一种含氨基酸片段的膦酸酯衍生物的制备方法及抗肿瘤应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种抗肿瘤药物，具体为一种含氨基酸片段的膦酸酯衍生物的制备方 法及抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是当今危害人类健康和生命最严重的疾病之一，因此寻找结构新颖、新作用 机制抗肿瘤药物有重大意义。膦酸酯类化合物作为有机磷衍生物，近年来研究极为广泛，在 药物设计合成中扮演着重要角色，研究表明该类衍生物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种重 要的生理活性，广泛应用于医药和农药领域。
[0003] 前期我们设计合成了不同系列膦酸酯衍生物，生物活性测试发现不同类化合物有 潜在的抗肿瘤活性。分析几类化合物的构效关系发现:共有的膦酸酯结构可能是其抗肿瘤 药效团。因此，以膦酸酯为骨架的结构修饰、优化及其抗肿瘤作用深入研究十分有必要。
[0004] 众所周知，氨基酸是重要的生理活性物质，是生物体内合成肽、蛋白质、激素、酶及 抗体的原料，参与多种生物化学过程活动。其中类肽类氨基酸衍生物因分子量小，多存在内 源性靶点，与细胞及核酸具有很好的亲和性，极易穿透肿瘤细胞，提高免疫应答，抑制肿瘤 血管形成、肿瘤生长和转移等特点，现已成为抗肿瘤药物研究的新热点。将氨基酸片段引入 到药物分子中，更有利于药物分子与肿瘤细胞组织结合，而发挥抗肿瘤作用。专家认为这是 抗肿瘤药物一个很有希望的发展方向。
[0005] 因此，将膦酸酯活性片段与氨基酸片段结合，采用基于片段的药物发现方法，设计 一类全新结构的含氨基酸片段的膦酸酯衍生物进行抗肿瘤活性研究，获取有抗肿瘤先导化 合物，具有很好的前景。
【发明内容】
[0006] 本发明在前期研究工作的基础上，采用基于片段的药物发现方法，将膦酸酯活性 片段与与氨基酸片段结合，制备一类含氨基酸片段的膦酸酯衍生物，获得有前景的抗肿瘤 先导物。
[0007] 为达到上述目的，采用的技术方案为：目标物含氨基酸片段膦酸酯衍生物的结构
，1?为1-5个碳的烷基或1-5原子的烷氧基；Ri为Η或卤素或硝 基1-3个碳的烷基或1-3个原子的烷氧基；此为Η或1-5碳的烷基或苯甲基或吲哚-2-甲基 或羟甲基或巯甲基或对羟基苯甲基或氨基甲酰甲基或氨基甲酰乙基或CH2CH2CH2SHOCH (CH3);构型:与此直接相连的碳原子为R或S构型。其合成反应式为：
其制备的具体步骤为： 1) 制备中间体1:将氨基酸溶于四氢呋喃中，冰水浴，加入1- 3倍氨基酸量的碳酸氢钠 或三乙胺，然后加入1-2倍量的（Boc)20,冰水浴反应30-60 min，再室温反应15-20 h，反应 液用乙酸乙酯萃取，弃去上层，用酸调节pH，再用二氯甲烷萃取，合并下层有机相，用无水硫 酸钠干燥，浓缩溶剂，即得； 2) 制备中间体2 :将亚磷酸酯与芳香醛（1:1.5摩尔比投料)加入三颈瓶中，然后加入1-2倍量的三乙胺，40-80°C反应1.5 h，再在室温反应24 h，除去三乙胺，重结晶，即得； 3) 制备中间体3:取中间体1和中间体2(1:1摩尔比投料），加入反应瓶中，冰盐浴加入1 倍量的缩合剂(DCC/DMAP或EDCI/DMAP或HBTU/DIPEA，优选的EDCI/DMAP)，以二氯甲烷为溶 剂，溶解缩合剂，室温反应10-12 h，除去不溶物，浓缩溶剂，柱层析法分离纯化，即得； 4) 制备化合物（I):取反应瓶，加入乙酸乙酯作为溶剂，依次加入1倍量的甲醇和1倍量 的乙酰氯，反应3-5 h，然后将0.5-1倍量的中间体3溶于乙酸乙酯中，加入反应瓶，冰水浴下 反应8-10 h，减压浓缩，得粘稠液体，柱层析法分离纯化，真空干燥，即得目标物(I)。
[0008] 这类含氨基酸片段的膦酸酯衍生物是采用基于片段的药物发现方法设计而成，是 对前期研究的膦酸酯化合物进行优化。该类衍生物对肿瘤细胞有不同增殖抑制作用。在具 有相同氨基酸结构的目标物(I)中，L构型较D构型氨基酸化合物有明显的抗肿瘤活性。部分 化合物对肿瘤细胞A-549、SGC-7901及EC-109有显著抗增殖作用，与对照药顺铂接近，可作 为抗肿瘤先导化合物研究。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本 领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
[0010] 目标物膦酸酯衍生物的结构通式为
，1?为1-5个碳的烷基或 1-5原子的烷氧基；心为!1或卤素或硝基1-3个碳的烷基或1-3个原子的烷氧基；此为Η或 1-5碳的烷基或苯甲基或吲哚-2-甲基或羟甲基或巯甲基或对羟基苯甲基或氨基甲酰甲基 或氨基甲酰乙基或〇12〇1 2〇12或!10〇1(〇13);构型：与1?2直接相连的碳原子为1?或5构型。其合成 反应式为：
【具体实施方式】
[0011] 实施例1: 二乙基-α-(2-氟苯基)-α- (L-2-氨基苯丙酰氧基）甲基膦酸酯（I a) 的制备。
[0012] 将10 m mol L-苯丙氨酸溶于50 mL四氢咲喃，冰水浴至0°C左右，加入碳酸氢钠20 m mol。然后将12 m mol (Boc)2〇缓慢滴入至上述溶液。〇°C左右，反应40 min，再室温反应 15-20 h，反应完毕。反应液用乙酸乙酯萃取2 -3次，弃去上层，用酸调节pH，再用二氯甲烷 萃取2-3次。合并下层有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩溶剂，得中间体1; 将2 mmol亚磷酸二乙酯与3 mmol邻氟苯甲醛加入50ml三颈瓶中，充分混合，然后将1.1 mmol三乙胺逐滴加入混合液中。10 min后，升高温度，在60 °C搅拌反应3 h。再在室温搅拌 反应24 h。反应完毕，减压除去三乙胺，用乙醚:石油醚=1:1重结晶，得中间体2。
[0013] 取中间体1(4 mmoL)和中间体2(4 mmol)，加入到50 mL三口瓶中，再加入DMAP(4.1 mmol)，以无水二氯甲烷(15 mL)为溶剂，搅拌溶解，冰盐浴(-5~0 °C)下，用恒压滴液漏斗缓 慢滴加 EDCI(4.1 mmol，无水二氯甲烷15 mL溶解），30 min滴加完毕，室温反应10 h，过滤， 除去不溶物，浓缩溶剂，柱层析法(乙酸乙酯:石油醚=1:1)分离纯化，得中间体3。
[0014] 在反应瓶中加入无水乙酸乙酯(4 mL)，冰盐浴(-5~0 °C)下充分搅拌，依次加入甲 醇(0.8 mmoL)和乙酰氯(0.8 mmoL)，维持该温度，反应约3 h。然后将中间体3(0.5 mmoL，用 5 mL无水乙酸乙酯溶解），缓慢加入反应体系中，TLC跟踪，冰水浴下搅拌反应8 h，减压浓 缩，得粘稠液体，柱层析法（氯仿：甲醇=8:1)分离纯化，真空干燥，得到化合物（la)，产率 50.5%〇
[0015]
(c= 0.01g/mL， methanol). 4 NMR (400 MHz, CDCh)， δ: 1.05 ~1.14 (m， 6H， CH3), 1.84 (s， 2H， NH2)， 2.80~2.94 (m， 2H， OfeAr), 3.84~4.01 (m， 4H， 0CH2)， 4.58 (s， 1H， NCH)， 6.34 (dd， 1H， J=24 Hz PCH)， 6.86~7.42 (m， 9H， Ar-H); 13C 匪R (100 MHz, CDC13)， δ: 16.1， 16.2， 37.6， 54.3， 63.2， 63.3， 65.0, 115.1, 120.6, 124.3, 128.3, 129.0, 135.5, 135.8, 158.6, 170.1. IR ( KBr )v: 3303，2915，2854，1669，1465，1201, 1030 cm-1。
[0016] 实施例2: 二乙基-α-(2_氟苯基)-α- (D-2-氨基苯丙酰氧基）甲基膦酸酯（I b) 的制备。
[0017] 将10 m mol D-苯丙氨酸溶于50 mL四氢呋喃，冰水浴至0°C左右，加入三乙胺20 m mol。然后将15 m mol (Boc)2〇缓慢滴入至上述溶液。〇°C左右，反应60 min，再室温反应15 h，反应完毕。反应液用乙酸乙酯萃取2 -3次，弃去上层，用酸调节pH，再用二氯甲烷萃取2-3次。合并下层有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩溶剂，得中间体1; 将2 mmol亚磷酸二乙酯与2 mmol邻氟苯甲醛加入50ml三颈瓶中，充分混合，然后将1.5 mmol三乙胺逐滴加入混合液中。10 min后，升高温度，在80°C搅拌反应1.5 h。再在室温搅拌 反应24 h。反应完毕，减压除去三乙胺，用乙醚:石油醚=1:1重结晶，得中间体2。
[0018] 取中间体1(4 mmoL)和中间体2(4 mmol)，加入到50 mL三口瓶中，再加入DCC (4.1 mmol)，以无水二氯甲烷(15 mL)为溶剂，搅拌溶解，冰盐浴(-5~0 °C)下，用恒压滴液漏斗缓 慢滴加 DMAP (4.1 mmol，无水二氯甲烷15 mL溶解），30 min滴加完毕，室温反应12 h，过滤， 除去不溶物，浓缩溶剂，柱层析法(乙酸乙酯:石油醚=1:1)分离纯化，得中间体3。
[0019] 在反应瓶中加入无水乙酸乙酯(4 mL)，冰盐浴(-5~0 °C)下充分搅拌，依次加入甲 醇（1 mmoL)和乙酰氯（1 mmoL)，维持该温度，反应约3 h。然后将中间体3(0.5 mmoL，用5 mL 无水乙酸乙酯溶解），缓慢加入反应体系中，TLC跟踪，冰水浴下搅拌反应10 h，减压浓缩，得 粘稠液体，柱层析法(氯仿：甲醇=8:1)分离纯化，真空干燥，得到化合物(Ib)，产率48.0 %。
[0020]
(c= 0.01g/mL， methanol). 4 NMR (400 MHz, CDCh)， δ: 1.06 ~1.15 (m， 6H， CH3), 1.82 (s， 2H， NH2)， 2.85~2.98 (m， 2H， OfeAr), 3.86~4.03 (m， 4H， 0CH2)， 4.59 (s， 1H， NCH)， 6.02 (dd， 1H， J=20 Hz PCH)， 6.86~7.38 (m， 9H， Ar-H); 13C 匪R (100 MHz, CDC13)， δ: 16.0， 16.1， 37.7， 54.4， 63.3， 63.4， 69.4, 115.2, 126.5, 128.1, 129.0, 129.6, 135.5, 135.8, 154.9, 155.1, 170.4. IR ( KBr ) v: 3302, 2981, 2855, 1671, 1538, 1207, 1033 cm-1 〇
[0021 ] 实施例3: 二乙基-a-(4_氟苯基)-a- (L-2-氨基苯丙酰氧基）甲基膦酸酯（I c)的制备。
[0022] 将10 m mol L-苯丙氨酸溶于50 mL四氢呋喃，冰水浴至0°C左右，加入三乙胺20 m mol。然后将12 m mol (Boc)2〇缓慢滴入至上述溶液。〇°C左右，反应40 min，再室温反应15 h，反应完毕。反应液用乙酸乙酯萃取2 -3次，弃去上层，用酸调节pH，再用二氯甲烷萃取2-3次。合并下层有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩溶剂，得中间体1; 将2 mmol亚磷酸二乙酯与2 mmol对氟苯甲醛加入50ml三颈瓶中，充分混合，然后将1.5 mmol三乙胺逐滴加入混合液中。10 min后，升高温度，在80°C搅拌反应1.5 h。再在室温搅拌 反应24 h。反应完毕，减压除去三乙胺，用乙醚:石油醚=1:1重结晶，得中间体2。
[0023] 取中间体1(4 mmoL)和中间体2(4 mmol)，加入到50 mL三口瓶中，再加入HBTU (4.1 mmol)，以无水二氯甲烷（15 mL)为溶剂，搅拌溶解，冰盐浴(-5~0 °C)下，用恒压滴液 漏斗缓慢滴加 DIPEA (4.1 mmol，无水二氯甲烷15 mL溶解），30 min滴加完毕，室温反应12 h，过滤，除去不溶物，浓缩溶剂，柱层析法(乙酸乙酯:石油醚=1:1)分离纯化，得中间体3。
[0024] 在反应瓶中加入无水乙酸乙酯(4 mL)，冰盐浴(-5~0 °C)下充分搅拌，依次加入甲 醇（1 mmoL)和乙酰氯（1 mmoL)，维持该温度，反应约3 h。然后将中间体3(0.5 mmoL，用5 mL 无水乙酸乙酯溶解），缓慢加入反应体系中，TLC跟踪，冰水浴下搅拌反应10 h，减压浓缩，得 粘稠液体，柱层析法(氯仿：甲醇=7:1)分离纯化，真空干燥，得到化合物(Ic)，产率52.3 %。
[0025]
(c= 0.01g/mL， meth