一种粳稻花药分化培养基配方的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粳稻花药分化培养基，具体涉及一种高效率地提高粳稻花药愈伤 组织绿苗分化率、降低白化率的分化培养基配方，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技 术，接种在人工培养基上以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分 裂，形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织-愈伤组织，或分化成胚状体，随后使愈 伤组织分化成完整的植株的过程，因此花药培养育种也叫单倍体育种。
[0003] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一。1968年，日本新关和大野通过花药离体培 养获得水稻花粉植株，揭开了人类利用花药创造水稻新种质的序幕，为作物育种开辟了一 条新的有效途径。随后，利用该技术选育水稻品种受到各国育种家的普遍重视。水稻花药 培养育种主要特点表现为缩短育种周期，提高选择效率，加速有效性状转移等。水稻花药培 养育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术育种相结合，发展形成 了一套育种技术体系，在传统农业向高技术农业的转化中发挥着纽带作用。
[0004] 我国自1970年开始水稻花培技术研宄，1975年天津市农科所(现天津市作物所前 身)与中国科学院遗传所合作，用单倍体育种法育出了两个花培品种-花育1号和2号，1977 年在日本召开的国际作物育种方法研讨会上，大野清春指出花育1号和2号为花药培养最 早育成的品种。我国实现了花培育种从理论到应用的突破，也促进了国内外的花培育种技 术的发展。随着花药培养的遗传特性、生理生化等不断深入研宄，现在水稻花药培养已经成 为当今生物技术育种中较为实用、有效的育种新技术，我国水稻花药培养育种的应用研宄 在国际上一直保持领先地位。
[0005] 花培再生植株的数量是品种选育的重中之重。由于受培养基组分、材料的差异性 以及培养环境等的影响，目前花培效率还不够理想，获得的再生植株群体小，花培后代的表 现型不充足，这使选择、利用受到较大的限制。花培植株的生长发育受很多因素的影响，包 括培养基的改良、附加成分的增减、单倍体的加倍技术、培养条件的改善等等，其目的都在 于提高愈伤组织的诱导率和绿苗的分化率。其中培养基是花药培养的物质基础，直接关系 到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分 的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。继续筛选和优 化基本培养基，提高培养基选用的针对性，是提高花药培养力的有效措施；大量的研宄发现 一些有机附加物可以显著提高花药培养力，发现和优化组合花药培养有机附加物质，可进 一步提高花药培养力。因此，组合和优化培养基组分，摸索出高效的水稻花药培养基配方是 提高花药培养效率的关键。
[0006] 在多年的粳稻花药培养的摸索和实践中，我们不断优化培养基配方，并且不断尝 试加入一些提高粳稻绿苗分化率的添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种能 够显著提高粳稻绿苗分化率、降低白化率的粳稻花药愈伤组织分化培养基配方。我们的研 宄结果对于进一步推广和应用水稻单倍体育种和理论研宄无疑有较大的现实意义和实用 价值。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了种粳稻花药分化培养基，该培养基的配方如下： KNO3 2820 ~3080mg/L，C8H7O2K 1800 ~2000mg/L，（NH4)2SO4 400 ~460mg/L，KH2PO4 320 ~380mg/L，CaCl2 100 ~120mg/L，MgSO4 80 ~90mg/L，Na2-EDTA 30 ~35mg/L， FeSO4* 7H 20 22 ~26mg/L，MnSO4* H 20 2. 8 ~3. 2mg/L，ZnSO4* H 20 1. 2 ~I. 4mg/L，H3BO3 1. 3 ~I. 5mg/L，KI 0? 6 ~0? 7mg/L，CuSO4* 5H 20 0? 04 ~0? 06mg/L，Na2MoO4* 2H 20 0? 14 ~ 0? 18mg/L，CoCl2* 6H 20 0? 14 ~0? 18mg/L，丙三醇 0? 8 ~1.0 mg/L，甘氛酸 L 8 ~2. 2mg/ L，叶酸0.35~0.45mg/L，甲基亚硝基脲LI~1.3mg/L，丙氨酸LI~1.3mg/L，赖氨酸 1.3~1.511^/]^，维生素1314.5~5.511^/]^，维生素136 0.9~1.111^/]^，3-吡啶甲酸0.9~ I. lmg/L，鹿糖23~27g/L，植物凝胶5~6g/L ; NAA 0.045 ~0.055mg/L，6-BA 1.8 ~2.2mg/L，调环酸钙 0.6 ~0.8mg/L，山梨醇 23 ~ 27g/L，L-脯氨酸100~140mg/L，水解蛋白0? 9~I. lg/L，秋水仙碱0? 18~0? 22mg/L， 生物素 〇? 07 ~〇? 09mg/L，PH 5. 8-6. 0。
[0008] 本发明所述的培养基具有高效率地提高粳稻花药愈伤组织绿苗分化率、降低白化 率的优点，可以显著提高粳稻花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映 本发明所述培养基的特点。
【具体实施方式】 [0009] 实施例1 配制如下配方的培养基： KNO3 2950mg/L, C8H7O2K 1900mg/L, (NH4)2SO4 430mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2 IlOmg/ L，MgS04 85mg/L，Na2-EDTA 32. 5mg/L，FeSO4* 7H20 24mg/L，MnSO4* H2O 3. Omg/L，ZnSO4* H2O I. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0. 65mg/L，CuSO4* 5H20 0. 05mg/L，Na2MoO4* 2H20 0. 16mg/L， C〇C12?6H20 0.16mg/L，丙三醇 0.9mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，叶酸 0.4mg/L，甲基亚硝基脲 I. 2mg/L，丙氨酸 I. 2mg/L，赖氨酸 I. 4mg/L，维生素 BI 5. Omg/L，维生素 B6 1.0 mg/L，3- [!比 啶甲酸l.0mg/L，蔗糖25g/L，植物凝胶5.5g/L; NAA 0.05mg/L，6-BA 2.0mg/L，调环酸钙 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，L-脯氨酸 120mg/L， 水解蛋白L0g/L，秋水仙碱0.2mg/L，生物素0.08mg/L，PH 5.9。
[0010] 选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳的花药愈伤组织作为供体，当诱导培养后的花药 愈伤组织长到2毫米大小时，转到分化培养基上诱导绿苗，培养条件控制为：温度26°C、湿 度75%、光照30001x 14h/暗10h。愈伤组织形成后(长到2 mm左右)，计算愈伤组织分化率。
[0011] 绿苗分化率（％) =分化绿苗数/转移的愈伤块数X 100%。
[0012] 实施例2 配制如下配方的培养基（C8H7O2K添加浓度的优选）： KNO3 2950mg/L, (NH4)2SO4 430mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2 110mg/L, MgSO4 85mg/ L，Na2-EDTA 32. 5mg/L，FeSO4. 7H 20 24mg/L，MnSO4. H 20 3. Omg/L，ZnSO4. H 20 I. 3mg/L， H3BO3 I. 4mg/L, KI 0. 65mg/L, CuSO4* 5H20 0. 05mg/L, Na2MoO4* 2H20 0. 16mg/L, CoCl2* 6H 20 0. 16mg/L，丙三醇0.9mg/L，甘氨酸2.0mg/L，叶酸0.4mg/L，甲基亚硝基脲1.2mg/L，丙 氨酸1.2mg/L，赖氨酸1.4mg/L，维生素BI 5.0mg/L，维生素B6 1.0mg/L，3-吡啶甲酸 l.Omg/L，鹿糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L; NAA 0.05mg/L，6-BA 2.0mg/L，调环酸钙 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，L-脯氨酸 120mg/L， 水解蛋白L〇g/L，秋水仙碱0.2mg/L，生物素0.08mg/L，PH 5.9。
[0013] C8H7O2K 的添加浓度设置以下 8 种：900mg/L ; 1100mg/L ; 1300mg/L ; 1500mg/L ; 1700mg/L ；2100mg/L ；2300mg/L ；2500mg/L〇
[0014] 同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计 算绿苗分化率。
[0015] 实施例3 配制如下配方的培养基(丙三醇添加浓度的优选）： KNO3 2950mg/L, C8H7O2K 1900mg/L, (NH4)2SO4 430mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2 IlOmg/ L，MgS04 85mg/L，Na2-EDTA 32. 5mg/L，FeSO4* 7H20 24mg/L，MnSO4* H2O 3. Omg/L，ZnSO4* H2O 1. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0. 65mg/L，CuSO4* 5H20 0. 05mg/L，Na2MoO4* 2H20 0. 16mg/L， C〇C12?6H20 0.16mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，叶酸 0.4mg/L，甲基亚硝基脲 1.2mg/L，丙氨酸 1.2mg/L，赖氨酸 1.4mg/L，维生素 BI 5.0mg/L，维生素 B6 1.0mg/L，3-吡啶甲酸 l.Omg/L， 蔗糖25g/L，植物凝胶5. 5g/L; NAA 0.05mg/L，6-BA 2.0mg/L，调环酸钙 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，L-脯氨酸 120