一种汗腺分化诱导培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种汗腺分化诱导培养基及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前对于诱导人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs)和/或脐带间充质干细胞 (hUC-MSCs)向汗腺细胞分化可以采用与热休克汗腺细胞共培养或培养于含热休克汗腺培 养基的上清液的方法获得具有汗腺细胞表型特征的BM-MSCs和/或hUC-MSCs。而采用以上 方法获得汗腺样细胞（SGCs) -般需要从供体获得正常汗腺组织（sweat glands，SGs)，继 而采用相应的诱导方式获取SGCs。而对于以上汗腺诱导方法，一方面需要等待获取正常的 SGs，另一方面对于诱导MSCs向SGCs分化的关键调控基因不明确，因此无法配制成品化的 汗腺分化诱导培养基，上述诱导方法受到SGs来源的限制而无法广泛开展。
[0003] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种汗腺分化诱导培养基，以重组人角化细胞生长因 子（rhKGF)作为关键调控因子，在原有汗腺细胞培养基的基础上构建出成品化的汗腺分化 诱导培养基，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研宄及临床应用。
[0005] 本发明的第二目的在于提供一种所述的汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充 质干细胞向汗腺样细胞分化中的应用，所述的汗腺分化诱导培养基能够诱导人脐带间充质 干细胞（hUC-MSCs)向汗腺样细胞（SGCs)分化，得到汗腺样细胞，以解决【背景技术】中的不 足。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0007] 一种汗腺分化诱导培养基，其特征在于，在低糖DMEM培养基中添加以下成分： 以低糖DMEM培养基的体积计，胎牛血清的体积分数为8-15 %，半琥珀酰氢化可的松 0.3-〇.5yg/ml，rh-KGF 10-100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸 l_3nmol/ml，rh-EGF 10-100ng/ ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0. 05-0. 2ml/ml ;
[0008] 其中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液包含以下成分：胰岛素0. 〇lg/L，人 转运铁蛋白〇? 〇〇55g/L，亚硒酸0? 000006g/L。
[0009] 本发明提供的汗腺分化诱导培养基，以重组人角化细胞生长因子（rhKGF)作为关 键调控因子，在原有汗腺细胞培养基的基础上构建出的成品化的汗腺分化诱导培养基，该 汗腺分化诱导培养基能够诱导人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs)向汗腺样细胞（SGCs)分 化，得到汗腺样细胞，结果稳定可靠，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研 宄及临床应用。
[0010] 为了使达到更好的培养效果，优选地，胎牛血清为特级胎牛血清。
[0011] 为了使汗腺分化诱导培养基更好的发挥诱导作用，以获得性状更明显的汗腺样细 胞，优选地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 20-100ng/ml。
[0012] 进一步地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 40-100ng/ml。
[0013] 更进一步地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 40ng/ml。
[0014] 为了增强各成分之间的协同配合作用，以得到更好表达的汗腺样细胞，优选地，以 低糖DMEM培养基的体积计，胎牛血清的体积分数为10 %，半琥珀酰氢化可的松0. 4 y g/ ml，三碘甲状腺原氨酸2nmol/ml，rh-EGF 10_50ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液 0. lml/ml ；
[0015] 其中，所述胰岛素_转铁蛋白-亚硒酸钠溶液包含以下成分：胰岛素0.01g/L，人 转运铁蛋白〇? 〇〇55g/L，亚硒酸0? 000006g/L。
[0016] 更优选地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-EGF 10ng/ml。
[0017] 此外，为了防止细胞在培养过程中受到污染，优选地，所述汗腺分化诱导培养基还 包括：以低糖DMEM培养基的体积计，青霉素90-110U/ml，链霉素90-110 y g/ml。
[0018] 进一步地，以低糖DMEM培养基的体积计，青霉素100U/ml，链霉素100yg/ml。
[0019] 本发明还提供了所述的汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充质干细胞向汗腺 样细胞分化中的应用。
[0020] 3-5代的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs)的细胞增殖、分化活性最强，优选地，所 述人脐带间充质干细胞采用3-5代细胞。
[0021] 优选地，细胞诱导的时间为20-25天，优选为21天。该培养天数，人脐带间充质干 细胞被诱导向汗腺样细胞分化，得到汗腺样细胞。
[0022] 为了使诱导过程的顺利进行，进一步地，所述人脐带间充质干细胞以IX 104/孔的 密度接种进行培养；
[0023] 在培养过程中优选为2-3天更换1次培养基。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0025] (1)本发明提供了一种汗腺分化诱导培养基，以重组人角化细胞生长因子 (rhKGF)作为关键调控因子，在原有汗腺细胞培养基的基础上构建出成品化的汗腺分化诱 导培养基，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研宄及临床应用；
[0026] (2)为了增强各成分之间的协同配合作用，以得到更好表达的汗腺样细胞，本发明 限定了汗腺分化诱导培养基各成分之间的配比；
[0027] (3)本发明还提供了汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细 胞分化中的应用，并限定了培养的细胞、接种的密度以及培养的天数等条件，以稳定获得汗 腺样细胞。
【附图说明】
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0029] 图1为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的表型鉴定图；
[0030] 图2为本发明实施例1中hUC-MSCs多向分化潜能鉴定电镜图；
[0031] 图3为本发明实施例2和3中汗腺样细胞的细胞形态及表型鉴定图；
[0032] 图4为本发明实施例3中不同浓度的rhKGF诱导表达汗腺表面标记物抗原CEA、 CK14、CK19活性的柱形图。
【具体实施方式】
[0033] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售获得的常规产品。
[0034] 实施例1
[0035] 一、脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定
[0036] 1.脐带间充质干细胞的分离、培养
[0037] (1)新鲜脐带组织在获得患者知情同意的情况下以医疗废物的形式采集后，以无 菌方式保存在4°C的转运盒内，并于6h内切除脐带双侧带有夹痕及淤血的部分；
[0038] (2)用含青霉素（100U/ml)和链霉素（100 y g/ml)的磷酸盐溶液（PBS缓冲液）冲 洗脐带外周以及脐静脉内腔；
[0039] (3)然后将脐带组织剪切成0. 5-1. 0_3的组织块，直接加入lg/L的II型胶原酶 溶液置于37°C保温箱中孵育16h ;
[0040] (4)用PBS溶液洗涤脐带组织后，加入25g/L胰蛋白酶继续在37°C保温箱中孵育 0. 5h；
[0041] (5)加入体积分数为20%胎牛血清的培养基，以直径为100 ym的滤网过滤细胞， 收集滤液；
[0042] (6) PBS溶液洗绦细胞，1500rpm离心20min后，弃上清；
[0043] (7)以普通脐带间充质干细胞培养基重悬细胞，按IX 103/cm2的密度将细胞接种 于25cm2培养瓶中；
[0044] (8) 3d后首次换液，以后每2-3d更换细胞培养液1次；
[0045] (9)观察贴壁细胞生长，当细胞达70%?80%融合时，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 消化液（EDTA)消化细胞然后进行对其进行传代培养、扩增细胞；
[0046] (10)镜下观察细胞生长、增殖活性。
[0047] 2. hUC-MSCs 鉴定及存储
[0048] (1)形态学观察