羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的重组羰基还原酶及其编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组羰基还原酶中的应用；分别以2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)和(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行生物催化反应制备高光学纯度的(2S,3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羟基丁酸酯、(S)-N,N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺、(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯以及6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
【专利说明】羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126的羰基还原酶基因、编码酶、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重 组基因工程菌以及在制备手性药物中间体中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 羰基还原酶（E.C. I. I. 1. 184)属于氧化环氧酶家族，反应需要辅酶NAD(P)H参 与，能立体选择性催化潜手性的酮类物质不对称还原成光学手性醇中间体。该类酶广 泛分布于自然界中，在各类动物、微生物和植物中均有发现。其中，由于微生物种类繁 多、分布广，是羰基还原酶的主要来源。目前已从多种微生物中发现了羰基还原酶，如： Pichia finlandica, Clostridium ljungdahlii, Vibrio vulnificus, Candida glabrata, Serratia quinivorans, Polygonum minus, Arabidopsis thaliana, Oenococcus oeni, Serratia marcescens, Chryseobacterium sp. , Rhodococcus erythropolis, Candida magnoliae, Lactobacillus jensenii 和 Lactobacillus coryniformis 等。 此 夕卜， 还从极端微生物中发现了嗜极端环境的羰基还原酶，如：Thermococcus sibiricus， Thermococcus guaymasensis, Haloferax volcanii, Thermus thermophilus, Sulfolobus acidocaldarius, Carboxydothermus hydrogenoformans, Thermococcus kodakarensis, Thermotoga maritime, Koliella Antarctica, Pyrobaculum calidifontis 和 Halobacterium sp.等。
[0003] 近年来，随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，利用基因挖掘技术 克隆新型羰基还原酶已成为一种重要手段。目前已利用此技术克隆了大量的羰基还原酶。 其中部分羰基还原酶的基因已在不同的宿主（大肠杆菌、毕赤酵母等）中表达，获得产酶活 力和选择性较高的基因工程菌，并应用于不对称还原羰基类化合物。尽管如此，许多羰基还 原酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物催化剂，因此大大限制了其应 用范围。此外，许多酶的催化效率较低，也限制了其工业化应用。筛选具有较宽底物谱的新 型羰基还原酶，研究其可以高效高选择性催化的手性药物中间体，不仅可以拓宽其应用范 围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。
[0004] (2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯是合成培南类药物中间体4-乙酰氧基 氮杂环丁酮（4AA)的关键手性中间体。目前获得（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸 酯中间体的主要途径是以手性催化剂（R) -BINAP-Ru不对称催化2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁 酸酯生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。但由于其反应条件苛刻，不利于其工 业化生产。生物催化法合成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯报道较少，并且多数 形成混合构型的产物。Saccharomycopsis malanga NBRC 171096催化生成（2S, 3R)单一 构型，并具有较高的对映选择性（对映体过量值ee>96. 2% )与非对映选择性（非对映体 过量值de>92.2%)，但是催化效率低（产率仅4%)。美国专利US20130034895研究了来 源于Lactobacillus kefir的羰基还原酶催化合成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸 酯，具有较高的对映选择性（ee为60-99% )，但未见其非对映选择性的报道。
[0005] 度洛西汀（欣百达，Cymbalta)是一种5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂 (SNRIs)，由美国Eli LiIly公司开发。它含有一个手性中心，仅（S)构型的对映体具有药物 活性。（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺是度洛西汀合成过程中的关键手性 中间体。目前获得（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺主要也是通过过渡金 属手性配体催化氢化途径。微生物法不对称还原合成（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻 吩基）丙酰胺报道较少。Pankaj等报道了热带假丝酵母（Candida tropicalis MTCC-5158) 和维斯假丝酵母菌（Candida viswanathii)催化底物N，N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基） 丙酰胺合成（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，转化率>80%，ee>99%。 国内专利 CN102925368, CN 103013898 和 CN103421854 公开 了球饱白僵菌（Beauver iabassiana)及马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyce marxianus)中的羰基还原酶不对称还 原制备（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺，底物浓度可达30g/L，转化率 >80%，66>99%。美国专利旧20130177962公开了利用酮还原酶〇0?0)生产（5)，，^双 甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺的方法，底物浓度可达100g/L，但该工艺需要严格的 控温和反应控制，并添加异丙醇，副产物丙酮难以去除。
[0006] (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯是HMG-CoA 酶抑制剂阿托伐他汀类药物的侧链手性中间体。生物法不对称还原合成（S)-4-氯-3-羟 基丁酸乙酯的研究较为成熟，涉及到的酶也较多，具有较高的选择性和活性的菌株有： Geotrichum candidum,Pichia stipitis,Candida albicans,Streptomyces coelicolor和 Candida parapsilosis ATCC 7330。其中从 Candida parapsilosis ATCC 7330 中克隆到 的一种羰基还原酶催化生产（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯时的底物浓度最高可达3000禮，产 率>99. 0%，ee>99. 9%。此外，Codexis公司专利US7807423B2公开了一系列酮还原酶，催 化生产（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯， ee>99%。6-氰基_(3R，5R)_二羟基己酸叔丁酯是阿 托伐他汀的另一种手性中间体，目前高立体选择性催化（R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸 叔丁酯生成6-氰基-(3R，5R)_二轻基己酸叔丁酯的菌株有：Saccharomyces cerevisiae， Pichia angusta, Pichia haplophila, Beauveria bassiana, Pichia pastoris, Pichia membranefaciens, Candida humicola, Kluyveromyces drosophilarum, Rhodotorula glutinis 和 Pichia caribbic 等。Codexis 公司专利 US7879585B2 从 Saccharomyces cerevisiae中克隆了一种酮还原酶并进行了改造，催化生产6_氰基-(3R, 5R)-二轻基己酸 叔丁酯转化率为85%，de>99%。
[0007] 由此可见，研究这些药物手性中间体的生物催化工艺具有重要意义，不仅能为这 些化合物的合成提供新的路线，又能为其提供新的酶源。迄今为止，仍未见Burkho I der i a gladioli菌株中的羰基还原酶在这些药物手性中间体不对称还原中的应用。 (三）
【发明内容】
[0008] 本发明目的是提供一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126羰基还原酶基因、编码酶、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重 组基因工程菌，以及在制备（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯、（S)-N，N-双甲 基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺、（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和6-氰基-(3R，5R)-二 羟基己酸叔丁酯等手性药物中间体中的应用。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126的羰基还原酶基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示，所述羰基还原 酶基因由如下方法得到：
[0011] 利用 PCR 技术，在引物 I (ATGAGCAAGCGGCTGGAAGGCAAGG)、引物 2 (TCAGACCTGGGCCTGGCCGCC)的作用下以来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli) ZJB-12126菌株中的总基因组DNA为模板克隆长约0. 8kb的羰基还原酶基因序 列，命名为adh2。将该片段连接到pMD18-T载体上，获得克隆载体pMD18-T-adh2,将载体转 化大肠杆菌获得含载体pMD18-T-adh2的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测 序结果进行分析，该序列含有一个长756bp的开放阅读框。
[0012] 本发明表达引物 3 (CATATGAGCAAGCGGCTGGAAGG CAAGG)和引物 4 (CTCGAGTCAGACCTGGGCCTGGCCGCCG)，酶切位点分别为Nde I和Xho I (下划线），以克隆载 体pMD18-T-adh2为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的羰基还原酶基因。
[0013] 任何对SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、插入或缺失 处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90%以上的同源性，均属于本发明的保护 范围。
[0014] 本发明提供一种由所述羰基还原酶基因 adh2编码的重组羰基还原酶，命名为 BgADH2,所述重组羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
[0015] 任何对SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中氨基酸进行插入、缺失或替换的处理获得 的多肽片段或其突变体，只要其与SEQ ID N0:2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属 于本发明的保护范围。
[0016] 本发明涉及含所述羰基还原酶基因的重组载体。
[0017] 本发明涉及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，具体为：将羰基 还原酶基因同表达载体pET28a连接，构建了含有羰基还原酶基因的异源表达重组质粒 pET28a-adh2。将表达重组质粒pET28a-adh2转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得 含有重组质粒pET28a-adh2的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a-adh2。
[0018] 本发明还涉及羰基还原酶基因在制备重组羰基还原酶中的应用，具体为：构建 含有所述羰基还原酶基因的重组载体，将所示重组载体转化至大肠杆菌（优选E.coli BL21 (DE3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组羰基还原 酶的菌体细胞，破碎后获得的羰基还原酶粗酶液进行纯化，获得羰基还原酶纯酶。
[0019] 本发明还涉及所述重组羰基还原酶在制备药物手性中间体中的应用，所述应用 为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于PH值为6? 10的缓冲液中，加入底物，辅助底物和NAD (P) +，在20?40°C、50?250rpm条件下反应（优 选30°C、150r/min下反应2h)，反应完全后，获得含药物手性中间体的混合液；反应结束后， 将混合液用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙 酸乙酯，烘干后获得药物手性中间体；所述底物为2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N，N-双 甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基 己酸叔丁酯中的一种；所述辅助底物为葡萄糖、甲酸铵、异丙醇或无水乙醇，优选葡萄糖，所 述辅助底物为葡萄糖时，添加葡萄糖脱氢酶构成辅助底物体系，所述辅助底物为甲酸铵时， 添加甲酸脱氢酶构成辅助底物体系；所述催化剂的用量以湿菌体重量计为20-200g/L缓冲 液（优选50g/L)，所述底物的初始浓度为10-100mm 〇l/L缓冲液（优选20mmol/L)，所述辅 助底物的用量为10_200g/L缓冲液（优选50g/L)，所述NAD (P)+的用量为0. 01-5mmol/L缓 冲液（优选2mmol/L)，所述葡萄糖脱脱氢酶或甲酸脱氢酶用量以含葡萄糖脱脱氢酶或甲酸 脱氢酶菌体经发酵培养获得的湿菌体重量计，为20-200g/L缓冲液（优选50g/L)。所述底 物2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯以400mmol/L DMSO溶液的形式加入（即2-苯甲酰氨甲 基-3-酮丁酸酯用二甲基亚砜配制成400mmol/L的溶液）。
[0020] 进一步，本发明所述含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按 如下方法制备：将含有重组羰基还原酶基因的工程菌接种至含有终浓度50 μ g/mL卡那霉 素抗性的LB液体培养基，37°C，200rpm下培养12h，再以体积浓度1%接种量接种至新鲜 的含有终浓度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37°C，150rpm下培养至菌体 OD6tltl达0. 6-0. 8,加入终浓度为0. ImM的IPTG，28°C下诱导培养12h后，4°C、5000rpm离心 5min,弃去上清液,收集湿菌体。
[0021] 本发明所述脱氢酶湿菌体按如下方法制备：将含葡萄糖脱氢酶（GDH)的（优 选来源于 Exiguobacterium sibiricum 255-15 的 GDH，GenBank:ACB59697. 1)重组菌 BL21(DE3)/pET28b-gdh 或含甲酸脱氢酶（FDH)(优选来源于 Candida boidinii 的 FDH， GenBank:AF004096)的重组菌BL21 (DE3) /pET28b-fdh接种至含有终浓度50 μ g/mL卡那霉 素抗性的LB液体培养基，37°C，200rpm下培养12h，再以1%接种量（v/v)接种至新鲜的含 有终浓度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37°C，150rpm下培养至菌体0D_ 达0. 6-0. 8,加入终浓度为0. ImM的IPTG，28°C下诱导培养12h后，4°C、5000rpm离心5min， 弃去上清液，收集沉淀，即获得脱氢酶湿菌体。
[0022] 进一步，优选所述的反应以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿 菌体为催化剂，于pH值为6?10的缓冲液中，加入底物，葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和NAD (P)+， 在30°C、150rpm条件下反应，反应完全后，获得含药物手性中间体的混合液；所述底物为 2_苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N，N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙 酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的一种；所述催化剂的用量以湿菌体 的重量计为50g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为20mmol/L缓冲液，所述辅助底物的用量 为50g/L缓冲液，所述葡萄糖脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶的菌体经发酵培养获得的湿 菌体重量计，为50g/L缓冲液，所述NAD(P) +的用量为2mmol/L缓冲液。
[0023] 进一步，本发明所述含所述羰基还原酶基因的羰基还原酶BgADH2作为生物催化 剂在转化底物2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯（式I)生成（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羟 基丁酸酯（式II)中的应用，式I中，R为C1-C6的烷基，涉及的反应式见图6所示。
[0024] 具体地，上述应用的反应体系为：以磷酸盐缓冲液（lOOmM，pH 7. 0)为反应介质， 以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，加入葡萄糖脱氢 酶，2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯，NADP +和葡萄糖，30°C，转速150r/min条件下水浴摇床反 应2h，反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥， 过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，获得浓缩物，干燥，即为（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羟 基丁酸酯；所述底物以400mmol/L DMSO溶液的形式加入，底物的终浓度20mmol/L缓冲液， NADP+用量为2mmol/L缓冲液，葡萄糖用量为50g/L缓冲液，湿菌体用量为50g/L缓冲液。
[0025] 进一步，所述底物为N，N_双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺时，其反应式见图 7所示。
[0026] 具体地，上述应用的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养 获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液（pH 8.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶、葡萄 糖、NADP+，底物N，N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺（式III)，3(TC，转速150r/min 条件下反应2h，反应结束后，反应液加6M NaOH水溶液调pH至11. 0,再加入等体积乙酸乙酯 萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，获得浓缩物， 干燥，即为（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺（式IV);所述重组羰基还原 酶湿菌体用量50g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以葡萄糖脱氢酶湿菌体重量计为50g/L缓 冲液、葡萄糖用量为50g/L缓冲液、NADP +用量为2mmol/L缓冲液、底物浓度20mmol/L缓冲 液。
[0027] 进一步，所述底物为4-氯乙酰乙酸乙酯时，其反应式见图8所示。
[0028] 具体地，上述应用的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培 养获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液（pH 7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶， 葡萄糖，NADP+，底物 4-氯乙酰乙酸乙酯（4-chloroacetoacetate ethyl，C0BE)(SV)， 30°C，转速150r/min条件下反应2h，反应结束后，反应液加入等体积乙酸乙酯萃取两 次，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥，即为 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE)(式VI);所述重组羰基还原酶湿菌体用量50g/L缓冲 液、葡萄糖脱氢酶用量以葡萄糖脱氢酶湿菌体重量计为50g/L缓冲液，葡萄糖用量为50g/L 缓冲液、NADP+用量为2mmol/L缓冲液，底物浓度20mmol/L缓冲液。
[0029] 进一步，所述底物为（R) -6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，其反应式见图 9所示。
[0030] 具体地，上述应用的反应体系为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养 获得的湿菌体为催化剂，以磷酸钾缓冲液（pH 7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氢酶，葡萄 糖，隱0?+，底物〇〇-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯（式￥11)，3〇1：，转速15〇1·/!^!! 条件下反应2h，反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镁干 燥，过滤，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，浓缩物干燥即为6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯 (式VIII);所述重组羰基还原酶湿菌体用量为50g/L缓冲液、葡萄糖脱氢酶用量以葡萄糖 脱氢酶湿菌体用量计为50g/L缓冲液，葡萄糖用量为50g/L缓冲液、NADP +用量为2mmol/L 缓冲液，底物浓度20mmol/L缓冲液。
[0031] 本发明所述催化剂还包括羰基还原酶BgADH2纯酶、粗酶液或者粗酶粉等其他形 态。采用羰基还原酶重组基因工程菌作催化剂时，需结合一种辅酶循环系统，包括葡萄糖/ 葡萄糖脱氢酶（GDH)、甲酸/甲酸脱氢酶（FDH)等双酶双底物辅酶循环系统以及乙醇、异丙 醇等单酶双底物辅酶循环系统。通常用辅助底物代替NAD (P) H进行反应，常用的辅助底物 为：葡萄糖10_200g/L、乙醇或异丙醇2-30% (v/v，占总转化体系的质量体积百分数）；较 佳的菌体浓度为20-200g/L。
[0032] 能够提供本发明所述羰基还原酶基因的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli)ZJB-12126,保藏编号为CCTCC M 2012379,保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年9月25日，已在先前的专利申请 (CNl〇3〇455〇4A)中披露。
[0033] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了来源于一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基还原酶基因，该羰基还原酶基因可与表达载体 连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET28a-adh2,再转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，获 得重组大肠杆菌，该大肠杆菌含有重组羰基还原酶，可以利用重组大肠杆菌作为生物催化 剂进行生物催化反应，为药物手性中间体的生物催化合成提供了可供选择的新型酶源。
[0034] 重组羰基还原酶BgADH2作为生物催化剂，以2-苯甲酰胺甲基-3-酮丁酸酯为底 物制备（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羟基丁酸酯，产物ee>95%，de>95%，2h底物转化率 为 68%，与 CN103045504A 中 B.gladioli ZJB-12126 野生菌相比（ee 81%，de 91%，24h 底物转化率64% )，对映选择性与转化率均得到了提高。以N，N-双甲基-3-酮-3-(2-噻 吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物 时，也可以进行转化反应制备相应的（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺、 (S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯以及6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯，产物ee分别为 99 %，99 %和95% ;底物转化率分别为82%，87 %和93%。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1为克隆载体pMD18-T_adh2物理图谱；
[0036] 图2为pET28a_adh2重组质粒物理图谱；
[0037] 图3为羰基还原酶基因 PCR扩增低熔点琼脂糖凝胶（argrose)电泳图；其中，泳道 1为DL2000DNA Marker ;泳道2为利用引物1和引物2扩增得到的羰基还原酶基因片段；泳 道3为利用引物3和引物4扩增得到的羰基还原酶基因片段。
[0038] 图4阳性重组质粒pET28a-adh2的酶切结构图；其中，泳道1为DL 10000DNA Marker片段；泳道2为羰基还原酶基因；泳道3为pET28a-adh2/Nde I样品；泳道4为 pET28a-adh2/Xho I 样品；泳道 5 为 pET28a-adh2/Nde I and Xho I 样品；
[0039] 图5为羰基还原酶纯化后的SDS-PAGE图：泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2 为纯化后的羰基还原酶BgADH2。
[0040] 图6为（2S，3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羟基丁酸酯合成方程式。
[0041] 图7为（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺合成方程式。
[0042] 图8为（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成方程式。
[0043] 图9为6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯合成方程式。 (五）
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0045] 实施例1 :羰基还原酶基因 adh2的扩增
[0046] 根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli)ZJB-12126全基因组测序 信息，挖掘其中大量的羰基还原酶，其中一个具有催化2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯和 N，N-双甲基-3-氧-3-(2-噻吩基）丙酰胺生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯 和（S)-N，N-双甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基）丙酰胺功能的酶为本发明涉及的羰基还原酶 BgADH2。
[0047] 利用MPBio公司的FastDNAK Spin试剂盒提取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 (Bur kho I der i a g I ad i 〇 I i) Z JB12126菌体的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引 物 I (ATGAGCAAGCGGCTGGAAGGCAAGG)、引物 2 (TCAGACCTGGGCCTGGC CGCC)的作用下进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（总体积 50 μ L) : 10 X Pfu DNA Polymerase Buffer 5 μ L，IOmM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5πιΜ)1μ L，浓度为 50μΜ 的克隆引物 1、引物 2 各 1 μ L，基因组 DNA 1 μ L，Pfu DNA Polymerase 1 μ L，无核酸水 40 μ L。
[0048] 采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件：预变性95°C 5min，95°C变性30s，65°C退火 45s，72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0049] PCR反应液用0. 9%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用Taq DNA聚 合酶向片段5 '端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pMD 18-T载体进行连接，得 到克隆重组质粒pMD18-T-adh2,见图1。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，涂布于含 有终浓度为50 μ g/ml氨苄青霉素钠抗性的LB平板，随机挑取阳性克隆测序，利用软件分析 测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为756bp (其核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示），该序列编码一个完整的开放阅读框（氨基酸序列为SED ID NO. 2)。
[0050] 实施例2 :重组大肠杆菌BL21 (DE3) /pET28a-adh2的构建
[0051] 根据实施例1分析结果设计引物3 (CATATGAGCAAGCGGCTGGAAGGCAA GG)、引物 4 (CTCGAGTCAGACCTGGGCCTGGCCGCCG)，并分别在引物 3 和引物 4 中引入了 Nde I 和 Xho I 限 制性酶切位点（下划线标记）。在引物3和引物4的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶 进行扩增，获得长为756bp的羰基还原酶基因序列（其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示）， 测序后利用Nde I和Xho I限制性内切酶（TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连 接酶（TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28a(Invitrogen) 进行连接，构建表达载体pET28a_adh2。将构建的表达载体pET28a_adh2转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) (Invitrogen)中，涂布于含有终浓度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB平板，37°C下 培养8-16h，随机挑取克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图4所示，从图4可以看出 阳性重组质粒pET28a-adh2单酶切在3泳道和4泳道出现单一的与预期相符的条带，双酶 切后5泳道出现两条带，一条带与目的基因片段大小一致。该结果说明目的基因已经克隆 至pET28a的Nde I和Xho I位点，S卩获得了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-adh2。
[0052] 实施例3 :重组羰基还原酶（BgADH2)湿菌体
[0053] 将实施例2获得的含有表达重组质粒pET28a_adh2的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3) /pET28a-adh2菌体接种至含有终浓度50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基， 37°C，200rpm下培养12h，再以1 %接种量（v/v)接种至新鲜的含有终浓度50 μ g/ml卡那霉 素抗性的LB液体培养基中，于37°C，150rpm下培养至菌体0D_达0. 6-0. 8,加入终浓度为 0. ImM的IPTG，28°C下诱导培养12h后，4°C、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集沉淀，即 获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21 (DE3) /pET28a-adh2湿菌体。该菌体可直接作 为生物催化剂或者用于蛋白纯化。
[0054] 实施例4 :羰基还原酶（BgADH2)的分离纯化
[0055] 将实施例3中获得的菌体（即重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a-adh2湿菌体）以 结合缓冲液（50福，？118.0磷酸钠缓冲液，含300福他(：1，10福咪唑）重悬后，经超声破碎， 12000rpm离心40min，上清与经上述结合液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲 液（50福，？!18.0磷酸钠缓冲液，含300福他(：1，20福咪唑）冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗 脱缓冲液（50福4118.0磷酸钠缓冲液，含300福他(：1，250福咪唑）洗脱并收集目的蛋白， 电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液（50mM，pH 8. O磷酸钠缓冲液）透析48h，取截 留液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为2mg/mL，将酶液稀释至终浓度为0. 5mg/mL分装，冻存 于-80°C (羰基还原酶BgADH2蛋白电泳图见附图5)，获得羰基还原酶BgADH2纯酶。
[0056] 实施例5 :重组羰基还原酶BgADH2的活性测定
[0057] 以实施例4方法分离纯化得到的羰基环化酶BgADH2纯酶用于催化底物2-苯甲酰 氨甲基-3-酮丁酸酯。
[0058] 催化体系组成及催化条件如下：IOmL磷酸盐缓冲液（lOOmM，pH 7. 0)中加入羰基 还原酶BgADH2纯酶（终浓度为0. lg/L)，2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯（终浓度20mmol/ L，初始浓度为400mmol/L DMSO)，NAD⑵H(终浓度5mmol/L缓冲液）构成反应体系。30°C， 转速150r/min条件下反应5min取样检测酶活。同样条件下，以大肠杆菌BL21(DE3)以及 大肠杆菌BL21 (DE3) /pET28a菌体破碎上清经透析得到的截留液作为对照。
[0059] 酶活单位⑶定义为：在30°C、pH 7. 0条件下，Imin内消耗1 μ mol NAD (P) H所需 的酶量定义为1U。NAD(P)H的消耗量采用酶标仪在340nm下测定。根据体系中NAD(P)H的 消耗量计算重组羰基还原酶BgADH2的酶活。测定结果见表1。
[0060] 表1重组羰基还原酶BgADH2的酶活测定
【权利要求】
1. 一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基还 原酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示。
2. -种权利要求1所述羰基还原酶基因编码的重组羰基还原酶。
3. 如权利要求2所述的重组羰基还原酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :2所示。
4. 一种权利要求1所述羰基还原酶基因构建的重组载体。
5. -种权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
6. -种权利要求1所述的羰基还原酶基因在制备重组羰基还原酶中的应用。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述羰基还原酶基 因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养， 培养液分离得到含有重组羰基还原酶的菌体细胞。
8. -种权利要求2所述重组羰基还原酶在制备药物手性中间体中的应用，其特征在于 所述应用为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH 值为6?10的缓冲液中，加入底物，辅助底物和NAD (P)+，在20?40°C、50?250rpm条件 下反应，反应完全后，获得含药物手性中间体的混合液；所述底物为2-苯甲酰氨甲基-3-酮 丁酸酯、N，N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基）丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R) -6-氰 基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的一种；所述辅助底物为葡萄糖、甲酸铵、异丙醇或无 水乙醇，所述辅助底物为葡萄糖时，添加葡萄糖脱氢酶构成辅助底物体系，所述辅助底物 为甲酸铵时，添加甲酸脱氢酶构成辅助底物体系；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为 20-200g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为10-100mm 〇l/L缓冲液，所述辅助底物的用量为 10-200g/L缓冲液，所述葡萄糖脱脱氢酶或甲酸铵脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶或甲酸 脱氢酶的菌体经发酵培养获得的湿菌体重量计，为20-200g/L缓冲液，所述NAD (P) +的用量 为 0. 01-5mmol/L 缓冲液。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有重组羰 基还原酶基因的工程菌接种至含有终浓度50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37°C， 200rpm下培养12h，再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μ g/ml卡那霉 素抗性的LB液体培养基中，于37°C，150rpm下培养至菌体0D_达0. 6-0. 8,加入终浓度为 0. ImM的IPTG，28°C下诱导培养12h后，4°C、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集湿菌体。
10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的反应以含重组羰基还原酶基因的工 程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6?10的缓冲液中，加入底物，葡萄糖、 葡萄糖脱氢酶和NAD (P) +，在30°C、150rpm条件下反应，反应完全后，获得含药物手性中间体 的混合液；所述底物为2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N，N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基） 丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和（R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的一种；所述催 化剂的用量以湿菌体的重量计为50g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为20mmol/L缓冲液， 所述辅助底物的用量为50g/L缓冲液，所述葡萄糖脱脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶的菌 体经发酵培养获得的湿菌体重量计，为50g/L缓冲液，所述NAD (P) +的用量为2mmol/L缓冲 液。
【文档编号】C12N1/21GK104263742SQ201410436860
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】郑裕国, 柳志强, 陈翔, 王亚军, 沈寅初 申请人:浙江工业大学