专利名称：表现出内皮细胞特异性的启动子和使用其调节血管生成的方法
表现出内皮细胞特异性的启动子和使用其调节血管生成的方法本申请是申请日为2010年7月30日，申请号为200580046412. 8的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。发明领域和背景本发明涉及可用于在受试者的特定组织区域中调节血管 生成的核酸构建物、药用组合物和方法。更具体地讲，本发明涉及表现出内皮细胞特异性启动子活性的分离多核苷酸序列及其使用方法，再更具体地讲，涉及在内皮细胞中表现出增加的活性和特异性的修饰型前内皮素原-I(PPE-I)启动子以及核酸构建物，它们可用于在特定细胞亚型中激活细胞毒性，由此能治疗特征在于异常新血管形成或细胞生长的疾病，或者可用于诱导新血管生长，由此能治疗局部缺血疾病。本发明进一步涉及PPE启动子的修饰，所述修饰增强其响应于包括低氧和血管生成在内的生理条件的表达，并涉及新血管生成内皮特异性联合疗法。血管牛成血管生成指新血管的生长，这是一个主要依赖于毛细血管内皮细胞的移动、增殖和脉管形成的过程。在血管生成期间，内皮细胞从其静息状态苏醒并迅速增殖。尽管尚不知晓负责将细胞转变成血管生成表型的分子机制，但导致形成新血管的事件次序已有充分的文件记载[Hanahan，D. , Science 277，48-50，(1997)]。血管生长需要内皮出芽[Risau，ff.，Nature 386,671-674，(1997)]或套叠[Patan，S.等；Microvasc. Res. 51，260-272，(1996)]。在第一条途径中，可发生以下顺序的事件(a)血管基底(通常是毛细血管后微静脉)和间质基质溶解；(b)内皮细胞向刺激物迁移；(c)尾随前导内皮细胞之后的内皮细胞增殖；(d)在内皮索(array)/芽中形成管腔(管道化)；(e)通过芽的汇合性吻合形成分支和回路，以允许血液流动；(f)周细胞(即内皮周细胞和平滑肌细胞)包被血管；和(g)在不成熟血管周围形成基底膜。新血管还可经第二条途径形成将间质组织柱插入既有血管的管腔中。这些柱随后的生长及其稳定化导致血管管腔分隔和局部血管网络重建。血管生成在低氧浓度(局部缺血和肿瘤转移等)条件下发生，因此在新血管生成中可能是一个重要的环境因素。包括红细胞生成素、转铁蛋白及其受体、大多数葡萄糖转运和糖酵解途径基因、LDH、TOGF-BB、内皮素-I (ET-I) ,VEGF和VEGF受体在内的若干种基因的表达在低氧条件下被低氧诱导型因子(HIF-I)与调节这些基因转录的低氧效应元件(HRE)的特异性结合所诱导。这些基因响应低氧条件而表达，使细胞能够在低氧条件下发挥作用。血管生成过程受到由肿瘤细胞或正常细胞分泌的血管生成生长因子以及胞外基质成分和内皮酶活性的调节(Nicosia和Ottinetti, 1990, Lab. Invest.，63,115)。在血管生成初期，内皮细胞芽通过现有血管基底膜中的间隙露出(Nicosia和Ottinetti，1990，参见上文；Schoefl, 1963, Virehous Arch, Pathol. Anat. 337,97-141 ;Ausprunk 和 Folkman,1977, Microvasc. Res. 14, 53-65 ；Paku 和 Paweletz, 1991, Lab. Invest. 63, 334-346)。当新血管形成时，它们的基底膜经历复杂的结构和组成变化，这些变化被认为会影响血管生成反应(Nicosia 等，1994，ExpBiology. 164，197-206)。
血管牛成和病理学:有多种血管生成因子掌控血管生成过程。当然，在病变期间，促血管生成因子和抗血管生成因子之间的精密平衡被破坏，由此激发非自限性的内皮细胞和内皮周细胞增殖。尽管在正常条件下血管生成是高度受调节的过程，但许多疾病(特征为“血管生成性疾病”)由持续不受调节的血管生成引起。在这样的病状中，不受调节的血管生成或者可直接引起特定疾病，或者可使现有的病理状况恶化。例如，眼部新血管生成已被指是失明的最主要病因，是大约20种眼病的病理学基础。在某些先有病症如关节炎中，新形成的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病中，在视网膜中形成的新毛细血管侵入玻璃体液，引起出血和失明。直到最近，对在眼部新血管生成疾病、关节炎、皮肤病和肿瘤中出现的血管生成仍难以在治疗上进行抑制。不平衡的血管生成以各种病理病症为典型特征，通常支持病理状态的演进。例如，在实体瘤中，血管内皮细胞以快达正常组织中的那些细胞约35倍的速度分裂(Denekamp和Hobson，1982 Br. J. Cancer 46:711-20)。这样的异常增殖是肿瘤生长和转移所必需的(Folkman,1986Cancer Res. 46 :467-73)。 血管内皮细胞增殖在慢性炎症疾病例如类风湿性关节炎、牛皮癣和滑膜炎中也是重要的，其中这些细胞在炎症部位中释放的生长因子作用下增殖(Brown和Weiss，1988，Ann. Rheum. Dis. 47 :881-5)。在动脉粥样硬化中，血管中内皮细胞的单克隆扩增触发动脉粥样硬化病斑的形成(Alpern-Elran 1989, J. Neurosurg. 70 :942-5)。此外,在糖尿病性视网膜病中，失明被认为是由眼内基底膜变化所引起的，眼内基底膜的变化刺激不受控的血管生成和视网膜消耗(West 和 Kumar, 1988, Lancet I :715-6)。内皮细胞还参与移植排斥。在同种异体移植排斥发作时，内皮细胞表达促粘附决定簇，其引导白细胞运输到移植部位。据认为，白细胞粘附分子对移植物中的内皮细胞的诱导可以被局部释放的细胞因子所诱导，正如已知在炎性损害中所发生的。另一方面，消除的血管生成在疾病发生例如动脉粥样硬化诱发的冠状动脉阻塞(如心纹痛)、意外损伤或手术后的坏死损害、年龄相关性黄斑变性或胃肠损害如溃疡中也是一个主要因素。因此，调节或改变血管生成过程在限制该过程促成潜在病状的病理演进方面以及提供研究其病因学的有价值方法方面可具有重要的治疗作用。最近，在开发内皮调节剂(无论是设计为抑制性的还是刺激性的)方面已取得显著进步。例如，给予在置于成年大鼠腹腔中的、胶原蛋白包被基质内的PFGF蛋白，产生完全血管形成并正常灌注的结构(Thompson等，PNAS 86 :7928_7932，1989)。据报道，将β FGF蛋白注射到冠状闭塞期间的成年狗冠状动脉中，导致心肌功能障碍减轻、心肌梗塞缩小和血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，Science 257:1401-1403,1992)。业已报道在心肌局部缺血动物模型中使用β FGF蛋白获得了相似结果(Harada等，J Clin Invest 94:623-630，1994，Unger 等，Am J Physiol 266 :H1588_H1595，1994)。然而，对于长期功能性血管的大量形成，需要重复或长期递送上述蛋白因子，从而限制了它们在临床中的应用。此外，除与血管生成调节因子生产相关的高成本之外，这些因子的有效传递需要使用待植入冠状动脉内的导管，从而进一步增加了治疗的费用和难度。
因此，所有抗血管生成治疗的基本目标都是使增殖微血管的病灶回复到其正常静息状态，并阻止其再生长[Cancer :Principles & Practice of Oncology,第五版,Vincent T. DeVita, Jr. , Samuel Heilman, Steven A. Rosenberg 编辑，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia. (1997)]。同样,促血管生成治疗不仅涉及恢复所需要的血管生成因子，而且涉及重建它们之间的 正确平衡(Dor等，Ann NY Acad Sci 2003 ；995 :208-16)(关于促血管生成治疗和抗血管生成治疗的详尽综述参见Zhang等，Acta Bioch andBiophys Cinica, 2003 :35 :873-880,和 Mariani 等，MedGenMed 2003,5 22 ;和 Folkman,Semin. Onc 2002,29:15-18)。抗血管生成治疗:鉴于抗血管生成治疗可延缓肿瘤生长演进(例如视网膜病、良性的和恶性的血管生成性肿瘤)，其是强有力的临床方法。一般来说，每一种由不受控毛细血管生长引起的疾病，如糖尿病性视网膜病、牛皮癣、关节炎、血管瘤、肿瘤生长和转移，都是抗血管生长治疗的标靶。例如，超过临床上潜伏大小(例如几mm3)的实体瘤的进行性生长需要连续的新血管形成，即已知为肿瘤血管生成的过程。肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的。肿瘤必须连续地刺激新毛细血管的生长，以传递营养和氧供肿瘤自身生长。因此，抗血管生成肿瘤治疗的基础在于阻止肿瘤血管生成或者选择性地破坏肿瘤中已存在的血管(血管靶向疗法)。最近，已开发出许多抗血管生成药剂来治疗恶性疾病，其中一些药剂已处于临床试验中(关于综述，参见 Herbst 等(2002) Semin. Oncol. 29 :66-77,和 Mariani 等，MedGenMed 2003；5 22)。研究的大部分肿瘤抗血管生成治疗标靶是在人体中调节血管生成的主导过程，即血管内皮生长因子(VEGF)与其受体(VEGFR)的相互作用。调节VEGFR的促血管生成作用的药剂包括(i)针对VEGF蛋白本身或其受体的抗体(例如rhuMAb VEGF，阿代司汀(Avastin)) ；(ii)针对VEGFR酪氨酸激酶的小分子化合物(例如，ZD6474和SU5416) ；(iii)靶向VEGFR的核酶。其它新的血管生成抑制剂包括具有独特的抗肿瘤和抗血管生成特性的雌二醇的天然代谢物2-甲氧雌二醇(2-ME2)，以及分别为纤溶酶原和胶原蛋白XVIII的蛋白水解切割片段的血管抑制素(angiostatin)和内皮抑制素(endostatin)。尽管在临床前模型中有前景，但迄今为止在临床试验测试的所有抗血管生成药剂的系统施用都显示出有限的成功率和相当大的毒性,包括血小板减少症、白血球减少和咯血。这些结果提示，目前的肿瘤抗血管生成药剂作为晚期恶性肿瘤疗法的用途可能有限。O' Reilly等已经表明，在抗血管生成治疗开始至抗肿瘤作用出现之间的潜伏期可能导致在对治疗起反应之前的初期肿瘤演进[O' Reilly S等，(1998)Proc Am Soc Clin Oncol17 :217a]。而且，最近的研究提示，毛细血管床之间的血管生成调节可能不同，提示抗血管生成治疗可能需要基于器官/组织特异性来优化[Arap等(1998) Science 279 :377-380]。有趣的是，当对冠状动脉病患者的心肌局部缺血实施针对平滑肌细胞增殖的抗血管生成疗法(例如肝素、肝素-肽治疗)时，获得的效果也不理想[Liu等，Circulation，79 1374-1387(1989) ；GoIdman 等 Atherosclerosis,65 :215-225(1987) ；ffolinsky 等，JACC,15(2) :475-481 (1990)]。与利用这些药剂治疗心血管疾病有关的各种限制包括(i)对心血管疾病患者产生不可耐受的风险水平的系统毒性；(ii)妨碍手术后的血管伤口愈合；
(iii)可能破坏周围的内皮和/或其它中间平滑肌细胞。因此，这些以及其它与系统施用抗血管生成因子相关的固有障碍(即基于体外不稳定性和高剂量需求的制造限制；和归咎于次最佳效应的快速浓注施用的峰动力学)限制了血管生成因子在新血管生成相关疾病治疗中的有效使用。用于癌症的抗血管生成治疗在原发性肿瘤以及转移性肿瘤中的肿瘤细胞增殖由于营养供应受限导致凋亡速率增加而被抵消。只要发生“血管生成转变”和营养供应对肿瘤大小足够，休眠的原发性或转移性肿瘤就开始发展成转移瘤。血管生成转变可经几种机制发生I.通过癌基因上调促血管生成基因，例如VEGF和bFGF，或下调血管生成抑制物， 例如血小板反应蛋白。2.通过肿瘤相关的低氧条件活化低氧诱导因子-I (HIF-I)。3.肿瘤细胞诱导的肿瘤床成纤维细胞的促血管生成蛋白分泌。4.骨髓内皮祖细胞运输入肿瘤。表I :肿瘤血管生成的内源性调节物
权利要求
1.下述核酸构建体在制备用于在有需要的受试者中抑制血管生成的药物中的用途，其中所述的受试者正进行另外的放疗治疗，所述核酸构建体包含 (a)包含具有SEQID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー个拷贝的SEQ ID NO :6所示的序列的顺式调节元件； (b)前内皮素原-I启动子；和 (c)编码细胞毒性多肽的多核苷酸序列，所述细胞毒性多肽包含TNFRl的胞外区，以及Fas细胞毒性多肽的跨膜和胞内区。
2.权利要求I的用途，其中所述的化疗治疗是应用多柔比星的治疗。
3.权利要求I或2的用途，其中，所述的前内皮素原-I启动子是PPE-1-3X启动子，所述的PPE-1-3X启动子与所述编码细胞毒性多肽的多核苷酸序列转录连接，所述细胞毒性多肽包含TNFRl的胞外区，以及Fas细胞毒性多肽的跨膜和胞内区。
4.试剂盒，其包含包装材料，药物组合物，单位剂量的化疗剂和使用说明页，所述试剂盒用于在有需要的受试者中抑制血管生成，所述的药物组合物包含药学上可接受的载体和作为活性成分的下述核酸构建体，所述核酸构建体包含 (a)包含具有SEQID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー个拷贝的如SEQ ID N0:6所示的序列的顺式调节元件； (b)前内皮素原-I启动子；和 (c)编码细胞毒性多肽的多核苷酸，所述细胞毒性多肽包含TNFRl的胞外区，以及Fas细胞毒性多肽的跨膜和胞内区； 其中的使用说明页包括指导施用者所述化疗剂先于、或与所述药物组合物同时施用的说明。
5.权利要求4的试剂盒，其中所述的化疗剂是多柔比星。
6.下述核酸构建体在制备用于在有需要的受试者中抑制血管生成的药物中的用途，其中所述的受试者正接受伴随施用的治疗有效量的前药和另外的放疗治疗，所述核酸构建体包含 (a)包含具有SEQID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー个拷贝的如SEQ ID N0:6所示的序列的顺式调节元件； (b)前内皮素原-I启动子；和 (c)编码自杀基因的多核苷酸，所示自杀基因能将前药转化成毒性化合物。
7.权利要求6的用途，其中，所述自杀基因选自单纯疱疹病毒胸苷激酶、水痘帯状疱疹病毒胸苷激酶和细菌胞嘧啶脱氨酶。
8.权利要求6的用途，其中，所述前药选自更昔洛韦、阿昔洛韦、1-5-碘尿嘧啶FIAU、5-氟胞嘧啶、6-甲氧基嘌呤阿糖苷。
9.权利要求6的用途，其中，所述的自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶，所述的前药是更昔洛,、阿昔洛,或FIAU。
10.试剂盒，其包含包装材料，药物组合物，单位剂量的化疗剂和使用说明页，所述试剂盒用于在有需要的受试者中抑制血管生成，所述的药物组合物包含药学上可接受的载体和作为活性成分的下述核酸构建体，所述核酸构建体包含 (a)包含具有SEQ ID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー个拷贝的如SEQ ID NO :6所示的序列的顺式调节元件； (b)前内皮素原-I启动子；和 (C)编码自杀基因的多核苷酸，所示自杀基因能将前药转化成毒性化合物； 其中的使用说明页包括指导施用者所述化疗剂先于、或与所述药物组合物同时施用的说明。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述的自杀基因是胸苷激酶，并且所述的化疗剂是更昔洛,。
12.下述核酸构建体在制备用于抑制有需要的受试者中的血管生成的药物中的用途，其中所述受试者是进行更昔洛韦和放疗治疗的受试者，所述的核酸构建体包含与编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的多核苷酸转录连接的PPE-1-3X启动子，所述的胸苷激酶能将更昔洛韦转化成毒性化合物。
13.权利要求12的用途，其中，所述的放疗是亚治疗放疗。
14.权利要求I或6的用途，其中，所述的顺式调节元件还包含至少两个拷贝如SEQIDNO 6所示的序列。
15.权利要求I或6的用途，其中，所述的内皮特异性启动子是PPE-I启动子。
16.权利要求I或6的用途，其中，所述的内皮特异性启动子是PPE-1-3X启动子。
17.权利要求I或6的用途，其中，所述的核酸构建体还包含如SEQID NO :5所示的低氧应答元件。
18.权利要求I或6的用途，其中，所述的顺式调节元件如SEQIDNO 7所示。
19.权利要求I或6的用途，其中，所述的核酸构建体包含腺病毒基因组。
20.权利要求I或6的用途，其中，所述的受试者患癌症。
21.权利要求4或10的试剂盒，其中，所述的顺式调节元件还包含至少两个拷贝如SEQID NO 6所示的序列。
22.权利要求4或10的试剂盒，其中所述的内皮特异性启动子是PPE-1-3X启动子。
23.权利要求4或10的试剂盒，其中，所述的核酸构建体还包含如SEQID NO 5所示的低氧应答元件。
24.权利要求4或10的试剂盒，其中，所述的顺式调节元件如SEQID NO 7所示。
25.权利要求4或10的试剂盒，其中，所述的核酸构建体包含腺病毒基因组。
26.权利要求I的用途，或者权利要求4或10任ー项的试剂盒，其中所述的前-内皮素原-I启动子包含SEQ ID NO 1所示的核酸序列。
27.权利要求4，510，11和21-26任一项所述的试剂盒，其中所述的受试者患癌症。
28.核酸构建体，其包含条件复制型腺病毒载体基因组，所述条件复制型腺病毒载体基因组包含与内皮细胞启动子转录连接的腺病毒El区，所述内皮细胞启动子包括含至少ー个拷贝的如SEQ IDNO 6所示序列的顺式调节元件，并且，其中所述的启动子选择性引导所述腺病毒在血管内皮细胞中的转录。
29.权利要求28的核酸构建体，其中，所述的顺式调节元件还包含至少ー个拷贝的如SEQ ID NO :8所示的序列。
30.权利要求28的核酸构建体，其中，所述的顺式调节元件如SEQID NO 7所示。
31.权利要求28的核酸构建体，其中所述的内皮细胞启动子包含至少ー个拷贝的如SEQ ID NO :1所示的序列。
32.权利要求28的核酸构建体，其中，所述的内皮细胞启动子是PPE-1-3X。
33.权利要求28的核酸构建体，其中所述的条件复制型腺病毒载体是5型腺病毒载体。
34.权利要求28的核酸构建体，其中，所述的构建体还包含至少ー个具有SEQID NO:5所示的序列的低氧效应元件。
35.权利要求28的核酸构建体，所述的核酸构建体还包含编码细胞毒性分子的多核苷酸序列。
36.权利要求28的核酸构建体，其中，所述的核酸构建体无报告基因序列。
37.权利要求28所述的核酸构建体，其中，所述的顺式调节元件如SEQID N0:7所示，其中，所述内皮细胞启动子包含至少ー个拷贝的如SEQ ID NO :1所示的序列，其中所述的条件复制型腺病毒载体是5型腺病毒载体，所述的构建体还包含至少ー个具有SEQ ID N05所示的序列的低氧效应元件，并且，其中所述的核酸构建体无报告基因序列。
38.真核细胞，其是经权利要求28-37中任ー项的核酸构建体转化的真核细胞。
39.用于下调组织中的血管生成的药物组合物，所述的药物组合物包含作为活性成分的权利要求28-37中任ー项的核酸构建体，以及药学上可接受的载体。
40.用于治疗受试者中与过度新血管生成相关的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求28-37中任ー项的核酸构建体。
41.权利要求40所述的药物组合物，其中所述的疾病或病症选自糖尿病性视网膜病、牛皮癣、关节炎、血管瘤、肿瘤生长和转移。
全文摘要
公开了表现出内皮细胞特异性启动子活性的分离多核苷酸序列、新顺式调节元件及其使用方法，所述方法能够治疗特征为异常新血管生成或细胞生长的疾病。
文档编号C07K14/575GK102698287SQ201210086460
公开日2012年10月3日 申请日期2005年11月14日 优先权日2004年11月14日
发明者D·哈拉茨, E·布莱特巴特, L·班吉奥, M·佩雷德, S·格林伯格 申请人:脉管生物生长有限公司