含有a型流感特异性启动子的重组293t细胞及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞 及其应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒属于正黏病毒科，是球形负链RNA病毒，其基因组包含8个RNA片段。流 感病毒聚合酶PA、PB1、PB2蛋白组成流感病毒的聚合酶复合体。该聚合酶复合体与流感病 毒RNA片段以及NP蛋白共同组成病毒核糖核蛋白复合体（vRNP)。每一段病毒RNA都由编 码区和两端的非编码区（UTR)组成，非编码区3'端的12个碱基和5'端的13个碱基在八 个片段中是高度保守的，这两段保守碱基部分互补，形成一个部分配对的结构，对于病毒的 转录和复制都是必须的，称为流感病毒的启动子。
[0003] 293T细胞由293细胞衍生而出，293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞 系，同时表达SV40大T抗原。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外蛋 白的便捷方式。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞及其应用。
[0005] 本发明所提供的重组细胞，具体为向293T细胞中转入重组质粒后得到的重组细 胞；所述重组质粒含有融合基因；所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2顺次连接构 成的融合基因（即所述报告基因位于所述片段1和所述片段2之间）；所述片段1的核苷 酸序列为序列表中序列1的第14-58位；所述片段2的核苷酸序列为序列表中序列1的第 1712-1734 位。
[0006] 其中，所述报告基因可为萤火虫荧光素酶编码基因。
[0007] 所述萤火虫荧光素酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第59-1711 位。
[0008] 进一步，所述融合基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第14-1734位。
[0009] 在本发明中，所述出发表达载体具体为pREP4载体。
[0010] 相应的，所述重组质粒具体是按照如下方法制备得到的：（1)用限制性内切酶B smBI酶切序列表中序列1所示的DNA片段，回收酶切片段后与经过同样酶切的pHH21载体 的骨架大片段正向相连，得到中间质粒（命名为pHH21-IAV-Luc质粒）；（2)将所述中间质 粒以Nhel和PciI内切酶酶切，回收酶切所得小片段，补平末端后正向连入经PvuII内切酶 消化的PREP4载体，即获得所述重组质粒（命名为pREP4-IAV-Luc)。
[0011] 所述重组细胞在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0012] (1)制备检测流感病毒的试剂盒；
[0013] (2)制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒；
[0014] (3)制备检测蛋白与流感病毒vRNP互作的试剂盒；
[0015] (4)制备检测化合物与流感病毒vRNP互作的试剂盒。
[0016] 本发明还提供了一种试剂盒。
[0017] 本发明所提供的试剂盒具体为具有如下功能中至少一种的试剂盒，所述试剂盒含 有所述重组细胞：
[0018] (al)检测流感病毒；
[0019] (a2)筛选抗流感病毒药物；
[0020] (a3)检测蛋白与流感病毒vRNP互作；
[0021] (a4)检测化合物与流感病毒vRNP互作。
[0022] 以上所述的流感病毒可为A型流感病毒。
[0023] 所述A型流感病毒进一步可为H1N1亚型流感病毒。
[0024] 在本发明中，所述流感病毒具体为H1N1亚型流感病毒一一A/WSN/33流感病毒。
[0025] 在本发明中，所述蛋白为热休克蛋白70或其片段，具体为由热休克蛋白70的自N 端起第1-385个氨基酸残基组成的蛋白，或由热休克蛋白70的自N端起第386-641个氨基 酸残基组成的蛋白。所述化合物为利巴韦林或金刚烷胺。
[0026] 在本发明中，进行所述检测流感病毒的方法，具体包括如下步骤：
[0027] (a)进行如下实验组和对照组；
[0028] 实验组：将待测样本加到培养有所述重组细胞的培养液中，8_14h(如12h)后收细 胞检测荧光素酶发光量；
[0029] 对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以对照样本替代所述待测样本，其余操作 均与所述实验组相同；所述对照样本为所述实验组中采用的所述待测样本的溶解液；
[0030] (b)根据步骤（a)的检测结果，确定所述待测样本中是否含有流感病毒：若所述实 验组检测到的荧光素酶发光量显著高于所述对照组检测到的荧光素酶发光量（P〈〇. 05)，则 所述待测样本中含有或候选含有流感病毒；反之，则所述待测样本中不含有或候选不含有 流感病毒。
[0031] 在本发明中，进行所述筛选抗流感病毒药物的方法，具体包括如下步骤：
[0032] (a)进行如下实验组和对照组；
[0033] 实验组：将所述重组细胞感染所述流感病毒同时加入待测药物，8_14h(如12h)后 收细胞检测荧光素酶发光量；
[0034] 对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以对照样本替代所述待测药物，其余操作 均与所述实验组相同；所述对照样本为所述实验组中采用的所述待测药物的溶解液（如 DMSO)；
[0035] (b)根据步骤（a)的检测结果，确定所述待测药物是否为抗流感病毒药物：若所述 实验组检测到的荧光素酶发光量显著低于所述对照组检测到的荧光素酶发光量（P〈〇. 05)， 则所述待测药物为或候选为抗流感病毒药物；反之，则所述待测药物不为或候选不为抗流 感病毒药物。
[0036] 在本发明中，进行所述检测蛋白与流感病毒vRNP互作的方法，具体包括如下步 骤：
[0037] (a)进行如下实验组和对照组；
[0038] 实验组：将表达待测蛋白的重组质粒转染所述重组细胞，24h后再共转染所述流 感病毒的PB1、PB2、PA、NP蛋白表达质粒，以及Renilla(海肾荧光素酶报告基因质粒）， 24-48h(如24h)后收细胞检测荧光素酶发光量；
[0039] 对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以构建所述表达待测蛋白的重组质粒时 所用的空载体替代所述表达待测蛋白的重组质粒，其余操作均与所述实验组相同；
[0040] (b)根据步骤（a)的检测结果，确定所述待测蛋白是否与所述流感病毒vRNP互作： 若所述实验组检测到的荧光素酶发光量与所述对照组检测到的荧光素酶发光量有显著差 异（P〈0. 05)，则所述待测蛋白能或候选能与所述流感病毒vRNP互作；反之，则所述待测蛋 白不能或候选不能与所述流感病毒vRNP互作。
[0041] 在本发明中，进行所述检测化合物与流感病毒vRNP互作的方法，具体包括如下步 骤：
[0042] (a)进行如下实验组和对照组；
[0043] 实验组：将待测化合物加到培养有所述重组细胞的培养液中，lh后将所述流感病 毒的PB1、PB2、PA、NP蛋白表达质粒共转染所述重组细胞，转染24-48h(如24h)后收细胞 检测荧光素酶发光量；
[0044] 对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以对照样本替代所述待测化合物，其余操 作均与所述实验组相同；所述对照样本为所述实验组中采用的所述待测化合物的溶解液 (如DMSO);
[0045] (b)根据步骤（a)的检测结果，确定所述待测化合物是否与所述流感病毒vRNP互 作：若所述实验组检测到的荧光素酶发光量与所述对照组检测到的荧光素酶发光量有显著 差异（P〈0. 05)，则所述待测化合物能或候选能与所述流感病毒vRNP互作；反之，则所述待 测化合物不能或候选不能与所述流感病毒vRNP互作。
[0046] 本发明所用的重组质粒pREP4-IAV-Luc以pREP4为载体，同时含有萤火虫荧光素 酶编码基因以及流感病毒核蛋白（NP)基因的启动子。在流感病毒存在的情况下，能够启 动荧光素酶基因的表达，从而通过荧光素酶的表达量变化可以推断A型流感病毒的复制情 况。此外，通过共转流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒可以检测相关蛋白以及化合物与流 感病毒vRNP的互作情况。
【附图说明】
[0047] 图1检测已知抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin)的抗病毒效果。A:没有流感病毒 感染、且未加入利巴韦林的情况（以DMSO作为阴性对照）；B:流感病毒感染、且未加入利巴 韦林的情况（以DMSO作为阴性对照）；C:流感病毒感染、且加入利巴韦林的情况（利巴韦 林溶于DMSO,浓度为10yg/ml)。
[0048] 图2为293T-IAV-Luc以及HeLa-IAV-Luc重组细胞转染表达流感病毒PA、PB1、 PB2、NP基因质粒后荧光素酶活性测量结果。