专利名称：一种新的氧肟酸类嗜铁素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的嗜铁素，具体涉及一种氧肟酸类嗜铁素的制备方法及其在黄瓜枯萎病中的应用。
背景技术：
利用有益菌进行病虫害防治，已是目前研究的一个热点问题，至今已有多种菌株成功地被开发成产品并得到推广。它们在病虫害防治中的重要地位来自他们固有的一些属性。假单胞杆菌(Peudomonas spp.)是一类得到广泛研究的生防细菌，这类细菌能产生特殊物质嗜铁素，而分泌嗜铁素是其控制真菌病害的一种主要机制，因而成为科研工作者研究的热点对象。嗜铁素是一类小分子量(500 IOOODa)能特异地螯合!^3+的螯合因子，绝大多数细菌和真菌都能通过非核糖途径合成分泌一种或几种嗜铁素，它的产生是地球上微生物适应地壳高氧低铁环境的结果。嗜铁素按照它的螯合基团的化学特性可分为三大类一类为氧肟酸类(hydroxamate)嗜铁素、一类为儿茶酚类(catechol)嗜铁素、还有一类为混合型(mixed ligand)嗜铁素，有的报道称其为α-羟基羧酸(α-hydroxycarboxylic)(也称作柠檬酸型)。关于嗜铁素的研究，国内外目前仍处于基础性研究阶段。其提纯和结构分析方面的研究起步较早，而国内却鲜见报道，迄今为止，人们已经发现500多种化学结构不同的嗜铁素。目前，国内外对嗜铁素的研究主要集中在其所参与的生防活动。例如，许煜泉 (1999)对生防菌Peudomonas sp. JKD-2在低铁条件下抑制稻瘟菌的生长的研究验证了嗜铁素铁竞争这一抗病性功能。陈双雅和陈旋Q006)研究中提到嗜铁素的抗生作用， 即嗜铁素直接通过抑制病原菌来起到控制病害目的。Maria Guineth (2000)也提到嗜铁素的抗生作用。冉隆贤000 通过对嗜铁素缺失突变体控制桉树灰霉病的研究提到了嗜铁素对病害的诱导抗性作用。Van peer R(1992), Leeman M(1996)和 V. Ramamoorthy QOOO) 也提到嗜铁素的诱导作用。此外，嗜铁素近年来还探索应用于医药等领域[18]。总之，嗜铁素的功能是多样的，它不但是依赖受体的高亲和性的铁转运系统，还是生长因子或萌发因子， 也可以是抗生素或毒力因子。由此可见，嗜铁素是一种很有开发和利用价值的新型生物活性物质。
发明内容
本发明的目的是从恶臭假单胞菌HZ-2菌株(!Peudomonas putida)(菌株HZ-2，是本发明人于2008年3月分离自浙江省杭州市多年种植蔬菜的杭州下沙乔司监狱旁的大棚， 经鉴定属于恶臭假单胞菌)中分离出新的具有实用价值嗜铁素和该化合物的制备方法，及其在防治植物病害，特别是防治黄瓜枯萎病中的应用。恶臭假单胞菌的从不同地地域采的菌株也可以得到此类新物质。一方面，本发明提供一种异羟肟酸类型嗜铁素，具有如下结构
权利要求
1.一种异羟肟酸类型嗜铁素化合物的制备方法，包括(1)、发酵液体的准备菌种恶臭假单胞菌在固体KMB培养基上活化Mh后，挑取单菌落接入5mL液体KMB培养基中，置于摇床中，，150r/分钟条件下培养Mh，然后接种到固体种子培养基KMB中，在下培养Mh，得到一级种子；然后将培养好的一级种子挑取一环，在MKB培养基中发酵，其中1000毫升的KMB固体或液体培养基的成分包括酪蛋白氨基酸 5g，MgSO4 · 7H20 2. 5g，K2HPO4 · 3H20 2. 5g，Fe3+ 的含量为 0. lmg/L ；O)、收集步骤(1)中发酵液IOOOmL旋转蒸发(43°C )浓缩成稍粘稠液体，离心去除白色不溶物，上清液用HCl将pH调至4备用；(3)、把步骤( 中得到的上清液样品上到大孔吸附树脂柱后液体浓缩后用CAS检测液检查，不显示活性，再用不同极性的洗脱液依次洗脱，对洗脱液进行减压浓缩后，测定活性， 其中不同极性的依次洗脱的洗脱液为离子水、0.2%盐酸溶液、10%甲醇-水溶液、30%甲醇-水溶液、50%甲醇-水溶液、80%甲醇-水溶液、100%甲醇、100%丙酮溶液。
2.根据权利要求1的方法，其中获得的异羟肟酸类型嗜铁素化合物的结构如下
3.根据权利要求1的方法，其中将步骤(3)中洗脱的样品再用HPLC分离，分离的条件为材料ODS-BP ；流速1ml/分钟；流动相30%甲醇-水溶液洗脱30分钟。
4.根据权利要求3的方法，其中HPLC分离的条件为材料为ODS-BP；流速为Iml/分钟；流动相为5-60%甲醇-水进行梯度洗脱30分钟。
5.根据权利要求1-4之一所述的方法，其中在步骤(1)之后还对发酵液顺次进行如下检测=(I)CAS测试液检测，呈明显橙红色，则证明发酵液中富含有嗜铁素；(2)进行Arnow Assay试验，如果分析结果溶液显黄色则认为初步确定发酵液可能含氧肟酸类型嗜铁素。
全文摘要
本发明涉及一种新的嗜铁素的制备方法，该方法包括发酵液体的准备，有机溶剂提取、萃取、经常规柱色谱和高效液相色谱分离得到，它对农业病害具有一定的防治作用，因此可以用于制备新型生物农药。
文档编号C12R1/40GK102181499SQ201110052619
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月3日 优先权日2011年3月3日
发明者吴吉安, 施跃峰, 梁建根, 王连平, 竺利红, 郝中娜, 陈建忠, 陈识峰, 陶荣祥 申请人:浙江省农业科学院