vRNP活性的检测。
[0087] 三、热休克蛋白70与流感病毒vRNP的互作
[0088] 热休克蛋白70是一种在宿主细胞中广泛存在的应激蛋白，其氨基端1-385为 ATPase结合域，羧基端386-641为肽段结合区，两者之间有一段不保守的序列相连。现有 技术公知由热休克蛋白70的第1-385位氨基酸残基表达的蛋白可与流感病毒vRNP互作， 降低其活性；而由热休克蛋白70的第386-641位氨基酸残基表达的蛋白不能与流感病毒 vRNP互作（具体参见"LiGl,ZhangJ,TongX，etal.Heatshockprotein70inhibits theactivityofInfluenzaAvirusribonucleoproteinandblocksthereplication ofvirusinvitroandinvivo.PLoSOne. 2011Feb24 ；6(2):el6546.doi:10.1371/ journal,pone. 0016546. " 一文）〇
[0089] 1、构建热休克蛋白70(l_385aa)及（386_641aa)段的表达质粒
[0090] 采用的骨架载体为pCMV-Myc，酶切位点为Bglll和Xhol。具体构建方法如下：
[0091] (1)根据如下两个靶基因分别设计两对引物，并在两个上游引物的5'端引入酶切 位点Bglll的识别序列，在两个下游引物的5'端引入酶切位点Xhol的识别序列。其中，两 个靶基因分别为编码热休克蛋白70 (l-385aa)的编码基因（序列2的第1-1155位），以及 编码热休克蛋白70 (386-641aa)的编码基因（序列2的第1156-1926位）。分别以两个靶 基因作为模板，采用两个引物对（在用于扩增第一个靶基因的引物对的下游引物酶切位点 Xhol的识别序列后已加上终止密码子的反向互补序列CTA，在用于扩增第二个靶基因的引 物对的上游引物酶切位点Bglll的识别序列后已加上起始密码子ATG)分别进行PCR扩增， 得到两个DNA片段。
[0092] (2)将（1)得到的两个DNA片段分别经Bglll和Xhol双酶切后，连接到经Bglll 和Xhol酶切的pCMV-Myc载体（购自clonetech公司）上，得到重组质粒。将重组质粒转 入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进 行测序验证。将经测序表明在pCMV-Myc载体的酶切位点Bglll和Xhol之间插入了 "序列 表中序列2的第1-1155位+TAG"的重组质粒命名为pCMV-Myc-Hsp70(l-385);将经测序表 明在pCMV-Myc载体的酶切位点Bglll和Xhol之间插入了 "ATG+序列表中序列2的的第 1156-1926 位"的重组质粒命名为pCMV-Myc-Hsp70 (386-641)。
[0093] 2、转染并测定荧光素酶发光量
[0094] 293T-IAV-Luc重组细胞24孔板接种15小时后，分别将步骤1构建得到的热 休克蛋白70(l-385aa)段的表达质粒和热休克蛋白70(386-641aa)段的表达质粒转染 293T-IAV-Luc重组细胞，24h后将表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒和海肾荧光素酶 表达质粒（该质粒购自Promega)各0. 4yg共转293T-IAV-Luc重组细胞，转染6小时后换 液，24小时后收细胞，采用实施例1的方法检测荧光素酶发光量。实验同时设置以pCMV-Myc空载体替代pCMV-Myc-Hsp70 (1-385)或pCMV-Myc-Hsp70 (386-641)的对照。
[0095] 编号为1的293T-IAV-Luc的研宄结果如图3所示。与对照组相比，转染热休克蛋 白70(l-385aa)能将流感病毒vRNP活性降低90% (P〈0. 01);而热休克蛋白70(386-641aa) 与对照组相比无显著差异（P>〇. 05)。以上结果与现有报道一致，说明293T-IAV-LUC重组细 胞可用于相关蛋白与流感病毒vRNP互作的研宄。
[0096] 四、已知抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin)与金刚烧胺（Amantadine)与流感病毒 vRNP互作的结果
[0097] 293T-IAV-Luc重组细胞24孔板接种15小时后，PEI共转表达流感病毒PA、PB1、 PB2、NP基因质粒各0. 4yg，转染前1小时换液，分别换正常含10yg/ml利巴韦林或20yg/ ml金刚烷胺（药物溶于DMSO)的培养基。转染6小时后换液，24小时后收细胞，采用实施 例1的方法检测荧光素酶发光量。实验同时设置转染前未添加利巴韦林和金刚烷胺（以等 量DMS0替代药物）的293T-IAV-Luc重组细胞作为vRNP对照，设置未转染且未添加利巴韦 林和金刚烷胺（以等量DMS0替代药物）的293T-IAV-LUC重组细胞作为空白对照。实验重 复两次，每次3个平行。
[0098] 编号为1的293T-IAV-Luc的研宄结果如图4所示。利巴韦林作为已知的抗病毒药 物，主要作用机制是抑制流感病毒的聚合酶的活性，本发明的检测结果恰恰显示，与未加入 利巴韦林（以等量DMS0替代药物）的vRNP对照相比，加入利巴韦林后流感病毒聚合酶活性 降低（图4中A，P〈0. 05)。金刚烷胺作为已知的抗流感病毒药物，主要是抑制M2离子通道 的活性，本发明的检测结果恰恰显示，与未加入金刚烷胺（以等量DMS0替代药物）的vRNP 对照相比，加入金刚烷胺后对流感病毒vRNP活性没有显著抑制作用（图4中B，P>0. 05)。 以上结果充分说明293T-IAV-LUC重组细胞可用于相关化合物与流感病毒vRNP互作的研 宄。
【主权项】
1. 一种重组细胞，为向293T细胞中转入重组质粒后得到的重组细胞； 所述重组质粒含有融合基因； 所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2顺次连接构成的融合基因；所述片段1 的核苷酸序列为序列表中序列1的第14-58位；所述片段2的核苷酸序列为序列表中序列 1 的第 1712-1734 位。
2. 根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于：所述报告基因是萤火虫荧光素酶编 码基因。
3. 根据权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于：所述融合基因的核苷酸序列为 序列表中序列1的第14-1734位。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的重组细胞，其特征在于：所述重组质粒为在出发表 达载体的多克隆位点间插入所述融合基因后得到的重组质粒；所述出发表达载体为PREP4 载体。
5. 权利要求1-4中任一所述的重组细胞在如下任一中的应用： (1) 制备检测流感病毒的试剂盒； (2) 制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒； (3) 制备检测蛋白与流感病毒vRNP互作的试剂盒； (4) 制备检测化合物与流感病毒vRNP互作的试剂盒。
6.具有如下功能中至少一种的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-4中 任一所述的重组细胞： (al)检测流感病毒； (a2)筛选抗流感病毒药物； (a3)检测蛋白与流感病毒vRNP互作； (a4)检测化合物与流感病毒vRNP互作。
7. 根据权利要求5所述的应用或权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述流感病 毒为A型流感病毒。
8. 根据权利要求7所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述A型流感病毒为H1N1亚型 流感病毒。
9. 根据权利要求8所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述H1N1亚型流感病毒为A/ WSN/33流感病毒。
10.根据权利要求5-9中任一所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述蛋白为热休克蛋 白70或其片段；或 所述化合物为利巴韦林或金刚烷胺。
【专利摘要】本发明公开了一种含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞及其应用。本发明所提供的重组细胞为向293T细胞中转入重组质粒后得到的重组细胞；所述重组质粒含有融合基因；所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2顺次连接构成的融合基因；所述片段1的核苷酸序列为序列表中序列1的第14-58位；所述片段2的核苷酸序列为序列表中序列1的第1712-1734位。本发明所提供的重组细胞可以通过检查报告基因的表达水平研究相关蛋白及化合物与流感病毒vRNP的相互作用、监测流感病毒的繁殖程度，同时可用于有效筛选抗流感病毒药物。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-66, C12Q1-68, C12N5-10, C12Q1-02, C12Q1-70
【公开号】CN104593330
【申请号】CN201510025839
【发明人】叶昕, 秦玉洁, 童晓梅, 胡毅, 张廷虹, 叶榛
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月19日