专利名称：促进载体和插入片段连接的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体而言涉及一种通过插入片段的去磷酸化促进载体和插入片段连接的方法。
背景技术：
DNA片段的酶切连接，载体的构建最常用和经典的方法是通过限制性内切酶对载体和插入片段进行酶切，然后利用T4DNA连接酶将载体与目的片段连接成我们想要的DNA 片段。碱性磷酸酶在这个过程当中常被用做去磷酸化载体DNA 5’端磷酸基团，从而防止载体自身的连接。而插入片段与载体的连接其实是先由两片段连接成为一条线状DNA，然后在连接为环化DNA，这只是我们期望的情况，连接体系中还存在插入片段与插入片段的连接，载体与载体的连接，而这种情况DNA无法环化，无法用抗性筛选出来，单这些连接都是我们不期望的，且会降低我们期望的载体与插入片段连接后环化的情况。因此，如何提高载体与插入片段之间连接是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对目前载体与插入片段连接效率不高的缺陷，本发明提出通过插入片段的去磷酸化促进载体和插入片段连接。为了实现本发明的目的，采用如下技术方案本发明一方面涉及载体和插入片段连接的方法，包括如下步骤(1)使用限制性内切酶处理插入片段，然后使用碱性磷酸酶处理酶切片段；(2)使用相应的限制性内切酶处理载体；(3)酶切载体以及碱性磷酸酶处理的插入片段通过DNA连接酶连接。在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体是pPic9K。在本发明的另一个优选实施方式中，所述的插入片段是米曲霉M16家族金属蛋白酶基因M036。在本发明的另一个优选实施方式中，上述步骤(1)和步骤O)中的限制性内切酶为相同的酶，优选是EcoRI和NotI的组合。在本发明的另一个优选实施方式中，上述DNA连接酶是T4DNA连接酶。本发明另外一方面还涉及碱性磷酸酶处理的插入片段在促进载体和插入片段连接中的用途。出人意料的，本发明载体和插入片段连接的方法可以显著提高插入片段和载体的连接效率。
图 1 第一道为 DNA marker 15000 (tiangen), V V_ap I I_ap 分别代表酶切后处理最终胶回收得到的未处理载体片段，碱性磷酸酶处理的载体片段，未处理的插入片段，碱性磷酸酶处理的插入片段。每孔均加入了5微升对应胶回收片段溶液。从图中可以看出V 和V-ap的浓度一致，I和I-ap的浓度一致。
具体实施例方式实施例1:实验材料载体pPic9K，插入片段米曲霉M16金属蛋白酶家族基因，限制性内切酶EcoRI 和NotI来源于Fermentas公司，碱性磷酸酶购自TAKARA的CIAP，T4 DNA Ligase购自 Fermentas公司，胶回收试剂盒及大肠杆菌Dffia感受态，Taq mix购自Tiangen。实验步骤1.制备载体片段和插入片段载体3yg pPic9K通过EcoRI和NotI双酶切后，平分为两份，一份加入碱性磷酸酶 CIAP buffer及CIAP，一份只加入CIAP buffer，37°C处理1小时，分别回收处理和未处理的载体DNA片段约9000bp，并通过DNA浓度测定和凝胶电泳检测，保证经碱性磷酸酶处理和未处理的载体片段的浓度被稀释成相同浓度，分别将处理和未处理载体片段命名为V-ap和 V。插入片段米曲霉M16家族属蛋白酶基因cDNA约1800bp通过PCR扩增，20μ g PCR 产物直接用EcoRI和NotI双酶切，产物平分为两份，分别如载体一样用CIAP处理和不处理，然后分别胶回收ISOObp目的片段，并保证两组插入片段的浓度一致，CIAP处理和未处理插入片段分别命名为I_ap和I。2. T4DNA连接酶连接按照相同的比例，构建四组连接V-ap+1-ap ；V-ap+I ；V+I ；V+1-ap连接在PCR仪中进行，16°C连接过夜。3.转化DH5a感受态，通过克隆数确认连接效率4只100 μ 1大肠杆菌Dffia感受态细胞混合后，按照每管90ul的量分别分装到冰上的0. 5ml EP管中，然后分别加入4组连接产物，按照冰上30mins，42度热击90s，冰上2 分钟，加入无抗性LB 37度摇床培养1小时后，分别涂布于同批次IOcm amp抗性的固体LB 平板上筛选阳性克隆。通过克隆的多少反映载体与插入片段的连接效率，实验结果如表1 所示。表1载体与插入片段的连接效率
权利要求
1.载体和插入片段连接的方法，包括如下步骤(1)使用限制性内切酶处理插入片段，然后使用碱性磷酸酶处理酶切片段；(2)使用相应的限制性内切酶处理载体；(3)酶切载体以及碱性磷酸酶处理的插入片段通过DNA连接酶连接。
2.根据权利要求1所述的载体和插入片段连接的方法，所述的载体是PPic9K。
3.根据权利要求1所述的载体和插入片段连接的方法，所述的插入片段是来源于米曲霉蛋白酶M16家族中的金属蛋白酶基因。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的载体和插入片段连接的方法，步骤(1)和步骤 (2)中的限制性内切酶为相同的酶，优选是EcoRI和NotI的组合。
5.根据权利要求4所述的载体和插入片段连接的方法，上述DNA连接酶是T4DNA连接酶。
6.碱性磷酸酶处理的插入片段在促进载体和插入片段连接中的用途。
全文摘要
本发明公开了载体和插入片段连接的方法，包括如下步骤(1)使用限制性内切酶处理插入片段，然后使用碱性磷酸酶处理酶切片段；(2)使用相应的限制性内切酶处理载体；(3)酶切载体以及碱性磷酸酶处理的插入片段通过DNA连接酶连接。通过本发明载体和插入片段连接的方法可以显著提高插入片段和载体的连接效率。
文档编号C12N15/66GK102517316SQ20111036041
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者单志, 吴琦, 唐自钟, 廖 燕, 王德华, 陈惠 , 韩学易 申请人:四川农业大学