A:293T-IAV-Luc及对照；B:HeLa-IAV-Luc及 对照。
[0049] 图3为检测热休克蛋白70与流感病毒vRNP互作的结果图。
[0050] 图4为检测已知抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin)与金刚烧胺（Amantadine)与 流感病毒vRNP互作的结果图。A:利巴韦林与流感病毒vRNP互作的结果图；B:金刚烷胺与 流感病毒vRNP互作的结果图。图中，"对照"即表示空白对照组；"vRNP"即表示vRNP对照 组。
【具体实施方式】
[0051] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053] 293T细胞（人肾上皮细胞）：购自ATCC，细胞系编号为CRL-11268。
[0054] Hela细胞（子宫颈癌细胞）：购自ATCC，细胞系编号为：CCL_2。
[0055] DMEM培养基（Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium):购自Gibco公司。
[0056] 转染试剂PEI :购自Polyscience公司。
[0057] 焚光素酶活性测量试剂盒：购自Promega公司。
[0058] 三氮挫核苷病毒挫（利巴韦林）：购自Sigma公司；
[0059] 金刚烷胺：购自Sigma公司。
[0060]潮霉素（Hygromycin):购自Roche公司。
[0061]A/WSN/33流感病毒毒株：为A型流感病毒H1N1亚型毒株，该毒株记载于"Neumann Gl,ffatanabe T,Ito H, et al. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.PNAS, 1999(16):9345-9350"一文，公众可从中国科学院微生物学研宄所获 得。
[0062]pREP4载体：记载于"李云芳，张幼怡，侯嵘等?质粒转染对HEK293和DDT1-MF2 细胞天然0 2-肾上腺素受体表达的影响.北京大学学报：医学版，2001年底5期" 一文， 公众可从中国科学院微生物学研宄所获得。
[0063]表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒：记载于"ZhangJ，LiuT，TongX，et al.IdentificationofnovelvirusinhibitorsbyinfluenzaAvirusspecific reportercellbasedscreening.AntiviralRas, 2012 (1) : 48-54" 一文，公众可从中国科 学院微生物学研宄所获得。
[0064] 实施例1、含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞的构建
[0065] 一、pREP4-IAV-Luc质粒的构建及转染293T细胞
[0066] l、pREP4-IAV_Luc质粒的构建
[0067] 人工合成序列表中序列1所示DNA片段。序列1共由1748个核苷酸组成，第14-58 位记为片段1，第59-1711位为萤火虫荧光素酶编码基因（报告基因），第1712-1734位记 为片段2,两端为BsmBI的识别位点序列。其中，片段1和片段2均为流感病毒NP蛋白的 启动子，在流感病毒存在的情况下，位于该融合质粒上的该启动子可被启动，萤火虫荧光素 酶才能够表达。
[0068] 用限制性内切酶BsmBI酶切序列表中序列1所示的DNA片段，回收酶切片段后与 经过同样酶切的PHH21载体的骨架大片段正向相连，将测序验证正确的中间质粒命名为 pHH21-IAV-Luc质粒。将pHH21-IAV-Luc质粒以Nhel和Pcil内切酶（Takara)酶切，回收 酶切片段，以Klenow酶（购自Takara公司）补平末端后连入PvuII内切酶消化的pREP4 载体，将测序验证正确的重组质粒命名为pREP4-IAV-Luc。
[0069] 2、pREP4-IAV-Luc质粒转染 293T细胞
[0070] pREP4-IAV-Luc质粒扩增后，测量质粒浓度，用转染试剂PEI转染3 yg pREP4-IAV-Luc质粒至3. 5cm培养皿中的293T细胞。用含10% (体积分数）胎牛血清的DMEM培养基培养细胞。
[0071] 二、筛选稳定表达流感特异启动子报告基因的单克隆细胞
[0072] 转染36h之后，将细胞按1:384的比例传代至10cm细胞培养皿，24小时后更换新 鲜培养基，并加入250yg/ml的潮霉素进行筛选，每隔2-3天换新鲜培养基，同时维持潮霉 素的筛选压力，两周后从l〇cm细胞培养皿中挑取单克隆细胞至24孔板，扩大培养，最终获 得稳定表达流感特异启动子报告基因的单克隆细胞系，命名为293T-IAV-LUC。从所得的若 干单克隆细胞系中随机选取3个，编号为1-3,进行如下功能研宄。
[0073]三、293T-IAV-Luc细胞的增殖
[0074] 在获得293T-IAV-LUC细胞系后，增殖细胞时潮霉素浓度改为100yg/ml，并对细 胞进行冻存。
[0075]四、293T-IAV-Luc细胞的鉴定
[0076] 将293T-IAV-LUC细胞传代至24孔板中，过夜培养后，吸弃培养基，以PBS溶液洗 涤后，不接种或接种A/WSN/33病毒（MOI= 1)，12h后收集细胞测量荧光酶活性，具体为通 过荧光素酶活性测量试剂盒在glomax仪（Promega公司产品）读取荧光素酶发光量（荧光 素酶发光量与样品中荧光素酶活性成正比），实验重复测定三次，结果取平均值。
[0077] 编号为1的293T-IAV-LUC的研宄结果显示，在不接种病毒（对照组）时，只能检 测到本底的酶活性，而在接种病毒后酶活性高达2. 2X105,极显著高于对照组（P〈0. 01)。另 夕卜，其余编号为2、3的两个293T-IAV-Luc的研宄结果也显示接种病毒后酶活性极显著高于 相应的对照组。此结果说明以上所得的293T-IAV-LUC细胞系能够反应流感病毒在细胞中 的转录活性。
[0078] 实施例2、含有pREP4-IAV-Luc重组质粒的293T-IAV-Luc重组细胞系的应用
[0079] -、检测已知抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin)的抗病毒效果
[0080] 293T-IAV-Luc细胞接种14h后分别进行三种处理：未感染病毒（组1)，感染A/ WSN/33流感病毒（MOI= 1)(组2,不加入利巴韦林，但加入DMS0)，感染A/WSN/33流感病毒 (MOI= 1)的同时加入10mg/L的利巴韦林（组3,利巴韦林溶于DMS0中）。12h后收集细 胞，采用实施例1的方法测量荧光素酶发光量。
[0081] 编号为1的293T-IAV-LUC的研宄结果如图1所示，在没有流感病毒感染的情况下 (图1中A)，几乎检测不到荧光素酶发光量（组1);而在流感病毒感染后（图1中B)，荧 光素酶发光量极大地提高（组2);而再加入一种抗病毒药物利巴韦林后（图1中C)，荧光 素酶发光量处于非常低的水平（组3)，显著低于组2 (P〈0. 05)。另外，其余编号为2、3的两 个293T-IAV-LUC的研宄结果也显示组3的荧光素酶发光量显著高于相应的组2。这说明 293T-IAV-LUC细胞系适用于抗流感病毒药物的筛选。
[0082] M0I=病毒粒子个数与细胞个数的比值。
[0083]二、293T-IAV-Luc以及HeLa-IAV-Luc重组细胞转染表达流感病毒PA、PB1、PB2、 NP基因质粒后荧光素酶活性测量结果比较
[0084]HeLa-IAV-Luc重组细胞：参照实施例1的方法，仅将其中的293T细胞替换为 HeLa，构建得到HeLa-IAV-Luc重组细胞。
[0085] 293T-IAV-Luc以及HeLa-IAV-Luc重组细胞24孔板接种15小时后，PEI共转表 达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒各0. 4yg，转染6小时后换液，24小时后收细胞，采 用实施例1的方法测量荧光素酶发光量。实验同时设置未经转染的293T-IAV-LUC以及 HeLa-IAV-Luc重组细胞作为对照组。
[0086] 编号为1的293T-IAV-Luc的研宄结果如图2所示。293T-IAV-Luc重组细胞转染 流感病毒表达质粒后荧光素酶发光量由对照组的40上升到2. 1X105(图2中A，P〈0. 01)， 而HeLa-IAV-Luc重组细胞转染流感病毒表达质粒后荧光素酶发光量仅由对照组的30上升 到4000 (图2中B，P>0. 05)。以上结果表明，293T-IAV-Luc重组细胞相对于HeLa-IAV-Luc 重组细胞而言，还可以用于流感病毒