专利名称：3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物的抗肿瘤用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种三萜类化合物的抗肿瘤用途，具体涉及3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404的用途。
背景技术：
本发明使用的3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物由药用植物三七提取获得，其化学结构式如下
三七是中国的特有药用植物，且仅产于我国的西南部，当地民间发掘使用源远流长。中医学认为，三七性温味甘微苦，入肝、胃、大肠诸经，可治疗各种出血症。三七，这一被人们认识晚于人参1000年的后起之秀，享有“中药之最珍贵者”的美誉。
三七(Panax Notoginseng)为五加科植物，干燥的根入药，又称田七、岑三七等，主产于云南、广西等地。其主要药理活性成分为人参皂苷和独有的三七皂苷R1，R2等。主要功用为化淤止血，消肿止痛。三七作为抗凝剂在心脑血管疾病方面的研究比较多，近年来发现三七具有多种抗肿瘤活性，其中包括对肿瘤细胞的直接抑制作用(尚西亮等.三七总皂苷对人肝癌细胞的抑制作用.中国临床康复，2006，10(23)121；吴映雅等.三七总皂苷丹参注射液苦参碱对大鼠肝癌细胞CBRH-791生长的抑制作用.辽宁中医杂志，2005，32(10)1010；李晓红等.三七皂苷对NB4细胞促凝活性及诱导分化的影响.中国中西医结合杂志，2004，24(1)63；王志斌等.三七提取物对GES-1细胞及MNNG转化后GES-1细胞增殖的抑制作用.中西医结合学报，2004，2(6)445；黄清松等.三七皂苷Rg1抗突变和抗肿瘤研究短篇论著.临床和实验医学杂志，2006，5(8)1124)、促癌细胞凋亡(黄清松等.三七皂苷Rg1抗突变和抗肿瘤研究短篇论著.临床和实验医学杂志，2006，5(8)1124；王国俊等.三七皂苷R1诱导HL260细胞凋亡的初步研究.四川生理科学杂志，2004，26(1)14；Darzynekiewicz Z et al.Featuresof apoptotic cell measured by flow cytometry.Cytometry.1992，3(8)795；李军祥等.三七提取物对MNNG转化后GES-1细胞的促凋亡作用.中西医结合学报，2005，3(2)123)、诱导癌细胞分化、逆转肿瘤细胞多药耐药(张晓丽等.P-糖蛋白多药耐药机制及其逆转剂的研究进展.中国医学文摘-肿瘤学，2005，19(2)147；史曦凯等.人参皂苷单体Rb1对多药耐药细胞系K562/HHT的耐药逆转作用.第三军医大学学报，1999，21(11)825)及抗肿瘤转移(许军等.三七总皂苷干预血栓形成研究概况.云南中医中药杂志，2003，24(5)46；倪启超等.结直肠癌肝转移临床与实验的防治研究.南通医学院学报，2004，24(1)5)等方面。近年来，已报道的有关三七中分离到的化合物抗肿瘤活性研究的文献未见以三萜类化合物作用于胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404的抗肿瘤活性作用及诱导凋亡的反应的报道。
发明内容
本发明的目的是将3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物应用于抑制癌细胞，具体用于抑制胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404的细胞增殖。
本发明使用的3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物(以下简称化合物A)，以药用植物三七(Panax Notoginseng)为原料提取获得，制备方法如下 称取三七(Panax Notoginseng)块根5kg，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，滤去不溶物，蒸干提取液，将浸膏悬乳分散在冷水中，浸膏分为水溶性和脂溶性两部分。取脂溶性提取物经洗脱液石油醚-丙酮(10∶3)，过200-300目的硅胶柱；然后，经洗脱液正己烷-丙酮(10∶1)反复硅胶(10-40μm)分离，最后通过HPLC分离，得到化合物A。
1.化合物A的抗肿瘤活性检测方法 (1)称取化合物A 2mg，用DMSO预溶，加入生理盐水溶解至供试浓度，抽滤后备用。所述供试浓度分别为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.65μg/mL，0.83μg/mL，0.42μg/mL。
(2)根据MTT法检测化合物A对胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404的抑制活性。
(3)根据供试浓度抗肿瘤活性抑制率值，通过曲线回归方程，计算IC50值。
2.化合物A的诱导凋亡检测 根据凋亡细胞DNA提取试剂盒说明提取细胞DNA，并用TE溶解。取20MlDNA上样于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
3.化合物A对细胞凋亡相关基因Bax的作用检测。
(1)细胞接种后24h，分别加入化合物A至50μg/mL。
(2)培养24h，然后以胰酶消化液5mL消化、于离心机上1000rpm/min离心5min后收集细胞。
(3)根据RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明将提取的细胞总RNA反转录为cDNA，备用。
(4)利用设计的Bax基因引物和β-actin内参基因引物，根据荧光定量PCR试剂盒说明进行实时定量PCR。所述Bax基因引物；Bax正向引物为5′-CGAGTGGCAGTGACATGT-3′，Bax反向引物为5′-TCTTCTTCCAGATGGTGAG-3′。所述β-actin内参基因引物；β-actin正向引物为5′-CCAAGGCCAACCGCGAAGATG-3′，β-actin反向引物为5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCA-3′。
(5)根据以下公式计算结果 实验组目的组基因的表达相对于对照组基因的表达的变化倍数＝2-[(Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因)] 本发明的试验证明，化合物A能抑制肿瘤细胞株的生长，在以人胃癌细胞株和肝癌细胞株为靶细胞的抗肿瘤活性试验中，化合物A的半数致死量IC50值分别为29.62μg/mL和0.46μg/mL，表明化合物A可用于制备抗肿瘤药物。
通过电泳检测，化合物A能够诱导肝癌细胞株产生凋亡。更进一步地通过实时定量PCR试验证明，化合物A诱导细胞凋亡的主要原因是通过促进细胞凋亡相关基因Bax表达量的增加来实现的，这是对上述抗肿瘤活性试验的进一步证明。
上述试验表明化合物A用于抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404细胞增殖，效果明显。可用于制备抗肿瘤药物；电泳检测表明，化合物A可以用于促进肝癌细胞BEL-7404凋亡。荧光定量PCR实验证明，化合物A可以促进凋亡相关基因Bax表达量增加。具体表述为化合物A诱导细胞凋亡的主要原因是通过基因水平促进细胞凋亡相关基因Bax表达量的增加来实现。
本发明的有益效果 (1)本发明的试验证明，通过MTT法检测化合物A的抗肿瘤活性，具有抑制胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404细胞增殖的活性，能够抑制胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404的生长。
(2)化合物A的半数致死量IC50值分别为29.62μg/mL和0.46μg/mL，尤其是其对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量IC50值与抗肿瘤临床用药5′-氟脲嘧啶对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量IC50值相当，比抗肿瘤临床用药顺铂对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量IC50值还低。
(3)化合物A诱导肝癌细胞凋亡效果明显，具有诱导肝癌细胞系BEL-7404凋亡的作用，同时可以促进凋亡相关基因Bax上调，是可以用作抗肿瘤药物的先导化合物。可以用于制备抗肿瘤药物。
(4)本发明涉及的化合物A由药用植物三七提取获得，原材料充足，成本较低。
(5)本发明涉及的化合物A结构复杂，结构中手性碳较多，人工合成相对麻烦。
由天然产物中分离获得该类化合物是比较简捷的途径。
图1为化合物A诱导肝癌细胞BEL-7404凋亡DNA电泳图。其中，左图为正常肝癌细胞株的DNA电泳图；图中，第一泳道为DNA Marker，第二、三、四泳道分别为正常肝癌细胞BEL-7404培养12h、24h和48h后的DNA样品。右图为化合物A作用于肝癌细胞凋亡DNA电泳图；所述化合物A的浓度为50μg/mL。图中，第一泳道为DNA Marker，第二、三、四泳道分别为化合物A作用于肝癌细胞BEL-7404培养12h、24h和48h后的DNA样品。
具体实施例 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例一化合物A的制备 1.制备方法 称取三七块根5kg，粉碎后55℃下用70％乙醇回流提取3次，滤去不溶物，合并提取液，在38℃条件下真空减压浓缩得浸膏，将浸膏悬乳分散在冷水中，浸膏分为水溶性和脂溶性两部分。取脂溶性提取物经洗脱液石油醚-丙酮(10∶3)，过200-300目的硅胶柱；然后，经洗脱液正己烷丙酮(10∶1)反复硅胶(10-40μm)分离，最后通过HPLC分离，得到化合物A。
2.试验结果 化合物A为固体，粉末状，试验数据如下 [α]24+41.2°(CHCl3 c 0.58)；IR3100(C-H)，1710(C＝O)1610(C＝C)，1384和1359cm-1；EI-MS m/z442[M]+(C30H50O2)(6)，427[M-CH3]+(22)，218(100)，205(25)，109(37)。1H NMR CDCl3(400MHz)δ5.40(qt，J＝6.9，1.2Hz，H-22)，5.17(t，J＝3.8Hz，H-12)，2.48(m，H-2)，2.32(m，H-2)，2.27(m，H-23)，1.62(d，J＝1.2Hz，H-21)，0.88(s，H-30)，0.87(s，H-29)，0.86(s，H-28)，0.85(d，J＝6.5Hz，H-27)，0.84(s，H-19)，0.83(d，J＝6.9Hz，H-26)，0.82(s，H-18)；13C NMR CDC13(75MHz)δ39.8(C-1)，34.1(C-2)，217.5(C-3)，47.3(C-4)，55.3(C-5)，19.7(C-6)，34.9(C-7)，40.2(C-8)，49.9(C-9)，36.6(C-10)，22.0(C-11)，25.4(C-12)，42.3(C-13)，50.4(C-14)，31.1(C-15)，27.1(C-16)，49.7(C-17)，15.9(C-18)，15.2(C-19)，75.1(C-20)，24.7(C-21)，40.5(C-22)，22.5(C-23)，124.7(C-24)，131.3(C-25)，25.7(C-26)，17.5(C-27)，26.5(C-28)，21.2(C-29)，16.3(C-30)。
实施例二MTT法检测化合物A抗肿瘤活性试验 1.材料 1.1培养基类 RPMI 1640(Gibco BRL)，小牛血清(杭州四季青)，青链霉素(Sigma)，胰蛋白酶(北京天象人生工)。
1.2溶剂及溶液类 MTT(厦门鹭隆生物公司)，DMSO(国产分析纯)。
1.3细胞株人胃癌细胞株SGC-7901，人肝癌细胞株BEL-7404。
2.操作步骤 消化后的单细胞悬液，计数后细胞按180μL/孔，接种于96孔平底培养板中，37℃下于CO2培养箱中培养过夜，按不同浓度加入经细菌过滤器处理后的化合物A溶液及标准品溶液20μL/孔，培养3天。倒去培养液用PBS清洗。加MTT(0.2mg/L)200μL/孔，放入CO2培养箱37℃培养4h。除去MTT，加入DMSO-甘氨酸缓冲液，摇床摇0.1-0.5h(细胞看不见为止)。设置λ＝570nm，酶标仪测定OD值(即此波长下的吸光度)。每个96孔板设阳性对照、阴性对照及空白对照。阳性对照加入50μg/mL的5′-氟脲嘧啶，阴性对照加入培养液。两种对照在边缘和中间各设三孔，以防边缘效应。空白对照设在右上角第一个孔。按下式计算抑制率
抗癌药物活性以IC50衡量，IC50是抑制率为50％时的样品浓度。
3.试验结果 试验结果如表1所示，化合物A的半数致死量IC50值分别为29.62μg/mL和0.46μg/mL，尤其是其对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量IC50值与抗肿瘤临床用药5′-氟脲嘧啶对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量IC50值相当，比抗肿瘤临床用药顺铂对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量IC50值还低。因此，化合物A具有较强的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。
表1化合物A的抗肿瘤活性IC50值
化合物A和标准品5′-氟脲嘧啶按照浓度梯度依次稀释为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.13μg/mL，1.65μg/mL，0.83μg/mL，0.42μg/mL。
表1中，a为化合物A对胃癌细胞系SGC-7901的IC50值，b为化合物A对肝癌细胞系BEL-7404的IC50值。IC50值代表平均值±标准差，平行试验重复三次。
实施例三化合物A诱导肝癌细胞凋亡的检测 1材料 凋亡细胞DNA提取试剂盒(TaKaRa)。
细胞株人胃癌细胞株SGC-7901，人肝癌细胞株BEL-7404。
2操作步骤 (1)细胞接种，培养24h后加入化合物A至50μg/mL。
(2)继续分别培养12h，24h，48h后以胰酶消化液消化细胞，于离心机上1000rpm/min离心5min后收集试验组及对照组细胞。
(3)根据凋亡细胞DNA提取试剂盒说明提取细胞DNA，并用TE溶解。
(4)取20μL DNA上样于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
3试验结果 如图1所示，左图中正常肝癌细胞DNA在培养12h、24h和48h后，DNA片段是完整的。而右图中肝癌细胞经50μg/mL的化合物A作用12h时，就开始出现DNA降解的现象，在24h时，DNA降解程度加强，到48h时，DNA降解程度最强。即DNA降解的现象随时间的增加逐渐增强。而DNA成片段化降解是DNA凋亡的一个重要特征。因此，我们确定化合物A对肝癌细胞的活性，主要是通过诱导肝癌细胞凋亡产生的，而且此现象至少出现于化合物A作用于细胞12h的时候。
实施例四化合物A对凋亡相关基因Bax的作用 1材料 RNA提取试剂盒(TaKaRa)，反转录试剂盒(TaKaRa)，SYBR PremixEx Taq荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)。
引物 Bax正向引物5′-CGAGTGGCAGTGACATGT-3′，Bax反向引物5′-TCTTCTTCCAGATGGTGAG-3′. β-actin正向引物5′-CCAAGGCCAACCGCGAAGATG-3′，β-actin反向引物5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCA-3′。
2操作步骤 (1)细胞接种，培养24h分别加入化合物A至5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL。
(2)继续培养24h，然后后以胰酶消化液消化细胞、于离心机上1000rpm/min离心5min离心收集试验组和对照组细胞。
(3)根据RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明将提取的细胞总RNA反转录为cDNA，备用。
(4)利用设计的Bax及β-actin(内参基因)基因引物，根据荧光定量PCR试剂盒说明使用SYBR Green I嵌合荧光法于ABI系列7700荧光仪上进行实时定量PCR反应，反应条件如下94℃ 4min 1个循环，94℃ 20s，40个循环，60℃ 30s，40个循环。
(5)试验数据分析采用以下方法 实验组目的组基因的表达相对于对照组基因的表达的变化倍数＝2-[(Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因)] 3试验结果 如表2所示，当化合物A浓度为5μg/mL时，Bax基因的表达量与正常肝癌细胞中的Bax基因表达量相当。当浓度升高时，Bax基因的表达量是逐渐上调的，当化合物A浓度为5μg/mL和10μg/mL时，Bax基因的表达量分别相当于正常细胞的4.16倍和4.15倍。表明一定浓度的化合物A可以通过增加肝癌细胞Bax基因的表达量来实现诱导细胞凋亡的主要过程。因此，化合物A可以作为抗肿瘤药物的先导化合物来开发利用。
表2化合物A对肝癌细胞系BEL-7404凋亡相关基因Bax表达量的作用
表2中，a为正常肝癌细胞BEL-7404中基因Bax的表达量，即未加化合物A和5′-氟脲嘧啶时肝癌细胞BEL-7404中基因Bax的表达量；b、c、d分别为化合物A和5′-氟脲嘧啶在浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL时，对肝癌细胞BEL-7404中基因Bax的表达量。基因表达量表示为平均值±标准差，平行试验重复三次。
权利要求
1、一种如下式所示的3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物的用途，其特征在于用于抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404细胞增殖。
2、如权利要求1所述的3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物的用途，其特征在于用于促进凋亡相关基因Bax表达量增加，并促进肝癌细胞BEL-7404凋亡。
全文摘要
本发明涉及3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404的用途。试验表明3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物用于抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404细胞增殖，效果明显，可用于制备抗肿瘤药物。电泳检测表明，3-羰基-20α-羟基-24-烯-达玛烷化合物可以通过促进凋亡相关基因Bax表达量的增加，促进肝癌细胞BEL-7404凋亡。
文档编号A61P1/00GK101569631SQ200910111979
公开日2009年11月4日 申请日期2009年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者欧阳明安, 硕 沈, 吴祖建, 谢联辉 申请人:福建农林大学