诱导dc成熟并分泌高浓度促炎因子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫细胞体外培养领域，涉及诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的 方法。
【背景技术】
[0002]DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞（antigenpresentingcell,APC) 〇 近年来，以树突状细胞（dendriticcell，DC)为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已取得较大 进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临床应用前 景。目前，从外周血单个核细胞（PBMC)经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基本得 到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，国内主要采用TNF-a因子，但该方法活 化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度上限 制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完 善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
[0003]DC在肿瘤、感染、器官移植等领域已显示出其免疫治疗的安全性及有效性，但体内 DC数量极少，故目前临床所用DC多是采集DC前体细胞经体外培养得到。DC前体细胞经不 同细胞因子作用，诱导出未成熟DC(immatureDC，iDC)摄取和加工抗原；然后再经不同的 促成熟因子作用，生成成熟DC(matureDC，mDC)，其成熟状态决定机体免疫调节的方向。只 有成熟DC才能有效呈递抗原，表达各种表面分子和共刺激分子，分泌多种细胞因子，提供 三种信号活化T淋巴细胞，激活特异性细胞免疫反应，诱导Thl型免疫反应。在抗肿瘤免疫 反应中，Thl免疫反应被认为在抗肿瘤免疫中发挥重要作用；而Th2以及Treg反应则被认 为引起免疫耐受。在这个过程中，DC细胞分泌的促炎因子IL-12水平起了关键性的作用。 高水平的IL-12被证实可有效极化Thl细胞的产生，从而辅助诱导抗原特异性的CD8+CTL 细胞生成。此外，IL-12还可直接作用⑶8+T细胞使其增殖，增强细胞免疫效应以及形成长 久记忆性T淋巴细胞。因此，能够分泌高水平的IL-12是DC细胞生物活性高的标志之一。
[0004] 现有的DC培养技术未能足够重视DC促成熟过程，同时考虑成本因素，往往仅用干 扰素a作为促成熟因子。实验研宄表明干扰素a促成熟DC细胞成熟度不足，表面标记表达 低，促炎因子分泌低，活化免疫功能差。因此有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完 善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法。
[0006] 为实现上述目的，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诱导DC成熟并分泌 高浓度促炎因子的方法。根据本发明的实施例，该方法的步骤为：将前体单核细胞用新鲜的 无血清树突状细胞培养液悬浮，使细胞密度为2X105-lxl06/ml，在37°C，5 %C02培养箱中培 养5-6天，然后加入IL-1 0与TLR刺激，并于37°C，5 %C02培养箱培养24-48小时后收获 成熟的树突状细胞。
[0007] 根据本发明的实施例，所述IL-1 0的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是 l-50ng/ml〇
[0008] 根据本发明的实施例，所述IL-1 0的用量为1000U/ml，TLR的用量为5ng/ml。
[0009] 根据本发明的实施例，所述前体单核细胞是外周血单个核细胞。
[0010] 根据本发明的实施例，所述的无血清树突状细胞培养液是含有500U/ml的GM-CSF 和400U/ml的IL-4的无血清培养液。
[0011] 根据本发明的实施例，所述的无血清培养液是LifeTechnology公司的AIM-V，或 者Lonza公司的X-VIV0。
[0012] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了所述方法制备得到的成熟DC细胞用于 制备临床细胞治疗和肿瘤免疫治疗药物或疫苗的用途。
[0013] 根据本发明的又一方面，本发明提供了一种组合物，由IL-ie与TLR组成，在树突 状细胞培养液中，IL-1 0的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是l-50ng/ml。
[0014] 根据本发明的实施例，所述IL-1 0的用量是1000U/ml;TLR的用量是5ng/ml。
[0015] 其中，IL-10是重要的促DC活化的炎性因子，能够促进DC细胞IL-12的分泌。 TLR(Toll-likerec印tor，Toll样受体）是近年来DC活化新的研宄热点，能使DC上调炎 性因子的分泌，下调抑制因子IL-10的表达，促进DC诱导Thl型的免疫反应。本发明的 发明人经过大量创造性的劳动，惊奇的发现，当在树突状细胞培养液里，IL-10的用量是 500-10000U/ml，优选1000U/ml，TLR的用量是l-50ng/ml，优选5ng/ml时，所制备的成熟DC 细胞具有完全的成熟表型，能够高水平表达细胞表面分子，同时高水平分泌IL-12。进而能 更有效地诱导Thl的抗肿瘤免疫及抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)反应。本发明 将在临床肿瘤免疫治疗的应用研宄领域发挥重要作用。同时发明人发现，当IL-10与TLR 的用量低于用量范围时活化效果降低，高于用量范围时DC活性受到影响。
[0016] 根据本发明的实施例，在本发明的组合物中，所述的树突状细胞培养液是无 血清细胞培养液，例如，美国LifeTechnologies公司的无血清细胞培养液（AIM-V? Serum-freeMedium)。其他常用于树突状细胞的必需培养基液可用于本发明。
[0017] 根据本发明的实施例，本发明采用的未成熟树突状细胞是采用外周血贴壁的单核 细胞在LifeTechnologies公司的树突状细胞专用的无血清培养液中进行常规培养至第5 天而收集的悬浮生长的未成熟树突状细胞。
[0018] 根据本发明的另一方面，本发明提供了前述组合物在促进树突状细胞成熟中的用 途。
【附图说明】
[0019] 图1为培养第6天DC细胞形态图（显微镜400X);
[0020] 图2为DC表面分子表达图；
[0021] 图3为成熟DC分泌高水平促炎因子IL-12,低水平抑制因子IL-10图；
[0022] 图4为抗原负载并促成熟DC能有效诱导自体、异体T细胞增殖图；
[0023] 图5为抗原负载并促成熟DC能有效诱导自体T细胞分泌高水平IFN，高表达 CD107a图；
[0024] 图6为抗原负载并促成熟DC能有效诱导HBcAg抗原特异性CTL图。
[0025] 图7为HBVc特异性五聚体流式检测图。
【具体实施方式】
[0026] 下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本 发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的 文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。
[0027] 实施例1 :DC细胞培养及其效果验证试验
[0028] 1、DC细胞培养试验
[0029] 1. 1志愿者2名，知情告知并签署知情同意书，用肝素钠抗凝管分别抽取外周静 脉血 50ml。淋巴细胞分离液（FreseniusKabiNorgeAS、Lymphoprep?)分离PBMC后， 用新鲜的无血清树突状细胞培养液（LifeTechnology公司的AM-V)悬浮，细胞密度在 2xl05-lxl06/ml，37°C，5% (：02培养箱中培养。
[0030] 1. 2 培养 5-6 天后加入IL-1 0 1000U/ml，TLR5ng/ml刺激，再在 37°C，5% (：02培 养箱中培养24-48小时后收获成熟的树突状细胞。在第6天IL-1 0和TLR刺激前观察细 胞形态，如图1。从图1可以看出，两位志愿者的细胞均表现为半贴壁状态，细胞圆而透亮， 表面有细小轴突，大部分为单个，少数聚集成簇，即为未成熟的DC典型形态。
[0031] 2、效果验证试验
[0032] 2. 1研宄DC表面marker的表达
[0033] 将上述1. 1步骤中的细胞在培养第5天，用2ug/mlHBVcore抗原（深圳市菲鹏生 物，HBcAg-1#)负载DC。24小时后，加入IL-10 1000U/ml，TLR5ng/ml，加入量均为每毫升 培养液。37°C，5%C02培养箱中培养24h后用BDCANT0II流式细胞仪检测HLA-DR(MHC-II 类分子，含有2个分子量分别为36kD和27kD的亚基（a亚基和0亚基））、⑶86、⑶80、 CD83、CCR7(C