子的酯基；
[0032] Z为酰胺或含有2~8个碳原子的酯基。
[0033] 所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳为10~100g/L。本发明的羰基 还原酶或重组羰基还原酶的用量为催化量的，较佳的为1~100U/L。葡萄糖脱氢酶的用量 较佳的为100~1000U/L。葡萄糖的用量较佳的为50~100g/L。NAD+的用量较佳的为0~ 1.0 mmol/L。所述的磷酸盐缓冲液可为本领域常规的磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲 液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为50~100mM，所述的浓度是指缓冲溶液中共辄酸碱的总 浓度。所述的不对称还原反应较佳的在振荡条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较 佳的在20~40°C。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准，一般为1~12 小时。不对称还原反应结束后，可按照本领域常规的方法从反应液中提取（S)-型手性醇产 物。
[0034] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0035] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0036] 本发明的积极进步效果在于：本发明针对手性芳香族醇的立体选择性催化反应成 本高、反应立体选择性差、反应条件苛刻等问题，提供了一种新的羰基还原酶及利用重组羰 基还原酶进行不对称还原的方法。相对于其它酶催化的不对成酮还原反应，该酶具有宽泛 的底物选择性，可以催化苯环、萘环、吡啶、苯并吡啶等多种取代芳香酮的还原，在催化浓度 高达l〇〇g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达99%以上，使用本发明方法制备所得的产物 浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的 优点，因此具有很好的工业应用前景。
【附图说明】
[0037] 图1羰基还原酶基因 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA分子量标准，泳道1 为PCR扩增的的羰基还原酶基因
[0038] 图2羰基还原酶粗酶液的蛋白表达凝胶电泳图。M为分子量标准，泳道1为羰基还 原酶的蛋白上清液。
【具体实施方式】
[0039] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0040] 实施例中TLC条件：乙酸乙酯：乙醇：氨水=10:3:1，碘缸显色。
[0041] GC检测反应进度，GC条件为：初始温度100°C，每分钟升高KTC，终温280°C。
[0042] 实施例1羰基还原酶基因的克隆
[0043] 根据序列已知的S. albus的3-oxoacyl-ACP还原酶（氨基酸序列见SEQ ID No: 1) 进行序列合成，得到了相应的DNA序列见SEQ ID N〇:2。将该基因克隆到pET28a的NdeI/ HindIII位点，构建出相应的表达质粒pABI-ADH-SA，对该质粒进行PCR和电泳验证，所用的 引物见SEQ ID No:3和4。转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到相应的重组菌株 sABI-ADH-SA。
[0044] 实施例2重组羰基还原酶的表达
[0045] 将重组菌株sABI-ADH-SA接种至含有卡那霉素的LB摇瓶37°C培养过夜，并将过夜 培养物按照5%的比例接种至IL LB摇瓶，37°C培养至0D6。。0. 6~0. 8,加入IPTG至终浓 度ImM，降温至30°C继续培养16小时。4000rpm离心收集菌体，用IOOmL PBS(pH 7. 5)缓冲 液重悬，超声破碎菌体，12000rpm离心30min，得到上清液即为粗酶液。
[0046] 酶活〇J)的测定方法是：在2mL反应液中，加入2mM苯乙酮作为底物，0.1 mM NADH 作为辅因子，再加入20yL粗酶液，测定1分钟内OD34。的降低量为AA34。。每mL酶液的比 酶活U = Δ A34qX 100(V(6220X20)，即每mL裂解液的比酶活力。
[0047] 酶活力的计算公式为：酶活力（U) = EWXVX103A6220X1);式中，EW为Imin 内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL ;6220为摩尔消光系数，单位L/ (mol · cm) ;1为光程距离，单位cm。
[0048] 羰基还原酶每单位酶活定义为在上述条件下，每分钟消耗1 μ mol NADH所需的酶 量。本实施例制备的重组羰基还原酶的酶活为25U/mg。
[0049] 每单位葡萄糖脱氢酶酶活定义为在上述条件下，每分钟催化还原1 μ mol NAD+所 需的酶量。
[0050] 实施例3前手性羰基底物的不对称还原反应
[0051]
[0052] 将40g喹啉-3-甲酸甲酯悬浮于500mL磷酸钠缓冲液，用饱和.0)3溶液调节 pH至6.0,加入实施例2制备的粗酶液200mL、葡萄糖100g和葡萄糖脱氢酶1000U(购自 sigma)、以及0. 2mmol/L的NAD+，添加磷酸钠缓冲液定容至1L，30°C搅拌反应24小时，饱和 似20) 3控制反应pH在6. 0左右，TLC检测反应进程。反应结束后调pH至2. 0,升温至70°C 加热1小时使蛋白质变性，加硅藻土过滤除去变性蛋白质，后调pH至13.0 ;等体积正丁醇 萃取2次，并用等体积正丁醇洗涤滤渣一次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂， 得到产物35. 5g，摩尔收率88%。
[0053] 通过核磁共振氢谱和ee值测定对产物结构进行确认：
[0054] 1H NMR (300MHz，CDCl3) : δ 8. 67-7. 42 (6H，m，Ar-H)，5. 86 (1H，s，-CH0H)，3. 24 (3H，s ，_αι3)，2· (Km，s，_oh)。
[0055] ee 值测定：ChiralpakAD_H 柱，正己烧：乙醇（0· I % DEA) = 90:10,0· 8mL/min， 220nm，Agilent 1260。
[0056] 实施例4-12前手性羰基底物的不对称还原反应
[0057] 参照实施例3的方法，结合表1中的参数，进行实施例4-12的化合物的制备。其 中，当反应体系中使用NAD+时，NAD+与粗酶液同时加入反应体系中。
[0058] 表1羰基还原酶催化前手性羰基底物发生不对称还原反应
【主权项】
1. 一种羰基还原酶，其是如下（a)或（b)的蛋白质： (a) 由SEQIDNo: 1所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有 羰基还原酶活性的蛋白质。2. 编码权利要求1所述的羰基还原酶的分离的核酸。3. 根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQIDN〇:2所示的核苷酸序列组成的。4. 包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体选自质粒、粘粒、 噬菌体或病毒载体。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体为pET28a。7. -种包含权利要求4~6所述的重组表达载体的重组表达转化体，其特征在于通过 将权利要求4~6任一项所述的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。8. 根据权利要求7所述的重组表达转化体，其特征在于所述的宿主细胞为大肠杆菌 (E.Coli)，更优选大肠杆菌BL21 (DE3)。9. 一种重组羰基还原酶的制备方法，包括培养权利要求7或8所述的重组表达转化体， 以及从所述培养物中获得重组羰基还原酶。10. -种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物的催化剂， 其是权利要求7或8所述的重组转化体的培养物，或通过将所述培养物离心分离后得到的 转化体细胞或者用所述转化体细胞加工的制品；优选地，所述的加工的制品是由转化体细 胞得到的提取物、或通过对提取物中的羰基还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品， 或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。11. 权利要求1所述的羰基还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组羰基还原酶或权 利要求10所述的催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合 物中的应用。12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物为芳基酮类化 合物。13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的芳基酮类化合物选自 丁，X表示被卤素、烷基、烷氧基、羟基或取代烷基中的任一取代基取代； R选自H、C1~C8支链或直链烷基或含有2~8个碳原子的酯基； Y为H、C1~C4烷基或含有2~8个碳原子的酯基； Z为酰胺或含有2~8个碳原子的酯基。14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于所述的芳香酮类化合物为其中，R选自H、Cl~C8支链或直链烷基或含有2~8个碳原子的酯基； R'为H或C1~C4烷基； R"为C1~C8支链或直链烷基或羟基或C1~C8支链或直链烷氧基。15. 根据权利要求11~14任一项所述的应用，其特征在于所述的应用包括如下步骤： 在pH为5. 0~8. 0的水溶液中，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的存在下，在权利要求1所述的 羰基还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组羰基还原酶或权利要求10所述的催化剂催 化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。16. 根据权利要求15所述的应用，其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度为 10~1000g/L;所述的羰基还原酶、重组羰基还原酶或催化剂的用量为1~100U/L;所述的 葡萄糖脱氢酶的用量为100~1000U/L;所述的葡萄糖的用量为50~100g/L。17. 根据权利要求16所述的应用，其特征在于不对称还原反应液中含有0~1.Ommol/ L的麵+〇18. 根据权利要求15~17任一项所述的应用，其特征在于所述的不对称还原反应在振 荡条件下进行，反应温度为20~40°C。
【专利摘要】本发明提供了一种新的羰基还原酶及利用重组羰基还原酶进行不对称还原的方法。相对于其它酶催化的不对成酮还原反应，该酶具有宽泛的底物选择性，可以催化苯环、萘环、吡啶、苯并吡啶等多种取代芳香酮的还原，在催化浓度高达100g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达99%以上,使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。
【IPC分类】C12N9/04, C12P7/02, C12N15/53, C12N1/21, C12N15/70
【公开号】CN105018439
【申请号】CN201510256297
【发明人】罗煜, 丁时澄, 瞿旭东, 田振华
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年5月19日