专利名称：一种拟南芥根特异性表达基因arsk1启动子的克隆方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法。
背景技术：
启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。目前，组织特异性启动子的调控机制己进入深入研究阶段，该类启动子除具有基本结构外，通常还有一些调控特异表达的序列，这些序列为转录因子提供了结合位点，通过与蛋白质的相互作用来调节基因表达。在组织特异性启动子的驱动下，基因的表达通常只发生在特定的组织或器官，并往往表现出发育调节的特性。根是植物吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。拟南芥的磷酸转移酶基因启动子与Gtt？融合， 在农杆菌介导下转化拟南芥和拟南芥，组织化学分析显示蛋白只在拟南芥和拟南芥的根毛及根表皮表达，说明该启动子是根特异的。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白基因(calreticulin)构建融合表达载体，转基因烟草水培研究结果表明，根细胞不仅能高效产生某些目的蛋白质，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中。植物的根系在植物抗旱中起着重要的作用，根系吸水力的提升和根系形态的建成，无疑对提高植物的吸水力，增强其抗旱性具有重要的意义。多数的植物功能基因如激素合成、代谢相关基因，植物生长、发育调控基因在植物的地上部分和地下部分均有表达，通过简单的转基因或者基因沉默的方式只能从整体上调节基因在植物体的表达，不能特异性的实现对植物根系功能和发育的调控。为了解决上述问题，需要利用植物根系特异性表达的启动子驱动相关功能基因的表达，以达到既能提高植物吸水性、增加植物根系长度和数量，又不影响植物地上部生长、 不损害植物营养生长的目的，由此通过转基因的手段能够获得相应的抗旱植株。目前的研究中需要克隆得到根特异性表达基因启动子。
发明内容
本发明提供一种拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一种拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法，该方法包括以下步骤 I、获取拟南芥根特异性基因ARSKl
A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR 反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列；
B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据拟南芥根特异性基因设计引物，再分别进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因ARSKl ；II、获取拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子
A、在线分析得到拟南芥根特异性表达基因ARSKl的启动子，再在拟南芥根DNA中进行克隆得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子。步骤I -B中所述的拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站的编号分别为 AT1G79580. 1、AT1G62980. 1、AT1G66470. 1、AT1G27740. 1、AT1G54970. 1、AT3G10710. 1、 AT1G12560. U AT2G26420. UAT1G12040. UAT1G62440. U AT3G62680. UAT2G26290. 1。所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的序列为SEQ ID No :1。在步骤II之后，进行所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子功能验证，包括以下步骤
A、在线分析得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；
B.将所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子进行5’端缺失处理，经过PCR反应得到ARSKl启动子缺失体片段；
C.将所述的ARSKl启动子缺失体片段分别构建ARSKl启动子缺失体GUS表达载体；
D、将所述的ARSKl启动子缺失体GUS表达载体转化拟南芥植株，得到转化体植株，再进行检测。所述的ARSKl启动子缺失体片段的大小分别为1981bp，1460bp, 879bp，762bp, 409bp，358 bp ；
本发明的有益效果为
因为本发明克隆到拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子，该启动子为植物根系特异性表达的启动子，可以驱动相关功能基因的表达，所以该启动子具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力转入该启动子的植株，在同等干旱条件下，存活率比相比对照组的野生型植株高60-70%。
图1 实施例1中，12个拟南芥根特异性基因的扩增产物电泳结果。图2 实施例1中，拟南芥基因ARSKl的基因图谱。图3 实施例1中，拟南芥基因启动子ARSKl的基因图谱。图4 实施例1中，拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的扩增产物电泳结果。图5 实施例1中，拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子序列中含有的顺式作用元件的分析结果。图6 实施例1中，6种ARSKl启动子缺失体的结构简图。图7 实施例1中，6种ARSKl启动子缺失体⑶S表达载体的结构简图。图8 实施例1中，6种ARSKl启动子缺失体⑶S表达载体在拟南芥转化体植株的表达量的Gus染色图。
具体实施例方式实施例1
一种拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法，该方法包括以下步骤I、获取拟南芥根特异性基因ARSKl
A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR 反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列； 具体的操作为
分别取生长20d的拟南芥植株的根与叶为材料，用Trizol法分别提取拟南芥根与叶的总RNA，分别进行反转录PCR反应，分别得到拟南芥根cDNA和拟南芥叶cDNA ； 所述的反转录PCR反应的体系为RNA :1. 2 μ g, Oligo (dT) 15 2 μ 1， M-MLV buffer :5μ 1，dNTP Mix :1.25 μ 1，M-MLV :1μ 1，RNase inhibitor :0.6 μ 1， DEPC处理后的ddH20 补足25 μ 1 ； 所述的反转录PCR反应的程序为
加入上述oligo (dT) 15后70°C反应5分钟，然后加入反转录PCR上述体系中的其他试剂，37°C反应1小时，得到所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列。
B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据12 个拟南芥根特异性基因设计引物，再进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因 ARSKl ；
所述的12个拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站(ΤΑ^)，(网址为http:// www. arabidopsis. org/)的编号和记载该基因的文献来源如下
SMB (AT1G79580. 1) :Tom Bennett, Albert van den Toorn, Gabino F, (2010). SOMBRERO, BEARSKIN1, and BEARSKIN2 Regulate Root Cap Maturation in Arabidopsis .Plant Cell. 22: 640 - 654 ；
EXP18 (AT1G62980. 1) =Hyung-Taeg Cho, Daniel J. Cosgrove, (2002). Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene Expression in Arabidopsis. Plant cell. 14:3237 - 3253 ；
RHD6 (AT1G66470. 1) Jill S. Parker, Alison C. Cavell, Liam Dolan, (2000). Genetic Interactions during Root Hair Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell. 12:1961 - 1974 ；
RSL4 (AT1G27740. 1) =Keke Yi, Beno t Menand, Elizabeth Bell, Liam Dolan, (2009). A basic helix-loop-helix transcription factor controls cell growth and size in root hairs, nature genetics. 10:1038 ；
PRPl (AT1G54970. 1) =Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho, (2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair_Speci c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis. Plant Physiology. 150:1459—1473 ；
RHS12 (AT3G10710.l):Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho, (2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair_Speci c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis. Plant Physiology. 150:1459—1473 ；
EXP7 (AT1G12560. 1) =Hyung-Taeg Chol1Daniel J. Cosgrove, ( 2002). Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene. Plant Cell. 14:3237 - 3253 ；PIP5K3 (AT2G26420.1):Irene Stenzel,Till Ischebeck, Sabine Konig, (2008). The Type B Phosphatidylinositol-4-Phosphate 5—Kinase 3 Is Essential for Root Hair Formation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 20: 124 - 141 ；
LRXl (AT1G12040. 1) =Nicolas Baumberger, Christoph Ringli ， Beat Keller, (2001). The chimeric leucine-rich repeat/extensin cell wall protein LRXl is required for root hair morphogenesis in Arabidopsis thaliana. Genes Dev. 15: 1128-1139 ；
LRX2 (AT1G62440. 1) :N.Baumberger, M. Steiner, U. Ryser, (2003). Synergistic interaction of the two paralogous Arabidopsis genes LRXland LRX2 in cell wall information duiing root hair development. Plant Journal, 35:71-81 ；
PRP3 (AT3G62680. 1) Christine Bernhardt ,Mary L. Tierney, (2000).
Expression of AtPRP3, a Proline-Rich Structural Cell Wall Protein from Arabidopsis, Is Regulated by Cell-Type-Specific Developmental Pathways Involved in Root Hair Formation1. Plant Physiology. 122: 705 - 714 ；
ARSKl (AT2G26290.1) Jnhwan Hwang, Howard M. Goodman, (1995). An Arabidopsis thaliana root-specific kinase homolog is induced by dehydration, ABA, and NaC1. Plant Journal. 8(1):37-43 ；
利用01igo6.0软件设计所述的12个拟南芥根特异性基因的半定量PCR反应引物；由于检测基因较多，为提高实验效率，在引物设计时应尽量使退火温度保持集中、一致，即退火温度为51°C ；具体引物序列如下 SMB
Upper :GGAGGAGGAGCTTCTTTAC ， Lower :CCAGAAACGACCAGTCTC CA ； EXP18
Upper :CG CAAGTGCCTGGTTATTTTA, Lower :CGG AGCAGCATTATAAGCGT ； RHD6
Upper :GGCACTCGTTAATGACCATC, Lower :G GTGATCAGATTCGAATTCC ； RSL4
Upper :GGACGTTTTTGTTGATGGTG, Lower :CG TACATCCATA GATCATCC ； PRPl
Upper :GCTGATTATTACGCTCCCTC ， Lower :GTT GGATCACTGTAGATGAC ； RHS12
Upper :CGC TGAGCTTCTTGACCTAAC, Lower =CGGT AGAATTGGCGTTGTGC ； EXP7 Upper :GTT CGTCGCTGGATACTATC, Lower =GCAA CGTTCCAAGCATAGAT ； PIP5K3
Upper :GCTGCCG AGATTAGAATAGT, Lower :GCACCACCA CTCTCCAAAA G ； LRXl
Upper :GGTTCAGATGTTTGCTCCT, Lower CTTCTAGGCTCTTCATGTTA C ； LRX2
Upper :GGC TCTGATGTTTGTTCCTAC, Lower :GG TTAGAGAGCTGACAAATGC ； PRP3
Upper :CCACCCGTTT ACAAGCCTAC, Lower :GAGCTCCAAGTTCTTGTCCG ； ARSKl
Upper :CG CAAGCAAATACGAAGGAG, Lower :CGTATGTTCGCCTTCAG GTC ； 所述的半定量PCR反应的体系为
Ex Taq buffer 2 μ l,dNTP Mix (2.5 mM each) :1.6 μ 1，Primer Mix (5 μ M each) :2. 4 μ 1，cDNA :2. 4 μ 1，Ex Taq :0. 2 μ 1，ddH20 :11. 4 μ 1 ；
所述的半定量PCR反应的程序为94°C预变性5 min ；94°C变性45 s, 55°C退火45 s，72°C延伸1 min，共30个循环；72°C延伸7 min ；4°C保存。通过所述的半定量PCR反应分别得到12个拟南芥根特异性基因的扩增产物；再将上述12个拟南芥根特异性基因的扩增产物进行检测，筛选得到拟南芥根特异性基因 ARSKl ；
具体的操作为
将上述12个拟南芥根特异性基因的扩增产物进行琼脂糖凝胶上电泳；电泳结果如图1所示，泳道M为DNA marker II，泳道1为内参actin，泳道2_13分别为上述12个拟南芥根特异性基因的扩增产物；泳道4表明，所述的拟南芥根特异性基因ARSKl在拟南芥的根中的表达量大，在拟南芥的叶中几乎不表达。II、获取拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子
A、在线分析得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子，再在拟南芥根DNA中进行克隆得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子。具体的操作为
a.在NCBI网站上分析获得拟南芥根特异性表达基因ARSKl的启动子 在NCBI网站上找到拟南芥ARSKl基因序列，网址为 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM_128186. 2 ； 在NCBI网站上分析ARSKl基因的map view,网址为
http://www.ncbi. nlm. nih. gov/mapview/maps. cgi taxid=3702&chr=2&MAPS=rna_r&cmd=focus&fill=40&query=uid(7448160)&QSTR=NM%5F128186%2E2 ；
图2为拟南芥基因ARSKl的基因图谱，由此可看出该基因含5个外显子，4个内含子； 在NCBI网站上分析ARSKl基因启动子的map view，网址为
http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/mapview/maps. cgi TAXID=3702&CHR=2&MA PS=rna-r&QSTR=NM_128186. 2&QUERY=uid%287448160%29&BEG=ll%2C194%2C200&END=ll%2C 196700&oview=default ；
图3为ARSKl基因启动子的图谱，第1个外显子前2500左右的片段即为启动子区； 在NCBI网站上找到已公布的拟南芥ARSKl基因上游的序列，网址为 http//www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NC_003071. 7 from=l1194200&to=l1196700 &report=fasta ；
以上网址链接的页面显示了拟南芥ARSKl基因第1个外显子前2500左右的序列，本实施例截取其中的1981bp，详见序列表SEQ ID No 1，作为最终需要克隆的出来的所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子；
b.在拟南芥根DNA克隆得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子； 取生长20-28d，优选为25d的拟南芥植株，采用CTAB法提取拟南芥根DNA ；以上述拟南芥根DNA为模板进行PCR反应，得到拟南芥ARSKl基因的启动子；该拟南芥为鼠耳芥属，拉 ^f JC^ Arabidopsis thaliana ； 所述的PCR反应体系为
5 X buffer :5μ 1，dNTP Mix (2. 5 mM each) 2 μ 1, Primer Mix (5 μ M each) :2 μ 1, cDNA 1 μ 1, PrimeSTAR :0.25 μ 1，ddH20 :14.75 μ 1 ； 所述的PCR反应的引物为序列 Upper (带酶切位点Hind III) 5-AAGCTT CCATGATTAACCTACGCTTC-—3，
Lower (带酶切位点 Nco I ) :5_CCATGG GC CAT TTT CAA CTT CTT CTT TTG——3 ； 所述的PCR反应程序为
94°C预变性 5 min ;98°C变性 10s，50°C退火 15 s，72°C 延伸 2 min，共 30 个循环；72°C 延伸IOmin ；4°C保存；
将上述PCR反应的扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶上电泳；电泳结果如图4所示，泳道M 为DNA marker III，泳道1-2中亮度较强的条带大小为1981bp ； III、拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子功能验证
A、在线分析得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；
在Softberry网站在线分析预测所述的稻根特异性表达基因ARSKl启动子的转录起始位点，上述Softberry在线分析网址为
http//linuxl. softberry. com/berry. phtml topic=fgenesh&group=programs&subg roup=gfind ；
分析结果表明所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的转录起始位点可能位于自序列表SEQ ID No :1中的5'端第1866位的碱基T ；
在Place网站在线分析预测所述的稻根特异性表达基因ARSKl启动子含有的的顺式作用元件，上述 Place 在线分析网址为 http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html ；
图5为所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子含有的顺式作用元件的分析结果所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子(序列表中SEQ ID No 1)的自5'端第 1834-1840 位核苷酸为 ΤΑΤΑΒ0Χ，自 5'端第 1567-1570 位，1621-16 位，1696-1699 位核苷酸为CAATB0X ；自5'端第1102-1106位核苷酸为根特异表达元件N0DC0N2GM ；第285-289 位，521-525 位，1219-1223 位，1572-1576 位，1581-1585 位，1623-1627 位核苷酸为根特异表达相关元件 R00TM0TIFTAP0X1。 B.将所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子进行5’端缺失处理，经过PCR 反应得到6种ARSKl启动子缺失体卩1、？2、？3、？4、？5、？6片段； 具体的操作为
以拟南芥根cNDA序列为模板，分别根据上述6种ARSKl启动子缺失体PI、P2、P3、P4、 P5、P6设计引物，再进行PCR反应，分别得到以上6种ARSKl启动子缺失体的扩增产物，再进行回收处理，得到6种ARSKl启动子缺失体片段；下表中为以上6种ARSKl启动子缺失体的详细信息；图6为以上6种EXP18D启动子缺失体的结构简图。
权利要求
1. 一种拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法，其特征在于该方法包括以下步骤1.获取拟南芥根特异性基因ARSKlA、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR 反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列；B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据拟南芥根特异性基因设计引物，再分别进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因ARSKl ；II、获取拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子A、在线分析得到拟南芥根特异性表达基因ARSKl的启动子，再在拟南芥根DNA中进行克隆得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子。
2.根据权利要求1所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法，其特征在于步骤I -B中所述的拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站的编号分别为 AT1G79580.1、AT1G62980. 1、AT1G66470. 1、AT1G27740. 1、AT1G54970. 1、AT3G10710. 1、 AT1G12560. UAT2G26420. UAT1G12040. UAT1G62440. UAT3G62680. U AT2G26290. 1。
3.根据权利要求1所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法，其特征在于所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的序列为SEQ ID No :1。
4.根据权利要求1所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法，其特征在于在步骤II之后，进行所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子功能验证，包括以下步骤A、在线分析得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；B.将所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子进行5’端缺失处理，经过PCR反应得到ARSKl启动子缺失体片段；C.将所述的ARSKl启动子缺失体片段分别构建ARSKl启动子缺失体GUS表达载体；D、将所述的ARSKl启动子缺失体GUS表达载体转化拟南芥植株，得到转化体植株，再进行检测。
5.根据权利要求4所述的拟南芥根特异性表达基因ARSKl启动子的克隆方法，其特征在于所述的ARSKl启动子缺失体片段的大小分别为1981bp, 1460bp, 879bp, 762bp, 409bp，358 bp。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子的克隆方法，该方法包括以下步骤获取拟南芥根特异性基因ARSK1、获取拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子。因为本发明克隆到拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子，该启动子为植物根系特异性表达的启动子，可以驱动相关功能基因的表达，所以该启动子具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力转入该启动子的植株，在同等干旱条件下，存活率比相比对照组的野生型植株高60-70％。
文档编号C12N15/10GK102417904SQ20111035940
公开日2012年4月18日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者吴忠义, 张秀海, 程曦, 罗昌, 黄丛林 申请人:北京农业生物技术研究中心