一种羰基还原酶及其在合成手性羟基化合物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种羰基还原酶，含有编码该酶的核苷酸序 列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羰基 还原酶作为催化剂在不对称合成手性羟基化合物中的应用。
【背景技术】
[0002] 含有特定功能基团的光学活性手性醇是合成药物、农药及其它精细化学品的重 要手性砌块。而其中的手性芳香醇是合成手性药物、生物碱和其它手性化合物的重要中 间体，是一大类有着重要工业潜力的有机化合物，在当今制药领域里有着重要的作用。比 如，（S)-(+)-l，l-二苯基-2-丙醇及（R)-(-)-l，l-二苯基-2-丙醇可以通过氨化反 应制成有用的手性芳香胺化合物，进而合成手性农用化学品和手性医用药物；再比如， (S)-4-(l-羟基乙基）喹啉-2-羧酸是硫链丝霉肽（Thiostrepton)的重要中间体；再比如， (S) _1_(2, 6-二氯_3_氣代苯基）乙醇是合成克唑替尼的重要中间体；又如（S) _2_ (2-氯 代苯基）-2-羟基乙酸甲酯是合成用于治疗脑卒中、心肌梗死的畅销药氯吡格雷的重要中 间体。这样的用作药物中间体的手性芳香醇在制药领域中很多。
[0003] 对于手性芳香醇的合成主要有两种途径：一是通过对潜手性芳香酮的对映选择性 还原，二是可以通过对外消旋体的拆分实现。
[0004] 针对第一种途径，目前发展得比较成熟的有三种方法：第一是使用手性配体修饰 的金属氢化物试剂，在这些化合物中，将活泼氢的数目减至最小以获得高度的化学选择性， 引入的手性配体则为对映面选择性做出贡献，应用比较广泛的试剂是一种联萘酚修饰的氢 化铝试剂，简称BINAL-H ;第二种方法是在氢化反应中使用过渡金属络合物进行催化，常用 的过渡金属有钌和铑；第三种方法是使用硼杂噁唑烷催化体系，在使用硼烷还原羰基化合 物的过程中，引入手性的硼杂恶唑烷，使前两者在反应面的某一侧足够靠近发生反应，该体 系被命名为CBS体系。目前，对于潜手性芳香酮的不对称还原已经发展得比较成熟，但是上 述几种方法都需采用一些比较昂贵不易获得的试剂或配体，不适合大规模的制备手性醇。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的制备手性芳香醇的反应中收率低、 反应条件苛刻等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的羰基还原 酶，以及使用该羰基还原酶催化合成手性芳香醇的方法。还提供了编码该羰基还原酶的核 苷酸序列，含有该核苷酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该羰基还原酶的制备方 法，以及该羰基还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。
[0006] 本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
[0007] 本发明的第一方面提供了一种羰基还原酶，其是如下（a)或（b)的蛋白质：
[0008] (a)由SEQ ID No: 1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[0009] SEQ ID No: 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质由来源于链霉菌Sreptacidiphilus albus的基因编码，具有羰基还原酶的功能，是一种新的羰基还原酶。
[0010] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有羰基还原酶活性的蛋白质。
[0011] 其中，所述的"几个"是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比 如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明人发现这样的融合蛋白同样具有羰基还原酶 活性。也就是说，只要由（a)衍生的蛋白质具有羰基还原酶活性，且衍生方式如上所述，都 可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的蛋白质（a) 分子中进行1~5个氨基酸残基的突变，仍然保持羰基还原酶活性。
[0012] SEQ ID No: 1所示的羰基还原酶和其他已知羰基还原酶之间的同一性为50%。本 发明的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示的羰基还原酶与已知羰基还原酶的氨基酸序列的同 一*性低于90%，具有显著差异性。
[0013] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。
[0014] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的羰基还原酶。优选 地，所述核酸是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的。
[0015] 由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成的核酸来源于链霉菌Sreptacidiphilus albus基因组，其可以从基因组DNA中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或 重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。
[0016] 本发明中，SEQIDNo:2所示的基因命名为ABY-KRED-SA，全长828bp。其中，其编 码序列（⑶S)从第1个碱基起至第825个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该 序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N〇:l所示。
[0017] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No: 1的氨基酸序列的 核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID N〇:2。本发明的羰基还原酶基因的核苷酸序列也可以是 编码序列表中SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适 当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物 可以通过对核苷酸序列SEQ ID N〇:2的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺 失或添加来制得。
[0018] SEQ ID N〇:2的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信 号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没 有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完 全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
[0019] SEQ ID No:2的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No:2所示序列的核酸 进行杂交的核苷酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的 方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载 有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲 液的组成为〇· lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~8XSSC ; 20 X SSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50~70°C ;在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组 成为6X SSC+O. Iwt % SDS溶液，更优选为5X SSC+O. Iwt % SDS ;当用这种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
[0020] 本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码羰基还原酶的核苷酸序列的 重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码羰基还原酶或其突变体的核 苷酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体， 如市售的质粒、粘粒、菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳地，可通过下述方法制得 本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET28a分别用限 制性内切酶NdeI和HindIII双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有 本发明的编码羰基还原酶的核苷酸序列的重组表达质粒pABI-ADH-SA或含有编码其突变 体的核苷酸序列的重组表达质粒。
[0021] 本发明的第四个方面提供了一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。 可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规 的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的还原酶基 因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌（E.Coli)，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。将前 述重组表达质粒pABI-ADH-SA或其突变体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，即可获得本发明 优选的基因工程菌株，即sABI-ADH-SA或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电 转法，热击法等；较佳地选择热击法进行转化，热击条件较佳的是：42°C，热击90秒。
[0022] 本发明的第五方面提供一种重组羰基还原酶的制备方法，包括培养本发明所述的 重组表达转化体，以及从培养物中获得重组羰基还原酶。
[0023] 其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化 至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使 转化体生长并表达本发明的羰基还原酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基（蛋 白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7. 0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可 以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转 化体生长并表达本发明的羰基还原酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规 操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法：将本发明的重组大肠杆 菌（优选BL21(DE3)或其突变体）接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密 度〇D_达到0. 6~0. 8时，加入终浓度为1.0 mmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)进行诱导，诱导温度20~40°C (更佳地是30°C )，即可高效表达本发明所述重组羰 基还原酶。
[0024] 本发明中催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性手性醇的催 化剂，可以是上述重组转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化 体细胞或者用其加工的制品。这里"加工的制品"是指由转化体得到的提取物、或通过对提 取物中的羰基还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或 提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
[0025] 本发明的第六个方面提供了一种本发明的羰基还原酶或重组羰基还原酶在催化 前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用。
[0026] 所述的前手性羰基化合物为芳基酮类化合物。
[0028] 其中，
[0029] X表示被卤素、烷基、烷氧基、羟基或取代烷基中的任一取代基取代；
[0030] R选自H、Cl~C8支链或直链烷基或含有2~8个碳原子的酯基；
[0031] Y为H、Cl~C4烷基或含有2~8个碳原