monatin的量(mM)。
实施例3添加PLP、MgCl2、NAD(P)H的效果检查加入PLP、MgCl2和NAD(P)H对弗氏柠檬酸杆菌IFO13546和中间埃希氏菌AJ2607的IHOG-肟的还原反应的效果。
制备具有如表3所示组分的反应溶液(反应溶液4至9)，并以与实施例1相同的方法将其用于实施IHOG-肟的还原反应，并定量由此生产的Monatin。
结果(表4)表明通过添加PLP、MgCl2或NAD(P)H，可提高由各个菌株生产的Monatin量。
用光学拆析柱CROWNPAK CR(+)鉴定由反应溶液4生产的Monatin。结果，显示产物是(2S，4S)-Monatin。
表3反应溶液组分(单位mM)
表4Monatin的生产量(mM)
实施例4从IPA-肟(吲哚-3-丙酮酸-肟)生产色氨酸(Trp)将弗氏柠檬酸杆菌IFO 13546和中间埃希氏菌AJ 2607分别接种到肉汤平板(由Eiken Chemical Co.Ltd.制造)，并在30℃培养24小时。将所得的培养物接种到平板上，该平板含有0.5g/dl甘油、0.5g/dl富马酸、0.3g/dl酵母提取物、0.2g/dl蛋白胨、0.5g/dl硫酸铵、0.3g/dl K2HPO4、0.1g/dl KH2PO4、0.05g/dl MgSO4·7H2O、0.2g/dl IHOG-肟二铵盐以及2g/dl琼脂粉(pH6.5)。然后将微生物在30℃培养24小时。将所得微生物细胞接种到下列反应溶液10中，使湿微生物细胞重量为约1％(w/v)，然后将反应混合物在30℃反应24小时。
反应溶液10100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM IPA-肟、1mMMgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
通过TLC对所产生的色氨酸进行定性分析。将1μl反应溶液点样到TLC板硅胶60F254(由Merck制造)上，然后将这样得到的平板浸入由正丁醇∶乙酸∶水(＝4∶1∶2)组成的溶液中并用茚三酮显色。在Rf约0.52的位置将色氨酸检测为紫色斑点。
为了定量分析产生的色氨酸，用HPLC分析已经确认产生了色氨酸的反应溶液。结果，确定产生了色氨酸。也就是说，通过微生物转化，从IHOG-肟生成了色氨酸。
(分析条件)柱Inertsil ODS-80A(GL Sciences，Inc.)检测UV210nm洗脱液12％(v/v)乙腈/0.05％三氟乙酸水溶液流速1.5ml/min分析温度30℃表5Trp的生产量
实施例5从BAE-肟生产β-苯基-β-丙氨酸(β-Phe)将弗氏柠檬酸杆菌IFO 13546和中间埃希氏菌AJ 2607作为测试菌株，并以与实施例4相同的方法将每种得到的微生物细胞接种到下列反应溶液11中，使得湿微生物细胞重量为约1％(w/v)，然后将反应混合物在30℃反应24小时。
反应溶液11110mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM BAE-肟、1mMMgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
通过TLC对所生成的产物进行定性分析。将1μl反应溶液点样到TLC板硅胶60F254(由Merck制造)上，然后将这样得到的平板浸入由正丁醇∶乙酸∶水(＝4∶1∶2)组成的溶液中并用茚三酮显色。在Rf约0.72的位置将β-苯基-β-丙氨酸乙酯检测为黄斑，并在Rf约0.51的位置将β-苯基-β-丙氨酸检测为褐斑。结果，在与β-苯基-β-丙氨酸相同的Rf附近检测到了斑点。
然后通过HPLC分析已经确定产生了β-苯基-β-丙氨酸的反应溶液。结果，确定产生了β-苯基-β-丙氨酸。也就是说，通过微生物转化，从BAE-肟产生了β-苯基-β-丙氨酸。
(分析条件)柱Inertsil ODS-80A(GL Sciences，Inc.)检测UV210nm洗脱液12％(v/v)乙腈/0.05％三氟乙酸水溶液流速1.5ml/min分析温度30℃表6β-苯基-β-丙氨酸的生成量
实施例6从15N标记的IPA-肟(15N同位素标记的吲哚-3-丙酮酸-肟)生产色氨酸(Trp)以与实施例4相同的方式培养中间埃希氏菌AJ 2607，来获得湿微生物细胞。将所得微生物细胞接种到下列反应溶液12中，使湿微生物细胞重量为约1％(w/v)，然后将反应混合物在30℃反应24小时。
反应溶液12100mM甘氨酸-NaOH(pH9.0)、50mM15N-标记的IPA-肟、1mM MgCl2、1mM吡哆醛-5′-磷酸(PLP)、25mM NADH、25mM NADPH以及1％(v/v)甲苯。
根据下列方法，制备15N-标记的IPA-肟。在25℃在氩气流中将1.413g(6.95mmol)吲哚丙酮酸和0.913ml 8N NaOH加入并溶于60ml水中。将0.5g(7.09mmol)15NH2OH盐酸盐和0.913ml 8N NaOH加入溶液，并在25℃搅拌1小时。用4.9ml 1N盐酸调节pH至3，并在25℃过夜搅拌。通过过滤来分离析出的晶体，并在减压条件下于40℃干燥2.07g湿晶体，从而获得0.81g(3.58mmol)15N-标记的IPA-肟(面积纯度(area purity)97.5％)。
作为通过LC-MS分析反应溶液的结果，在15N-标记的部分(section)中检测到+206(相当于15N)的峰，这表明肟已经被酶促还原。
工业实用性本发明可用于生产各种氨基酸衍生物。
权利要求
1.一种生产氨基酸衍生物的方法，所述的方法包括如下步骤在微生物和/或酶的存在下，从由下列通式(I)表示的肟基酸 其中R1表示选自下列取代基任选取代的C2至C6的烷基、任选取代的C6至C14的芳基、任选取代的C6至C10的环烷基、任选取代的C7至C19的芳烷基、任选取代的C2至C10的烷氧基烷基、任选取代的基团，其与上述任何一个基团相同，除了在其碳架中含有杂原子，和下列通式(II)表示取代基R3 其中R4表示选自下列的取代基任选取代的C2至C6的烷基、任选取代的C6至C14的芳基、任选取代的C6至C10的环烷基、任选取代的C7至C19的芳烷基、任选取代的C2至C10的烷氧基烷基以及任选取代的基团，其与上述任何一个基团相同，除了在其碳架中含有杂原子；X1和X2独立地表示羟基或羰基，R2表示C1至C3的烷基或氢原子；以及n是0或1，反应生成由下列通式(III)表示的氨基酸衍生物 其中R1和n具有与通式(I)中R1和n相同的含义，其中微生物和/或酶能催化该反应。
2.根据权利要求
1中所述的方法，其中n是0，并且由此生产的氨基酸衍生物是α-氨基酸衍生物。
3.根据权利要求
1中所述的方法，其中由此生产的氨基酸衍生物是α-L-氨基酸。
4.根据权利要求
1中所述的方法，其中由此生产的氨基酸衍生物是α-D-氨基酸。
5.根据权利要求
1中所述的方法，其中n是1，并且由此生产的氨基酸衍生物是β-氨基酸衍生物。
6.根据权利要求
1中所述的方法，其中芳基是任选取代的苯基或萘基。
7.根据权利要求
1中所述的方法，其中芳烷基是任选取代的苯烷基或萘烷基。
8.根据权利要求
1中所述方法，其中在碳架中含有杂原子的基团是任选取代的吡啶基或吲哚基。
9.一种用于生产Monatin的方法，步骤包括在微生物和/或酶的存在下，从由通式(IV)表示的IHOG-肟 反应生成由下列通式(V)表示的Monatin 其中微生物和/或酶能催化该反应。
10.一种用于生产β-苯基-β-丙氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下从由通式(VI)表示的BAE-肟 反应生成β-苯丙氨酸，其中微生物和/或酶能催化上述反应。
11.一种用于生产色氨酸的方法，包括在微生物和/或酶的存在下从由通式(VII)表示的吲哚-3-丙酮酸-肟 反应生成色氨酸，其中微生物和/或酶能催化该反应。
12.根据权利要求
1、9、10以及11中任意一项所述的方法，其中微生物是属于选自下组的任何属的一种或多种微生物柠檬酸杆菌属、埃希氏菌属以及红球菌属。
13.根据1、9、10以及11中任意一项所述的方法，其中微生物选自下组弗氏柠檬酸杆菌、中间埃希氏菌、大肠杆菌以及海生红球菌。
14.根据权利要求
1、9、10以及11中任意一项所述的方法，其中将选自NADH、NADPH、吡哆醛-5′-磷酸以及MgCl2中的一种或多种化合物加入由通式(I)表示的化合物产生由通式(III)表示的化合物的反应溶液。
专利摘要
本发明提供工业上生产氨基酸衍生物的有利方法。提供用于生产氨基酸衍生物的方法，包括在微生物和/或酶的存在下从由上列通式(I)表示的肟基酸，其中R
文档编号C12P13/22GKCN101035903SQ200580034027
公开日2007年9月12日 申请日期2005年9月29日
发明者杉山雅一, 渡部乙比古, 竹本正, 森健一 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan