专利名称：重组人IFNα2b乳腺表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其是一种重组人IFNa 2b乳腺表达载体及其构建方法和应用。
背景技术：
人干扰素2b (IFN α 2b)是一种具有干扰病毒复制，抑制细胞分裂增殖，抑制和杀伤肿瘤等生物学活性的细胞因子，是临床上治疗乙肝、丙肝等病毒性疾病和一些癌症的关键药物。目前，在临床上大量使用的重组人IFNa 2b均为大肠杆菌表达。由于大肠杆菌是原核生物，缺乏与蛋白质翻译后修饰相关的重要酶类，使得所表达的重组人IFNa 2b缺少决定生物活性的化学修饰和空间折叠，直接导致了在治疗效果上的折扣。更严重的是，错误折叠的重组人IFN α 2b在对病人的治疗过程中，会刺激人体产生能中和IFN α 2b的抗体，进一步降低治疗效果。利用哺乳动物细胞系表达IFN α 2b，可以生产具有完全生物活性的重组人IFNα 2b，但此种方式的生产成本过高，且细胞培养条件要求苛刻，表达量低，纯化工艺复杂，远远不能满足IFNa 2b的市场需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种重组人IFNa 2b乳腺表达载体及其构建方法和应用。解决上述技术问题本发明采用如下技术方案重组人IFNa 2b乳腺表达载体，该乳腺表达载体是pBCN-IFN-pA-EGFP。pBCN-IFN-pA-EGFP由扩增所得的beta-酪蛋白启动子和ployA序列、人IFNa 2b 基因、EGFP的表达盒按顺序ployA-IFN a 2b-酪蛋白启动子-EGFP表达盒插入到pMD18_T而得。上述重组人IFNa 2b乳腺表达载体的构建方法，主要包括以下步骤<1>根据GenBank中收录的娟姗牛beta-酪蛋白启动子和ployA序列，Genbank accession No. JN559864，设计引物，并以娟姗牛血液基因组DNA为模板，扩增出beta-酪蛋白启动子和PIoyA序列；<2> 根据 GenBank 中收录的人 IFN α 2b 基因，Genbank accession No. AY255838. 1， 设计引物，并以人血液基因组为模板，扩增获得人IFNa 2b基因；<3>根据BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP-Cl载体的全序列设计引物，扩增出EGFP的表达盒；<4>按顺序将所扩增得到的序列插入到PMD18-T中，顺序为ployA-IFN α 2b_酪蛋白启动子-EGFP表达盒，即得乳腺表达载体pBCN-IFN-pA-EGFP。上述重组人IFNa 2b乳腺表达载体的应用，将该b乳腺表达载体转化到哺乳动物中，以促使其乳腺高效表达重组人IFN α 2b。哺乳动物为小鼠。
转化是用Pvu I单酶切pBCN-IFN-pA-EGFP表达载体，切除pMD_18T骨架，回收含有IFN α 2b基因和EGFP基因的片段，回收的基因片段分别溶于无内毒素的TE溶液，调整溶液浓度至2ng/y L，然后注射到小鼠的受精卵的原核中，再将受精卵抑制到同期发情的代孕母鼠输卵管中，产生自代，鉴定，得到转基因小鼠。回收是低熔点琼脂糖凝胶回收，具体是取3 4 μ g酶切的表达载体DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，切下需回收的DNA条带所在位置的凝胶，采用Qiagen公司可回收101Λ以上的DNA片段的凝胶回收试剂盒进行回收。本发明的重组人IFNa 2b乳腺表达载体及其构建方法，为利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人IFNa 2b提供了基础。通过胚胎显微操作技术将表达载体转入哺乳动物的基因组中获得转基因动物，从而在转基因动物的乳腺中高效表达重组人IFNa 2b等其他重要的药用蛋白。此种方式成本低(转基因动物的饲养条件、饲料构成与普通动物无异， 不需额外的投入)，乳腺生物反应器产量高和纯化方便(乳汁成分明确，蛋白质种类较少)， 乳汁中的含量为30 μ g/L(约为细胞系表达量的10倍)。对所表达的重组人IFN α 2b生物活性进行检测后发现，比活度约为2. SXlO7IU,并且能在WISH细胞系中显著刺激抗病毒白 MxA的表达。因此，应用本发明生产的重组人IFNa 2b的生物学活性高、产量大、生产成本低，可产生巨大的经济效益和社会效应。
图1是重组人IFN α 2b的乳腺表达载体pBCN-IFN-pA-EGFP的构建过程。图2是Pvu I酶切乳腺表达载体pBCN-IFN-pA-EGFP的电泳图，其中，Ml表示 λ DNA/Hind ΠΙ DNA marker。泳道1为Pvu I酶切后的结果，泳道2为环状质粒。M2为 Supercolied DNA ladder marker。乳腺表达载体 pBCN-IFN-pA-EGFP 经 Pvu I 酶切后，可切出两条带，一条为11. Ikb的含有IFNα 2b和EGFP的表达盒。另一条为11Λ的pMD18_T 骨架；图3是PCR鉴定表达载体整合的阳性转基因小鼠的电泳图，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1，6，7号分别为3只转基因Rnmder小鼠PCR结果，上下两个条带， 分别为两个不同检测引物的扩增结果。其他泳道为见条带，均为阴性小鼠对照；图4是检测转基因小鼠基因组中IFN c^b基因整合的Southern blotting杂交图，其中，M表示11Λ梯度DNA分子量标准，1，6，7泳道分别为3只转基因Founder小鼠，其他泳道均为阴性小鼠对照；图5是PCR鉴定表达载体整合的阳性转基因小鼠的电泳图，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1-14号均为Fl代小鼠PCR结果，4号泳道的扩增不明显，判定为转基因阴性。BC泳道为空白对照。上下两个条带，分别为两个不同检测引物的扩增结果；图6是检测转基因小鼠基因组中IFNc^b基因整合的Southern blotting杂交图， 其中，M表示11Λ梯度DNA分子量标准，8-13号泳道分别为Fl代转基因小鼠，NC泳道为阴性小鼠对照；图7是检测转基因小鼠乳汁中重组人IFNa沘表达情况的western blotting图， 6,8,9,11，12，13泳道分别为转基因小鼠Fl代乳汁的杂交结果，WT为阴性对照小鼠乳汁的杂交结果，分别用鼠抗人IFNa 2b抗体和鼠抗His标签抗体进行杂交。均在M-25KD处有杂交条带出现；图8是转基因小鼠制备的流程图。图9是转基因小鼠乳汁中重组人IFNa 2b的生物学活性测定。图10是转基因小鼠乳汁中重组人IFNa 2b的比活度的定量测定。
具体实施例方式以下所用的载体和试剂来源pMD18_T载体，购自TaKaRa公司，pEGFP-Cl载体， 购自BD Biosciences Clontech公司，引物合成及序列测定均由上海生工生物工程有限公司完成，Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶及荧光定量相关试剂均购自大连TaKaRa公司，鼠抗人IFN α 2b单克隆抗体购自Abcam公司，鼠抗His标签单克隆抗体购自Abmart公司，羊抗鼠HRP酶标二抗购自天根公司。人IFN α 2bELISA检测试剂盒购自R&D公司，人羊膜上皮细胞系WISH细胞购自中国科学院上海细胞库。重组人IFN α 2b标准品购自安徽安科生物。 pGL3-Basic和pRL_TK以及双击荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。以下所用到的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增、基因组提取、RNA提取、脂质体转染法、显微注射法、Western blotting.Southern blotting等常规实验操作的步骤详见《分子克隆(第三版)》(2000年，科学出版社)或者相应试剂盒说明书；转基因小鼠的制备过程参见《小鼠胚胎操作实验指南》(A.纳吉等著，2004年，科学出版社)。一、重组人IFN α 2b的乳腺表达载体pBCN_IFN-pA_EGFP的构建1. 1重组人IFN α 2b乳腺表达载体的构建根据GenBank中收录的娟姗牛beta-酪蛋白基因ployA序列(Genbank accession No. JN559864，见序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列)设计引物，ρIoyA F :5，-GGTACCAGAGGATTTCAAAGTGAATG-3，ρIoyA R :5，-GAGCTCCAAAGATAAATTTAAGTTAACAAT-3，
并在上下游引物的5'端和3'端分别引入KpnI和Mc I两个酶切位点，并以娟姗牛血液基因组DNA为模板，扩增出beta-酪蛋白ployA序列，将PCR产物回收后连接到pMD18-T载体，命名为pMD18-ployA，并进行测序，证明序列正确后利用引入的Kpn I和 Sac I双酶切，回收1178bp的片段，将回收产物连接到同样经过Kpn I和Mc I双酶切的 PMD18-T载体中,将该载体命名为pMD18-ployA construct备用。根据GenBank 中收录的人 IFNa 2b 基因(Genbank accession No. AY255838. 1，见序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列)设计引物，IFN F :5’ -GGATCCCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTTGTGATCTGCCTCAAACC-3’IFN R 5' -GGTACCTCATTCCTTACTTCTTAAACT-3，并在上下游引物的5'端分别引入BamH和Kpn I两个酶切位点，同时在上游引物的5'端引入6XHis标签序列和凝血酶识别序列。并以人血液基因组为模板，扩增出人IFNa 2b基因。将PCR产物回收后连接到pMD18_T载体，命名为pMD18_IFN，并进行测序，证明序列正确后利用引入的BamH和IKpn I双酶切，回收554bp的片段，将回收产物连接到同样经过BamH和IKpn I双酶切的pMD18_ployA construct载体中，将该载体命名为 pMD18-IFN-pA 备用。
5
根据GenBank中收录的娟姗牛beta-酪蛋白启动子序列(Genbank accession No. JN559864，见序列表SEQ. ID. No. 3的碱基序列)设计引物，BCNp F :5，-GTCGACGCGCGGCCGCGGAATATTCATTGGAAGGATTGAT-3，BCNp R:5， -GGATCCCTCTCTTGCAAGGGCCAGAGC-3，，并在上下游引物的5'端引入Mil和Not I两个酶切位点，3'端引入BamHI酶切位点。并以娟姗牛血液基因组DNA为模板，扩增出beta-酪蛋白启动子序列，将PCR产物回收后连接到PMD18-T载体，命名为pMD18-BCNp，并进行测序，证明序列正确后利用引入的 Sal I和BamH I双酶切，回收5260bp的片段，将回收产物连接到同样经过Ml I和BamH I 双酶切的pMD18-IFN-pA载体中，将该载体命名为pBCN_IFN-pA备用。根据BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP_Cl载体的全序列(EGFP序列见序列表SEQ. ID. No. 4的碱基序列)设计引物，EGFP F 5' -GTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTGCGTTATCCCCTGATTC-3’EGFP R:5’ -GCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGATACATTGATGAGTTTGGAC-3’并在上下游引物的5'端分别引入Ml I和Not I两个酶切位点，同时引入LoxP 序列。以pEGFP-Cl质粒为模板，扩增出EGFP的表达盒。将PCR产物回收后连接到pMD18_T 载体，命名为PMD18-EGFP，并进行测序，证明序列正确后利用引入的Ml I和Not I双酶切， 回收1632bp的片段，将回收产物连接到同样经过Ml I和Not I双酶切的pBCN_IFN-pA载体中，将该载体命名为pBCN-IFN-pA-EGFP。表达载体的构建过程如图1所示。二、表达重组人IFN α 2b的转基因小鼠模型的建立及检测2. 1显微注射生产转基因小鼠用显微注射法生产转基因小鼠，线性载体比环形载体的整合效率高，因此要先把构建好的表达载体切成线性才能进行显微注射。用Pvu I酶切，切掉PMD8-T载体序列，回收11. Ikb含有人IFN α 2b的片段，回收片段见附图2。将酶切的载体DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，切下DNA条带所在位置的凝胶，采用可回收101Λ以上DNA片段的凝胶回收试剂盒进行回收。回收的基因片段溶解于试剂盒所配的无内毒素TE溶液中，用紫外分光光度计测定^Onm和^Onm下的OD比值，并计算浓度。回收的DNA片段的质量评定标准，以OD26tl/ OD280比值大于1. 8为达标，即可用于注射小鼠受精卵。将回收的DNA稀释至终浓度为2ng/ μ L，将注射到受精卵的原核中，再将受精卵移植到同期发情的代孕母鼠的输卵管中。2. 2转基因小鼠的PCR检测取断奶的转基因小鼠尾巴组织，提取基因组，以提取的基因组DNA为模板，用 pBCN-IFN-pA-EGFP载体上IFN α 2b基因两侧的酪蛋白启动子序列和ployA上的序列的引物 (CXF :5，-TACACTATTTCCTCATCTTCCCA-3，，CXR :5，-TCAGTCTGCCTCCAATATCC-3，)和 CMV 检测引物( C M V F 5 ‘ -GTTATCCCCTGATTCTGTGG-3 ‘ , C M V R 5' -ATAGACCTCCCACCGTACAC-3 ‘)，在转基因阳性小鼠中可以同时扩增出780bp和600bp 的两条片段，以野生型小鼠(非转基因小鼠)基因组为模板的PCR为阴性对照。扩增条件为95°C，30sec,60°C，30sec, 72°C，Imin ；35个循环。然后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。通过PCR在FO代8只小鼠中有3只阳性，见附图3。在Fl代13只小鼠中检测到12 只阳性小鼠，只有4号为阴性。见图52. 3 转基因小鼠的 Southern blotting 检测将PCR检测为阳性的FO代3只整合了人IFNa 2b基因的转基因小鼠，剪取尾尖组织并提取基因组，取10-30 μ g基因组DNA，用BamH I内切酶消化过夜，同时用BamH I酶切野生型小鼠基因组作为阴性对照。探针用回收的人IFN α 2b基因片段制备。将各个样品在0. 8%的琼脂糖凝胶上，以30V的低电压缓慢电泳过夜(12-1 )。采用毛细管转移的方法将DNA从琼脂糖转移至正电尼龙膜上，将尼龙膜上吸附了 DNA的一面朝上，通过紫外交联仪交联。交联结束后，清水清洗一遍，将尼龙膜附着DNA的一面向内圈成筒状入杂交管内。加入预杂交液，于45°C预杂交lh，加入经过加热变性的地高辛标记的探针，45°C杂交12-1他， 充分洗膜后，均勻滴加上CSPD发光液，保鲜膜包裹后，放进暗盒，暗室中压上X光片曝光Ih 后，冲洗X光片观察结果。Southern blotting结果如附图4所示，结果表明转基因阳性小鼠Southern blotting检测结果与PCR检测结果一致。Fl代转基因小鼠的Southern blotting检测结果如附图6。三、重组人IFN α 2b在转基因小鼠乳汁中的表达分析3. 1由实施例2得到的转基因小鼠乳汁的Wfestern blotting检测哺乳10天后采集Fl代转基因小鼠6#，8#，9#，11#，12#，13#小鼠的乳汁，阴性小鼠的乳汁做阴性对照，采集前，将母鼠与仔鼠分离4小时，并系通过腹腔注射适量缩宫素， IOmin后，速眠新麻醉，按摩乳头挤压出乳汁。全乳经脱脂和脱酪蛋白处理后的乳样用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离。分离后的蛋白转印至NC膜上，进行Wfestern blotting分析。通过两种不同抗体均能检测到重组IFN α 2b的表达，如附图7所示。在所有的转基因小鼠的乳汁中都能检测到重组蛋白的表达，而在阴性小鼠的乳汁中则检测不到。3. 2转基因乳汁样品中重组IFN α 2b的表达定量检测用夹心法ELISA对转基因小鼠乳汁中的重组IFNa 2b的表达量进行分析。分析试剂盒为R&D公司的人干扰素定量检测试剂盒。用试剂盒内提供的标准品作为定量的标准。 每次测量每个样品重复三次。测定结果如下表1转基因小鼠乳汁中重组人IFNa 2b的表达量
Mouse NumberODExpression Ιενε (μ^)
F0-10.20217.2
Fl-90.21929.71
Fl-120.19411.32
Fl-100.1811.8
WT0.062-
BLANK0.05-四、重组人IFN a 2b的生物学活性检测4. 1重组人IFN a 2b的活性测定
将母鼠与仔鼠分离4小时后，并系通过腹腔注射适量缩宫素，IOmin后，速眠新麻醉，按摩乳头挤压出乳汁。全乳经脱脂和脱酪蛋白处理后，用含10%胎牛血清的DMEM稀释， 并用无菌过滤器过滤备用。接种人羊膜上皮细胞系WISH细胞至35cm的细胞培养皿中，于 370C 5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%汇合度时，将无菌处理的乳汁添加至细胞中，过夜培养，同时做非转基因小鼠乳汁和空白对照。提取细胞总RNA，用无RNase的DNase充分消化总RNA中残留的DNA，经PCR检测确定无DNA残留后，用AMV逆转录酶将RNA反转成cDNA。并设计IFN α 2b的诱导基因MxA 基因(Genbank accession No. NM_001178046. 1)的引物和人 beta-actin 内参(Genbank accession No. NM_001101. 3)引物MxAF 5’ -GCAGAAGGTCAGAGAGAAGG-3 ’MxAR :5’ -AGGGATGTGGCTGGAGATG-3’ACTBF 5' -CACCACACCTTCTACAATGAG-3‘ACTBR 5 ‘ -GCGTACAGGGATAGCACAG-3 ‘以 cDNA 为模板，利用以上引物通过 ABI7500 实时荧光定量 PCR 分析。扩增条件为 95°C，5min, 95°C，30sec,60°C，30sec, 72°C， lmin;40个循环。72°C延伸结束后采集荧光。并作溶解曲线。根据2_Δ 法计算出MxA基因的相对表达量，如附图9。结果显示，转基因小鼠乳汁能够诱导MxA基因的表达，表达量约为非转基因小鼠乳汁的IO6倍。4. 2转基因小鼠乳汁中重组人IFN α 2b的比活度的定量测定根据Genbank中收录的MxA基因启动子的序列(Genbank accession No. ΝΤ_011512. 11)设计引物，MxAF 5' -AGATCTTTTTATTTTCCTTCCACACAC-3‘MxAR 5' -AAGCTTCTGACTTGGGTTTGCTTTC-3 ‘并在上下游引物的 5'端分别引入 Bgl II和Hind III两个酶切位点并以人血液基因组为模板，扩增出人MxA启动子序列。将 PCR产物回收后连接到pMDIS-T载体，命名为pMD18-MxA，并进行测序，证明序列正确后利用引入的Bgl II和Hind III双酶切，回收1084bp的片段，将回收产物连接到同样经过BglII 和Hind III双酶切的pGL3-Basic载体中，将重组的载体命名为pGL3_MxA。将母鼠与仔鼠分离4小时后，并系通过腹腔注射适量缩宫素，IOmin后，速眠新麻醉，按摩乳头挤压出乳汁。全乳经脱脂和脱酪蛋白处理后，用含10%胎牛血清的DMEM稀释， 并用无菌过滤器过滤备用标准品重组人IFN α 2b用含有10%胎牛血清的DMEM稀释后做梯度稀释，分别为 1500IU/mL,1000IU/mL,500IU/mL,250IU/mL,125IU/mL, OIU/mL将人羊膜上皮细胞系WISH细胞至M孔的细胞培养板中，于37°C 5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%汇合度时，将pGL3-MxA质粒与对照质粒pRL-TK按1 1 混合，转染WISH细胞。转染5小时后，更换过滤除菌的小鼠奶和重组人IFNa 2b标准品，同时做阴性转基因小鼠乳汁对照和空白对照。每组检测设三个重复。M小时后，收集细胞， Dual-Luciferase报告基因检测系统检测荧光素酶的活性。根据标准品的相对荧光强度做出标准曲线。通过标准曲线和转基因阳性小鼠乳汁处理组的荧光素酶值，计算出活性单位。 在经过乳汁含量换算出比活度。结果如附图10。所表达的重组人IFN α 2b的比活度为 2. 8X107IU/mg。
权利要求
1.一种重组人IFNa 2b乳腺表达载体，其特征在于该乳腺表达载体是 pBCN-IFN-pA-EGFP。
2.根据权利要求1所述的重组人IFNa2b乳腺表达载体，其特征在于所述 pBCN-IFN-pA-EGFP由扩增所得的beta-酪蛋白启动子和ployA序列、人IFN α 2b基因、EGFP 的表达盒按顺序ployA-IFNa 2b-酪蛋白启动子-EGFP表达盒插入到pMD18_T而得。
3.根据权利要求1或2所述重组人IFNa2b乳腺表达载体的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤<1>根据GenBank中收录的娟姗牛beta-酪蛋白启动子和ployA序列，Genbank accessionNo. JN559864,设计引物，并以娟姗牛血液基因组DNA为模板，扩增出beta-酪蛋白启动子和PIoyA序列；<2> 根据 GenBank 中收录的人 IFNa 2b 基因，Genbank accession No. AY255838. 1，设计引物，并以人血液基因组为模板，扩增获得人IFNa 2b基因；<3>根据BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP_Cl载体的全序列设计引物，扩增出EGFP的表达盒；<4>按顺序将所扩增得到的序列插入到pMDIS-T中，顺序为=PloyA-IFNa 2b-酪蛋白启动子-EGFP表达盒，即得乳腺表达载体pBCN-IFN-pA-EGFP。
4.根据权利要求1或2所述重组人IFNa2b乳腺表达载体的应用，其特征在于将该b 乳腺表达载体转化到哺乳动物中，以促使其乳腺高效表达重组人IFNa 2b。
5.根据权利要求4所述重组人IFNa2b乳腺表达载体的应用，其特征在于所述哺乳动物为小鼠。
6.根据权利要求5所述重组人IFNa2b乳腺表达载体的应用，其特征在于所述转化是用Pvu I单酶切pBCN-IFN-pA-EGFP表达载体，切除pMD_18T骨架，回收含有IFN α 2b基因和EGFP基因的片段，回收的基因片段分别溶于无内毒素的TE溶液，调整溶液浓度至2ng/ μ L，然后注射到小鼠的受精卵的原核中，再将受精卵抑制到同期发情的代孕母鼠输卵管中，产生自代，鉴定，得到转基因小鼠。
7.根据权利要求5所述重组人IFNa2b乳腺表达载体的应用，其特征在于所述回收是低熔点琼脂糖凝胶回收，具体是取3 4 μ g酶切的表达载体DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，切下需回收的DNA条带所在位置的凝胶，采用Qiagen公司可回收101Λ以上的DNA片段的凝胶回收试剂盒进行回收。
全文摘要
本发明公开了一种重组人IFNα2b乳腺表达载体，该乳腺表达载体是pBCN-IFN-pA-EGFP，它是由扩增所得的beta-酪蛋白启动子和ployA序列、人IFNα2b基因、EGFP的表达盒按顺序ployA-IFNα2b-酪蛋白启动子-EGFP表达盒插入到pMD18-T而得。本发明还公开了该乳腺表达载体的构建方法。本发明为利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人IFNα2b提供了基础。而且，应用本发明生产的重组人IFNα2b的生物学活性高、产量大、生产成本低，可产生巨大的经济效益和社会效应。
文档编号C12N15/85GK102363791SQ20111035966
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者刘庆友, 崔奎青, 李辉, 石德顺 申请人:广西大学