专利名称：一种花药特异表达启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种花药特异表达启动子及其应用。
背景技术：
人类通过对自然突变基因和重组体的选择与利用，对作物的品种进行改良已有近千年的历史。近百年来，通常采用人工杂交的方法，实现优良基因的重组和外源基因的导入培育作物新品种。杂交育种技术能够实现种内基因转移，但是，亲缘关系较远的品种之间的基因转移则存在障碍；另一方面，杂交育种技术不能准确选择和操纵某个基因，因此，增加了育种结果的复杂性。通过转基因的手段进行作物品种的选育，其优势在于转基因不受生物体间亲缘关系的限制，从转基因的技术角度来讲，候选转化的基因来源几乎不受限制；因此，本发明人可以通过转基因的手段聚合各种有效基因，培育高产、优质、抗逆的作物新品种。另一方面， 转基因技术所操作和转移的基因是功能明确、控制目标性状的基因，因此，转基因后代的表型更具有可预见性。目前，转基因技术已经成为作物品种改良的重要手段，转基因大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积已达4种作物全球总种植面积的25% (James, 2005 ；Sankula et al.，2005)。在植物的转基因中需要两个必需的元件，即启动子和目的基因。启动子是位于基因转录起始位点上游的顺式调控序列，与反式作用的识别因子结合，通过识别因子与RNA 聚合酶的相互作用，启动基因的转录；因此，启动子调控基因的表达模式，即目的基因表达的时空特异性及表达的强度，是转基因成败或成效高低的关键因素之一。针对转基因的目的不同，转化的基因选择不同的表达模式，主要包括组成型高表达、组织特异性表达及诱导型表达等。如在棉花、玉米、水稻等农作物中转入苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的抗虫蛋白采用的是组成型高表达的方式，在作物中高剂量表达Bt抗虫蛋白的优势在于高剂量可以确保杀虫的效果，同时有利于延长Bt抗虫蛋白的有效期。在金稻谷(Golden rice)的创制过程中，其目标是通过在水稻胚乳中引入了维生素A前体的合成途径，从而在稻米中强化维生素A，解决维生素A营养缺乏的问题；因此，转基因时采用的启动子为在水稻胚乳中特异表达的谷蛋白启动子。在植物抗病基因的转化中，常采用病原菌诱导表达的启动子。随着转基因农作物在全球的大面积推广，启动子在转基因中的重要性得到广泛的共识，本发明人需要不同类型的启动子帮助本发明人提供转基因表达模式的解决方案。例如，在水稻组织特异启动子的研究领域中，人们最为关注的是花药特异的启动子。水稻花药是水稻雄性配子花粉产生的器官，与水稻穗的发育、育种及水稻的产量等密切相关。因此，本领域需要进一步研究植物花药特异性表达的启动子，以用于在花药中特异性表达一些功能基因或结构基因，达到品种改良的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种花药特异表达启动子及其应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸(启动子)，所述的多核苷酸(a)位于 osigcfa001gl2 基因(GenBank 登录号CT833313)的 5，端及其上游；
(b)碱基长度为200-2000个；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且(d)具有在植物花药中特异表达功能。在本发明的一个优选例中，所述的OSigCfa001gl2基因来源于禾本科植物；更佳地来源于水稻(Oryza Sativa)。在本发明的一个优选例中，(a)中，位于OSigCfa001gl2基因上游-1000至编码区第100位。在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸是(I)SEQ ID NO 1中第1-521位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2) SEQ ID NO 1中第1_552位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(3) (1)或(2)任一限定的多核苷酸，其中第1-22位碱基缺失(即=SEQ ID NO 1 中第23-552位所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID NO 1中第23-521位所示的核苷酸序列的多核苷酸)；(4)由SEQ ID NO :1中(1_22) (521-552)位所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；(6)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)-⑷任一限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸；(7)核苷酸序列与(1)44)任一限定的多核苷酸序列有80%以上(较佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上；)同源性且具有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸；或(8)核苷酸序列与(1)-⑷任一限定的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸。在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸是基于SEQ ID N0:1中第1_521位或SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第436-442位、第146-153位、第278-283, 第305-311位和/或第观7-312位Q6bp)核苷酸序列不变，其它位点与(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列具有50% (较佳地60% ；更佳地70% ；更佳地80% ；更佳地90% ；更佳地 95% ；更佳地99%)以上相同性的，且指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸。在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸是基于SEQ ID NO 1中第1_521位或 SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第99-104位、第115-120位和/或第131-138 位核苷酸序列不变，其它位点与(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列具有50% (较佳地60%; 更佳地70% ；更佳地80% ；更佳地90% ；更佳地95% ；更佳地99% )以上相同性的，且具有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸。在本发明的另一优选例中，所述的植物是单子叶植物。在本发明的另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)禾本科植物、石蒜科植物、百合科植物、鸢尾科植物、或薯蓣科植物等。
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更优选的，所述的植物是禾本科植物。例如所述植物包括但不限于水稻、小麦、大
麦、玉米、高粱等。在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于指导目的基因在植物花药中特异表达。在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸，作为启动子元件。在本发明的一个优选例中，所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)细胞毒基因 (Cytotoxic gene)，如来自于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖核酸酶(Barnase)基因或者连接来自于曲霉菌(Aspergillus oryzae)的核糖核酸酶Tl (RNase Tl)基因；拟南芥中影响花药绒粘层功能及花粉形成的DYTl基因，ABORTED MICROSPORE 基因(AMS)及MALE STERILITY 1基因(MSl)等；水稻中影响绒粘层功能及花粉形成的 MULTIPLE SP0R0CYTE1 基因(MSPl)，0sTDLlA 基因，UNDEVELOPED TAPETUM 基因(OsUDTl)及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION 基因(OsTDR)等。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且与所述多核苷酸的间隔小于1000bp。优选的，小于500bp ；更优选的，小于IOObp ；最优选的，小于 50bp。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；或其基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种使目的基因在植物花药中特异表达的方法，所述的方法包括将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有所述的多核苷酸以及与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞；和
将所述植物细胞再生成植株。在本发明的另一优选例中，所述的方法包括(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的多核苷酸以及与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因；(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞。在本发明的另一优选例中，所述方法还包括(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及(d)将步骤(C)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了 PCR扩增潮霉素序列(转基因载体中用于抗性筛选的基因)，鉴定转基因水稻苗中是否含有T-DNA插入的电泳结果。M，DNA Marker DL2000 (DNA分子量标准)； 1-12代表来自于不同转基因系(lines)的不同转基因植株的鉴定结果。图2显示了启动子转基因水稻中各不同组织⑶S报告基因染色的结果。其中A，水稻幼穗中的⑶S染色；B,水稻颖花中的⑶S染色；C，与图B为同一阶段，将颖花的两片颖壳(内颖与外颖)剥开来，箭头所指的为特异染成蓝色的花药组织；D，水稻颖花中的⑶S染色；a，花药；s，柱头；o，子房。E，开花后的颖花的⑶S染色；F，与图E为同一阶段，将颖花的两片颖壳剥掉，显示雄蕊及雌蕊的染色；a，花药； s，柱头；O，子房。G，与图E为同一阶段，放大的花药部分，显示花药染色；H，与图E为同一阶段，显示花粉染色；I，根的⑶S染色；J，叶片的⑶S染色；K，叶鞘、叶舌、叶耳的⑶S染色；L，茎的⑶S染色；图中，G、H中的标尺为100 μ m,其它图中的标尺均为1mm。图3显示了花药切片中⑶S染色结果，蓝色表明⑶S染色为阳性。A，花药；T，绒粘层；L 颖壳；E，表皮；MC，减数分裂的细胞。图4显示了⑶S基因在穗中特异高表达的定量结果的柱形图。图5、Ml启动子转基因水稻中各不同组织⑶S报告基因染色的结果。A，根的⑶S染色；B，叶片的⑶S染色；C，叶鞘、叶舌、叶耳的⑶S染色；D，茎的⑶S 染色；E，花的GUS染色。图中的标尺均为1mm。图6、M2启动子转基因水稻中各不同组织⑶S报告基因染色的结果。A，根的⑶S染色；B，叶片的⑶S染色；C，叶鞘、叶舌、叶耳的⑶S染色；D，茎的⑶S 染色；E，花的GUS染色。图中的标尺均为1mm。图7、M3启动子转基因水稻中各不同组织⑶S报告基因染色的结果。A，根的⑶S染色；B，叶片的⑶S染色；C，叶鞘、叶舌、叶耳的⑶S染色；D，茎的⑶S 染色；E，花的GUS染色。图中的标尺均为1mm。图8、M4启动子转基因水稻中各不同组织⑶S报告基因染色的结果。A，根的⑶S染色；B，叶片的⑶S染色；C，叶鞘、叶舌、叶耳的⑶S染色；D，茎的⑶S 染色；E，花的GUS染色。图中的标尺均为1mm。图9、启动子及其截短形式的⑶S定量结果。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次分离到一个可在植物花药中特异性表达的启动子。所述的启动子可指导目的基因在植物花药中特异性高表达，而在植物的其它组织中低表达或不表达。术语如本文所用，所述的“植物”主要是指单子叶植物，包括(但不限于)禾本科植物、 石蒜科植物、百合科植物、鸢尾科植物、或薯蓣科植物等。更优选的，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接” 到该核酸序列上。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。如本文所用，“组织特异性启动子”又称“器官特异性启动子”，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。本发明中， 所述的“组织特异性启动子”是植物花药特异表达启动子。通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少10倍，优选至少高100倍，更优选至少高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子启动或指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于改良植物品质、性状或代谢相关的基因。合适的目的基因包括但不限于细胞毒基因(Cytotoxic gene)，如来自于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖核酸酶(Barnase)基因或者连接来自于曲霉菌(Aspergillus oryzae)的核糖核酸酶Tl (RNase Tl)基因；拟南芥中影响花药绒粘层功能及花粉形成的 DYTl 基因，ABORTED MICROSPORE 基因(AMS)及 MALE STERILITY 1 基因(MSl)等。水稻中影响绒粘层功能及花粉形成的MULTIPLE SP0R0CYTE1基因(MSPl)，OsTDLIA基因， UNDEVELOPED TAPETUM基因(OsUDTl)及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION基因(OsTDR)寸。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，所述的“SEQ ID NO 1中(1_22) (521-552)位所示的核苷酸序列” 也即指所述序列可起始于SEQ ID NO :1中第1位至第22中的任一位的碱基，终止于SEQ ID NO :1中第521位至第552位的任一位的碱基。启动子本发明提供一种花药特异性表达启动子，所述的启动子具有以下特点(a)位于 osigcfa001gl2基因的5，端及其上游；(b)碱基长度为200-2000个；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且(d)具有在植物花药中特异表达功能。本发明的启动子具有引发转录的必要位点及转录起始点，本发明人具体地研究了该启动子的发挥功能的关键位点，包括TATA盒(TATAAAT), CAAT盒 (CCAATGCA)，
E.-.享，(^序列及26bp 序列(CTGCTGCACAGGCTAAATCAAACACG)，这些位
点是本发明的启动子发挥启动基因表达功能以及发挥花药特异性表达功能的关键区域。作为本发明的一种实施方式，所述的启动子具有SEQ ID NO 1中第1_521位、第 1-552位、第23-552位所示的核苷酸序列。多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80% (例如85%、90%、95%、96%、97%、 98%、或99%)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。“严格条件”(或“严紧条件”)是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选60% 以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在花药中特异性表达的功能。本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有50%或以上(优选60%以上， 70%以上，80%以上，更优选90%以上，最优选95%以上，如98%、99% )相同性的核酸，所述核酸也具有指导目的基因在花药中特异性表达功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于水稻的该启动子及其功能，然而，来源于其它单子叶植物的与该启动子具有一定相同性(保守性)的启动子也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。启动目的基因表达本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)启动子，和目的基因。 如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白 (GFP)等。重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒 19S 和!35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的 CaMV、烟草 RB7 等。包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母； 植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。作为一种方式，制备转基因植物的方法是将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、小麦、拟南芥、烟草、果树等。在本发明的实例中，所述的重组载体是pCambia载体，其自带β -葡萄糖苷酶 (GUS)基因，将本发明的启动子构建到该载体中GUS基因的上游，转化植株，启动子将激活 GUS基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。葡萄糖苷酶(GUQ能催化裂解一系列的葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本技术领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。应用本发明的花药特异性启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。本发明可广泛应用于植物基因工程启动子作为植物基因工程中一个重要工具可与目标基因融合，通过转基因载体，转化植物并获得转基因植株。水稻花药特异启动子的应用价值，包括但不限于以下的方面a、利用水稻花药特异启动子创制水稻雄性不育系在水稻杂交育种的过程中需要雄性不育系(Male sterility)，人们利用雄性不育这一特性，免去了人工去雄的操作过程，从而节约了杂交育种的大量人力和时间。因此，雄性不育的植株具有重大的经济价值。利用水稻花药特异启动子可以创制雄性不育系。水稻花药特异启动子连接细胞毒基因(Cytotoxic gene)，如来自于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖核酸酶(Barnase)基因或者连接来自于曲霉菌(Aspergillus oryzae)的核糖核酸酶Tl (RNase Tl)基因，Barnase与RNase Tl基因在其表达的细胞中破坏细胞的正常发育，因此，借助于Barnase或者RNase Tl基因在花药中的特异表达，可以抑制花药的正常发育，从而获得水稻雄性不育系。b、利用水稻花药特异启动子控制转基因在田间的基因扩散目前，转基因田间控制的一个重要问题是转基因作物的飘粉问题。转基因花粉不受控制的传播会对周围环境中的其他物种造成基因污染，水稻花药特异启动子可以帮助解决这个问题。如上所述，将水稻花药特异启动子连接Barnase，一同转化水稻，这样得到的水稻转基因植株，不能形成正常的花粉；因此，避免了转基因植株的花粉对周围环境中其他物种造成的基因污染。C、利用水稻花药特异启动子研究影响水稻穗发育的重要基因，为增加农作物产量、改进品质、增加抗性提供优异的种源花药特异启动子调控基因在花药中特异表达，其表达部位集中在花药，在其他组织中不表达，或者表达量很低。与组成型启动子相比较，花药特异启动子的优势在于，它使得目的基因特异作用于花药器官，减少了对水稻其他组织可能的影响。为通过基因工程的方法进行水稻品种的改良提供重要的操作手段。
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下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、水稻组织特异启动子的筛选及基因表达的鉴定本发明人构建了水稻孕穗期的穗、14天幼苗的地上部分及根等组织的全长cDNA 文库(Liu, XH, Lu TT, Yu SL, Li Y, Huang YC. , Huang Τ. , Zhang L. , Zhu JJ, Zhao Q, Fan DL, Mu J, Shangguan YY, Feng Q, Guan JP, Ying K, Zhang Y, Lin ZX, Sun ZX, Qian Q, Lu YP, Han B. (2007)A collection of 10，096indica rice full-length cDNAs reveals highly expressed sequence divergencebetween Oryza sativa indica and japonica subspecies. Plant Mol Biol. 65 :403-415)。在每个文库分别进行2万个克隆的5，末端测序。在每个文库cDNA冗余度统计的过程中，本发明人发现每种组织的cDNA文库中都存在一些拷贝数很高的cDNA克隆。将每个文库中cDNA的拷贝数，按照从高到低排序，找出每个文库中cDNA拷贝数位于前20位的cDNA ；然后，统计这些cDNA在水稻其他组织的cDNA文库中的拷贝数，如果这些cDNA在其他组织的文库不出现，则这些cDNA成为组织特异性高表达启动子分离的候选基因。然后，本发明人在水稻孕穗期的穗、14天幼苗的地上部分以及根中，通过Real time RT-PCR的方法对候选基因表达的组织特异性进行鉴定，进一步确定候选基因。水稻花药特异启动子的克隆及水稻的转化通过候选基因全长cDNA序列与水稻基因组序列的比对，可以得到基因的上游调控区序列，即启动子序列。然后通过PCR方法克隆启动子序列，将启动子序列插入到pCambia1305. 2 (获自Cambia公司)表达载体(含⑶S 报告基因)的BamHI及NcoI位点间，常规农杆菌法转化水稻，通过检测转基因水稻中GUS 基因的表达来鉴定启动子的表达特性。实施例2、水稻花药特异启动子的筛选及基因表达组织特异性的鉴定通过对水稻穗全长cDNA文库中全长cDNA拷贝数的统计，本发明人得到了一个水稻穗特异表达基因的候选基因，osigcfa001gl2 (GenBank登录号CT833313)。然后，本发明人对OSigCfa001gl2在水稻孕穗期的穗、14天幼苗的地上部分及根中的表达进行Realtime RT-PCR的鉴定。以水稻组成型表达基因actinl作为参照基因，结果如表1。表中OSigCfa001gl2基因的表达量是相对于参照基因actinl的相对表达量。表1
基因名称根中表达幼苗中表达穗中表达-
osigcfaOO Ig 12 0.005_0.00141413.408上述结果表明，OSigCfa001gl2在穗中的表达非常高，而在水稻根及幼苗中表达非常低。OSigCfa001gl2是在穗中特异高表达的基因。
实施例3、水稻花药特异启动子的序列分析、启动子的克隆及转基因载体的构建osigcfa001gl2基因的启动子区序列及基因编码区序列如SEQ ID N0:1。其中方
框表示的是蛋白的起始密码子及终止密码子。加黑显示的为基因的编码区，阴影标示的为基因的5，UTR及3，UTR区。双下划线为TATA合(TATAAAT)及CAAT盒(CCAATGCA)。斜体加着重号为及^序列。5’端20个碱基为用于扩增启动子区的引物对应的位点。SEQ ID NO 1 ACCTCAGCCAAAACCGAAGACAGTACCGCCGAAGGACCTTATTTAAACGGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCATCGTACCCGGTTTTGCGACCGGGGACGAAAATCGGACTAGGTGATAAATAGAGGGACCCAAAGTG AACTTATA CCAATGCA. ATTTCATATCAAACAGTCACGGATGGGCTTTAGGAAAGCAGAACTGGGCCCGGCCCAGTAGATCACATAGCCCAACAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTTTCAACAAATTATCACACCGATTG CA TTTG CATCTGCTGCACAGGCTAAAT CAAA CA C GTAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATGACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC TATAAAT. ATTTGCATTGCACAAATCAAAAGTTTCC AAGTTTTAATCAGAGAAGTTCAAGATATCAGAAA
GAACAACACATACCAGGkTGlTCTCAGCTCAAGTCTTCTAGCCTG
GCTGCACTGCTGATCTTCCTCCTGGCAGTGTTCACCACTGCAGC
AGCAGCGGCAGGTACAGAATGCCAGAACGATGTCGAGGTGCTG
AAGACAACCTGCTACAAGTTCGTTGAGAAGGACGGGCCGAAGC
TGCAGCCATCACCTGACTGCTGCACCTCCATGAAGGGCGTCAA
CGTGCCCTGCGTCTGCACCTACCTGGGCAGCCCAGGCGTCAGG
GACAACATCAACATGGATAAGGTGTTCTATGTCACCAAGCAGTGTGGCATCGCCATCCCCGGGAACTGCGGAG GTGAGCAGGCTTCACTTGATTGGCCACACTGATCACCTGGGTAAGAACTGACAATAACACGCCGGCTCCTCTGGATTGCGACTTCCAGTGGGGCCCAGGTGTCGGTGTCAGCTGGGTAAGTTGGTGTCATCTGGTATGGGAAACTTTGATGTTTTGTACATGTGGTGGTGCTCTTGTCAACATTATATAGATAAGGAGAGAATAGGACAAACATGACGCTTGAATAGCAGAAGAGAAGTTCTATCCAGCAATATCAAAAGTACAGCTGTCATTTTCAAAAAATGTAAAACAAAAATAAAACGAAAAACCCACTATACTAGTGCCAATAAAAGAAGAAACAAAAGAGAACTACATTATTGTCAATGCCATTTGTTGATGTTATTATTACTTTTGTTTATAAGAATAACAATTGTACTTATAAGGCCTA_0] CGATTTATTACAG GATCC AAGGTCf^A AC A AG A ACTG ATTG ACT
TGGTGAAGTTGGCTGACAAAAGCAAGGCACCTAGCAGTTGCACGG CTGATATAGGTAAATAATGTTGGTCAACTTTTAGAGTACACGGATT GTACGTCAACCTTCAGCATGTTGTGATAACAAAATATGTATCAATG ATG本发明人选择的转基因载体为pCambial305. 2，克隆的酶切位点选择BamHI及 NcoI。pCambial305. 2通过BamHI及NcoI酶切，将载体中原有的35S启动子切掉，割胶回收得到载体片段。扩增的PCR片段内无BamHI切点，但是有NcoI切点。因此本发明人在设计的反向引物中加入BsaI切点，引物序列如下正向弓丨物ggatccacctcagccaaaaccgaaga(SEQ ID NO :2)；弓L :ggtctc ccatgg cagccaggctagaagacttg(SEQ ID NO 3)；BsaI的识别位点为ggtctc，酶切位点为其后的第1个及第5个碱基，因此，实际切点仍然为NcoI切点ccatgg。这样PCR产物经过BamHI及BsaI酶切后，可以与经过BamHI 及NcoI酶切的pCambia1305. 2连接，得到启动子转基因载体。需要说明的是，启动子与pCambia1305.2连接后，在⑶S蛋白编码序列前，本发明人引入了 OSigCfa001gl2基因N端的10氨基酸编码序列，因此，表达的⑶S蛋白是N端含有OSigCfa001gl2基因10个氨基酸的融合蛋白。融合蛋白不影响osigCfa001gl2启动子表达组织特异性的鉴定。实施例4、水稻的转化及转基因水稻中⑶S基因的表达鉴定本发明人通过农杆菌转化水稻幼胚的方法进行水稻的转化。启动子转基因载体转入农杆菌 EHA105 (参见 Hood, Ε. Ε.，Gelvin, S. B.，Melchers, L. S.和 Hoekema, Α.， Transgenic Res.，1993，2，208-218)，然后通过EHA105转化日本晴(获自中国水稻所)幼胚得到启动子的转基因植株。日本晴的幼胚首先经过次氯酸钠消毒，置于诱导培养基上诱导愈伤组织的产生。幼胚诱导产生的愈伤与农杆菌26°C、黑暗中共培养3天。然后，转入含有40mg/l潮霉素及300mg/l头孢霉素的筛选培养基上培养4个星期。筛选得到的抗性愈伤转入含有0. 5mg/l萘乙酸(NAA)，4mg/l激动素(kinetin)，6mg/l 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)， 40mg/l潮霉素，300mg/l头孢霉素的再生培养基，培养2-3个星期。之后，得到的再生小苗转入1/2MS生根培养基中进行生根培养。2-3个星期后，转基因苗移入人工气候室培养。通过水稻的转化，本发明人得到5-10个系(lines)的转基因植株进行启动子活性的鉴定。首先，转基因水稻进行T-DNA插入的鉴定。抽提转基因水稻苗的基因组DNA，以转基因水稻苗的基因组DNA为模板，PCR扩增潮霉素序列(转基因载体中用于抗性筛选的基因)，鉴定转基因水稻苗中是否含有T-DNA插入，见图1。PCR扩增阳性表明T-DNA插入为阳性。通常筛选得到的转基因水稻中基本上都含有T-DNA插入。实施例5、启动子转基因阳性植株的⑶S活性鉴定转基因植株的根、叶片、茎及花等组织浸于⑶S染色液中，37°C，过夜。第二天，70-75%乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后，在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。水稻⑶S染色液的组分为Na2HP04/NaH2P04(lM, pH7. 0)5ml;X-GlucIOOmg ；Triton X-1000.5ml;甲醇IOml ；灭菌水余量；总体积100ml。报告基因⑶S染色的结果图2显示的是启动子转基因水稻中各不同组织⑶S报告基因染色的结果。A，水稻幼穗中的⑶S染色。幼穗长约7mm，水稻颖花长约1mm。此时，颖壳是透明的，无染色；仅花药特异染色阳性。说明启动子调控基因在花药中特异表达。B，水稻颖花中的GUS染色。颖花长约3. 78mm，此时，颖壳无染色；花药特异染色阳性。C，与图B为同一阶段，本发明人将颖花的两片颖壳(内颖与外颖)剥开来，箭头所指的为特异染成蓝色的花药组织。D，水稻颖花中的GUS染色，颖花长约6. 53mm。颖壳无染色；雌蕊的柱头及子房无染色；雄蕊的花药特异染成蓝色。启动子调控基因在花药中特异表达。E，开花后的颖花，颖花长约6. 58mm。颖壳无染色，花药特异染色蓝色。F，与图E为同一阶段，将颖花的两片颖壳剥掉，显示雄蕊及雌蕊的染色。雌蕊的柱头无染色，在花柱的起始位置及子房的基部有淡的染色；花药染色为很强的阳性。G，与图E为同一阶段，放大的花药部分，显示花药为强的阳性。H，与图E为同一阶段，花粉染色为阳性。A-H显示的是颖花的GUS染色，在颖花发育的不同阶段(lmm-7mm)，均为花药特异表达。I，根的⑶S染色为阴性。J，叶片的⑶S染色为阴性。K，叶鞘、叶舌、叶耳的⑶S染色为阴性。L，茎的⑶S染色。节间的⑶S染色为阴性，节的⑶S染色为很淡的阳性。a，anther， 花药；s, stigma,柱头；o, ovary,子房。结论oSigCfa001gl2基因的启动子连接⑶S报告基因，转化水稻，通过转基因植株中⑶S报告基因的组化染色鉴定，证明OSigCfa001gl2的启动子调控基因在水稻颖花雄蕊的花药组织中特异高表达，在颖壳，雌蕊中不表达。在根、叶片、叶鞘中均不表达。在茎的节间中不表达，但是在茎的节中仅有很弱的表达。花药的切片花药切片结果见图3，其中蓝色表明GUS染色为阳性。图A结果表明，⑶S在花药的绒粘层细胞中特异表达，在颖壳中不表达。A，anther， 花药；T，Tapetum，绒粘层；L，Lemma，颖壳。图B，放大的花药部分，显示⑶S在绒粘层中特异表达。E，印idermis，表皮；MC，meiotic cell，减数分裂的细胞。在水稻的叶片、叶鞘、茎、穗中的定量的结果也证实，GUS基因特异性地在穗中特异高表达，见图4。实施例6、启动子保留功能的变体研究如前所述，本发明的启动子区序列如SEQ ID NO :1中第1_521位所示，而SEQ ID NO 1中第1-552位所示的序列也具有启动子的作用。经鉴定，位于SEQID NO 1中第 436-442位的TATA念(TATAAAT)、第146-153位的CAAT盒(CCAATGCA)为启动子发挥功能的关键位点(引发转录的必要位点及转录起始点)。在osigcfa001gl2基因的启动子区，除了TATA盒(TATAAAT)及CAAT盒(CCAATGCA) 夕卜，本发明人还找到了 :E-盒，序列为5，-CATTTG-3，(SEQ ID NO 1中第278-283位)。E-盒是脂转运蛋白(Lipid transfer protein)基因家族的启动子区的顺式调控组件，为转录因子结合位点，提示其是调控花药特异表达的关键位点。此外，CAAACAC序列是脂转运蛋白基因家族的启动子区的顺式调控组件，是影响启动子强度的关键位点。因此，基上述关键位点，本发明人进行了启动子变体研究。Ml 本发明人制备了基于SEQ ID NO 1中第1_552位所示序列的启动子，其中5，端减少22个碱基(Ml)。基于关键位点的分析，TATA盒，CAAT盒，E-盒和CAAACAC序列这些作为保守性的位点保持不变。序列如下(单下划线为用于扩增的引物序列)
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸(a)位于osigcfa001gl2基因的5，端及其上游；(b)碱基长度为200-2000个；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且(d)具有在植物花药中特异表达功能。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是(1)SEQID NO 1中第1-521位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2)SEQ ID NO 1中第1_552位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(3)(1)或( 任一限定的多核苷酸，其中第1-22位碱基缺失；(4)由SEQID NO :1中(1_22) (521-552)位所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；(5)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸；(6)核苷酸序列与(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列有80%以上同源性且具有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸；或(7)核苷酸序列与(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是基于SEQ ID NO 1中第1-521位或SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第 436-442位、第146-153位、第278483、第305-311位和/或第观7_312位核苷酸序列不变， 其它位点与(1)- )任一限定的多核苷酸序列具有50%以上相同性的，且具有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸。
4.如权利要求2或3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是基于SEQID NO :1中第1-521位或SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第99-104位、第115-120 位和/或第131-138位核苷酸序列不变，其它位点与(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列具有50%以上相同性的，且具有指导目的基因在植物花药中特异表达功能的多核苷酸。
5.权利要求1-4任一所述的多核苷酸的用途，用于指导目的基因在植物花药中特异表达。
6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1-4任一所述的多核苷酸，作为启动子元件。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因。
8.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游， 且与所述多核苷酸的间隔小于lOOObp。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞 含有权利要求5所述的载体；或其基因组中整合有外源的权利要求1-4任一所述的多核苷酸。
10.一种使目的基因在植物花药中特异表达的方法，其特征在于，所述的方法包括 将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有权利要求1-4任一所述的多核苷酸以及与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞；和将所述植物细胞再生成植株。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有权利要求1-4任一所述的多核苷酸以及与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因；(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞。
全文摘要
本发明涉及一种花药特异表达启动子及其应用。本发明首次分离到一个可在植物花药中特异性表达的启动子。所述的启动子可指导目的基因在植物花药中特异性高表达，而在植物的其它组织中低表达或不表达。
文档编号C12N5/10GK102465128SQ20111036012
公开日2012年5月23日 申请日期2011年11月14日 优先权日2010年11月12日
发明者上官颖颖, 严怡雯, 刘晓辉, 朱静洁, 陆婷婷, 陆怡祺, 韩斌 申请人:中国科学院上海生命科学研究院