发酵云芝高产eps的培养基配方及其在卷烟中的应用的制作方法

文档序号:3658042阅读:400来源:国知局
专利名称:发酵云芝高产eps的培养基配方及其在卷烟中的应用的制作方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种液体发酵云芝生产胞外多糖的工艺及胞外多糖的应用。
背景技术
云芝(Coriolus versicolor)又名彩绒革盖菌、杂色云芝、彩绒菌和瓦菌等,隶属非褶菌目,多孔菌科,栓菌属。子实体一般较小,无柄,呈覆瓦状排列。云芝是中药和食品中用途最为广泛的真菌之一,具有健脾利湿、止咳平喘、清热解毒、抗肿瘤等功能。云芝中含有多种生理活性成分,其中最主要的成分之一就是云芝多糖。云芝多糖分子量在10万以上, 是富含β_(1,;3)糖苷键的葡聚糖,同时含有甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。大量的研究资料表明云芝多糖成分是一类具有多种生物活性的多糖物质,具有多种药理和生理功能,功效显著,药用价值高,可做各类药品、保健品、功能性食品的原料。大量研究表明, 云芝多糖具有抗细菌、霉菌及病毒的功能,刺激巨噬细胞转化,增加血液里的白细胞介素I、 Y干扰素及肿瘤坏死因子的作用,能抑制癌细胞生成,是一种新型的抗肿瘤免疫调节剂,能激活免疫细胞,提高机体免疫功能而对正常细胞,没有毒副作用。云芝多糖是国际公认的高效免疫促进剂,是一种口服有效的多糖,临床可用于治疗慢性乙型肝炎、酒精肝,加强消化系统、肺及宫颈、乳腺等部位的癌症放化疗作用,可明显提高患者的细胞免疫功能和体液免疫功能,增强机体对化学治疗的耐受性减少感染与出血,提高患者生命质量。云芝多糖同时具有保肝护肝作用,可显著降低血清转氨酶,对肝组织病变和肝坏死有明显的修复作用。云芝多糖包括三类,一是从云芝的子实体中提取的粗多糖(CVPQ,二是从云芝深层培养菌丝体中分离到一种结合蛋白多糖(PSK)(又称为云芝肽糖),三是从液体发酵云芝的发酵液中提取的云芝胞外多糖(EPS)。从云芝菌丝体和发酵液中提取的多糖均具有极强烈的抑制癌细胞活性,抗氧化活性和免疫调节功能,是良好的免疫增强剂,可提高动物机体 IgM的量等作用;而云芝糖肽的抗肿瘤作用、免疫增强作用和保护肝脏的作用也已普遍用于临床。在临床上,云芝多糖具有安全性高、毒副作用小、适用面广和对机体损害小等优点, 已作为一种免疫疗法用药应用于慢性乙型肝炎,消化系统、呼吸系统疾病及宫颈和乳腺等部位癌症疾病的治疗和辅助治疗。将云芝多糖开发为天然药物免疫促进剂和调节剂应用于其他疾病的防制方面具有更广阔的前景。近年来人们对云芝子实体和发酵菌丝体多糖的提取方法、功能和应用等已进行了大量的研究,但就发酵云芝生产胞外多糖(EPQ和EPS功能及应用方面的研究还很少。随着世界范围内反吸烟运动的不断深入和人类对自身健康的关注,“吸烟与健康” 已经成为医药界和烟草界共同面临的重大难题,是烟草行业所面临的主要挑战及当今社会广泛关注的焦点。近年来,随着履行《烟草控制框架公约》工作的启动,社会对吸烟与健康问题的关注不断加强,减少吸烟对健康的危害已成为烟草行业必须承担的责任和义务。目前国内已在中草药选择、药物作用机理以及临床应用效果上对中国特有的新型卷烟进行了深入的研究,研制开发成功对人体某些疾病具有一定疗效商业卷烟,如“金圣”、“五叶神”、“江山”等。这些卷烟除对缓解人体呼吸系统疾病有一定良性作用外,还可对心血管系统疾病等有一定的预防作用。还有研究表明,含有云芝等类中草药有效成分的卷烟在燃吸时,其有效成分被蒸馏、气化、挥发和升华形成微粒相和气相,可捕获烟气中的自由基,阻断或降低有害物质的生成,减轻吸烟引起的心血管和微循环系统的危害。因此,烟用中草药的研究目前已成为各烟草企业和科研院所研究的热点之一。但目前,还未见发酵产云芝胞外多糖用于卷烟中的相关报道。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种发酵云芝高产EPS的培养基配方。本发明的另一目的在于提供一种液体发酵云芝培养物的方法及从云芝培养发酵液中分离纯化胞外多糖的方法。本发明的再一目的是公开了云芝胞外多糖在卷烟中的应用。为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下本发明的发酵云芝高产EPS的培养基配方为多价胨4_7g/L,麦芽糖50_55g/L,起始PH为5。优选为多价胨5.870g/L,麦芽糖53. 120g/L,起始pH为5。本发明的液体发酵云芝培养物的方法,以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养,培养基配方为多价胨4-7g/L,麦芽糖50-55g/L,起始pH为5,在,150r/ min条件下培养7-9天。优选为以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养,培养基配方为多价胨5. 870g/L,麦芽糖53. 120g/L,起始pH为5,在28°C,150r/min条件下培养8天。所述的种子培养液为菌种cfcc 87458的斜面培养物经一次平板培养和一次液体培养的产物,斜面培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;接种后 28 °C培养4-6天;平板培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;接种后在 28 °C培养6-8天;液体培养基配方为多价胨4_7g/L,麦芽糖50_55g/L,起始pH为5,以4%的接种量接种后在^°C,150r/min条件下培养4_6天。从云芝培养发酵液中分离纯化胞外多糖的方法为发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5,然后加入4倍体积的无水乙醇,4°C 过夜;lOOOOr/min离心lOmin,得沉淀为粗多糖;将粗多糖样品用蒸馏水溶解,加入1/4体积的氯仿-正丁醇溶液,氯仿与正丁醇的体积比为4 1,置于具塞容器中,充分振摇30min后,经离心机lOOOr/min离心5min,然后将水相与氯仿相分开;将水相再加入相当于其体积1/4的氯仿-正丁醇溶液,重复上述过程,共计重复二次;纯化出的胞外多糖成分用旋转蒸发仪浓缩,透析除去NaCl,得精制云芝胞外多糖,真空冷冻干燥保存。云芝胞外多糖在卷烟中的应用,将精制的云芝胞外多糖的喷入烟丝或注入烟卷中,胞外多糖含量为烟丝质量的0. 01% -0. 04%,然后放入恒温恒湿箱在温度22°C,湿度60%下平衡48h。本发明中所用的菌种cfcc 87458购于北京北纳创联生物技术研究院,保藏于中国林业微生物保藏管理中心。本发明公开了一种发酵云芝高产EPS的培养基配方及液体发酵云芝培养物的方法,采用该发明的培养基配方及培养方法,多糖得率为10. 0982g/L。并对EPS生理活性进行初探,为大规模发酵生产云芝EPS及其在医药食品行业中的进一步应用做好了准备。本发明就是找到了一种云芝胞外多糖在卷烟中的应用方法,为云芝等真菌的胞外多糖在卷烟中的应用提供了一种可行方案,具有广阔发展空间,将产生深远的经济和社会效应。利用中草药搭建起具有传统吸烟文化内涵和中式吸味特征的低危害卷烟的技术壁垒,提高中国卷烟产品的市场竞争力,可应对WHO和WTO带来的压力和挑战。将云芝等优质温补中草药发酵提取胞外多糖添加到卷烟中,形成的独特的香气风格、口味特征以及加工方式均符合国家局提出的中式卷烟发展方向,对卷烟烟气能起到减害增益的作用,符合国家烟草科技发展方向,有利于提高我国烟草工业产品的技术含量和竞争力,使卷烟消费者在享受吸烟乐趣的同时尽可能的降低吸烟的危害性。


图1精制云芝胞外多糖过kpharose CL-6B层析柱结果。图2过柱得云芝胞外多糖组分的红外光谱图。图3精制云芝胞外多糖在卷烟烟气中的转移率。
具体实施例方式实施例1(1)斜面菌种培养配制固体培养基,分装试管,斜面培养基配方为250g/L 土豆, 麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;灭菌后制备斜面,划线接种云芝后,于培养5天, 冷冻保藏即为云芝菌株菌种。(2)从保存菌株的试管中,使用接种钩在试管斜面取出0. 5平方厘米的一小块,接种到P天A固体平板中。平板培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2% 琼脂;接种时要使接种块上包含尽量少的培养基,一个平板接两块,放入恒温培养箱,接种后在培养7天。(3)使用直径0. 5cm的打孔器,从固体平板培养基上取下两片位于菌落边缘的菌体,接种于液体种子培养基中O50ml三角瓶,50毫升培养液),液体培养基配方为多价胨 5. 870g/L,麦芽糖53. 120g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养5天。(4)以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养,培养基配方为多价胨5. 870g/L,麦芽糖53. 120g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养8天。云芝发酵结束后,将50mL的发酵物通过真空抽滤法分离菌丝与发酵液,发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5,然后加入4倍体积的无水乙醇,4°C过夜。lOOOOr/min 离心lOmin,得沉淀为粗多糖;称取0. Ig粗多糖,溶于IOmL蒸馏水,用苯酚硫酸法可测定计算发酵液中多糖含量为10. 10g/L。实施例2
(1)斜面菌种培养配制固体培养基,分装试管,斜面培养基配方为250g/L 土豆, 麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;灭菌后制备斜面,划线接种云芝后,于培养4天, 冷冻保藏即为云芝菌株菌种。(2)从保存菌株的试管中,使用接种钩在试管斜面取出0. 5平方厘米的一小块,接种到P天A固体平板中。平板培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2% 琼脂;接种后在培养6-8天;接种时要使接种块上包含尽量少的培养基,一个平板接两块,放入恒温培养箱,28°C培养8天。(3)使用直径0. 5cm的打孔器,从固体平板培养基上取下两片位于菌落边缘的菌体,接种于液体种子培养基中O50ml三角瓶,50毫升培养液),液体培养基配方为多价胨 4g/L,麦芽糖55g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养6天。(4)以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养,培养基配方为多价胨4g/L,麦芽糖55g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养7天。云芝发酵结束后,将50mL的发酵物通过真空抽滤法分离菌丝与发酵液,发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5,然后加入4倍体积的无水乙醇,4°C过夜。lOOOOr/min 离心lOmin,得沉淀为粗多糖;称取0. Ig粗多糖,溶于IOmL蒸馏水,用苯酚硫酸法可测定计算发酵液中多糖含量为10. 12g/L。实施例3(1)斜面菌种培养配制固体培养基,分装试管,斜面培养基配方为250g/L 土豆, 麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;灭菌后制备斜面,划线接种云芝后,于培养6天, 冷冻保藏即为云芝菌株菌种。(2)从保存菌株的试管中,使用接种钩在试管斜面取出0. 5平方厘米的一小块,接种到P天A固体平板中。平板培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2% 琼脂;接种后在培养6天;接种时要使接种块上包含尽量少的培养基,一个平板接两块,放入恒温培养箱,培养6天。(3)使用直径0. 5cm的打孔器,从固体平板培养基上取下两片位于菌落边缘的菌体,接种于液体种子培养基中O50ml三角瓶,50毫升培养液),液体培养基配方为多价胨 7g/L,麦芽糖50g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养4天。(4)以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养,培养基配方为多价胨7g/L,麦芽糖50g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养9天。云芝发酵结束后,将50mL的发酵物通过真空抽滤法分离菌丝与发酵液,发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5,然后加入4倍体积的无水乙醇,4°C过夜。lOOOOr/min 离心lOmin,得沉淀为粗多糖;称取0. Ig粗多糖,溶于IOmL蒸馏水,用苯酚硫酸法可测定计算发酵液中多糖含量为10. 09g/L。实施例4(1)斜面菌种培养配制固体培养基,分装试管,斜面培养基配方为250g/L 土豆, 麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;灭菌后制备斜面,划线接种云芝后,于培养6天, 冷冻保藏即为云芝菌株菌种。(2)从保存菌株的试管中,使用接种钩在试管斜面取出0. 5平方厘米的一小块,接种到P天A固体平板中。平板培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;接种后在培养6天;接种时要使接种块上包含尽量少的培养基,一个平板接两块,放入恒温培养箱,培养6天。(3)使用直径0. 5cm的打孔器,从固体平板培养基上取下两片位于菌落边缘的菌体,接种于液体种子培养基中O50ml三角瓶,50毫升培养液),液体培养基配方为多价胨 6g/L,麦芽糖53g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养4天。(4)以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养,培养基配方为多价胨5g/L,麦芽糖52g/L,起始pH为5,在,150r/min条件下培养9天。云芝发酵结束后,将50mL的发酵物通过真空抽滤法分离菌丝与发酵液,发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5,然后加入4倍体积的无水乙醇,4°C过夜。lOOOOr/min 离心lOmin,得沉淀为粗多糖;称取0. Ig粗多糖,溶于IOmL蒸馏水,用苯酚硫酸法可测定计算发酵液中多糖含量为10. 09g/L。称取Ig的的粗多糖样品,室温下加入50mL蒸馏水溶解,加入1/4体积的氯仿-正丁醇(预先配制成体积比为4 1混合液)溶液,置于具塞容器中,充分振摇30min后,经离心机lOOOr/min离心5min,然后将水相与氯仿相分开。将水相再加入相当于其体积1/4的氯仿-正丁醇溶液,重复上述过程,共计重复二次。用硫酸-苯酚法对胞外多糖进行检测。 纯化出的胞外多糖成分用旋转蒸发仪浓缩至10mL,透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl,得精制云芝胞外多糖,真空冷冻干燥保存。以实施例5得到的精致云芝胞外多糖为分析样品,进行下述分析研究。1、发酵产云芝胞外多糖组分分析称取80mg云芝精制胞外多糖溶于4mL 0. 2mol/L的NaCl缓冲液溶解,离心,上清液过0. 45 μ m的滤膜;取2mL上Sepharose CL-6B凝胶柱,以0. 2mol/L NaCl缓冲液洗脱, 流速为0. 6mL/min,利用分步收集器收集,5mL/管;用硫酸-苯酚法对胞外多糖进行检测。 分离出的胞外多糖组分用旋转蒸发仪浓缩至10mL,透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl,真空冷冻干燥保存。将精制云芝胞外多糖样品过kpharose CL-6B柱,用硫酸-苯酚法测定多糖含量, 以管号为横坐标以多糖吸光度为纵坐标用SigmaPlot软件作图,结果如下图1所示。从结果图1可以看出,精制云芝胞外多糖经过kpharose CL-6B柱分离出了一种主要多糖组分。 重复过柱5次,每次都对过柱后的溶液进行检测,检测结果相同,将5次所得到的组分收集起来进行浓缩、透析、冷冻干燥得到一个多糖组分。2、云芝胞外多糖组分红外光谱分析称取过柱得云芝胞外多糖组分lmg,用溴化钾(KBr)压片后进行红外光谱(IR)分析,结果见图2。从图谱中特征吸收波峰分析可知,在3421. 4cm-l有一特征宽峰,属O-H的伸缩振动,表明在该糖中应存在O-H ;在2926. Icm-I处有吸收峰,应为C-H伸缩振动,是糖类的特征吸收峰,在2361cm-l、2335. 8cm-l处有吸收峰,应为C = N或C = C伸缩振动,发生费米共振;在1645. 7cm-l、1071. 9cm-l处有吸收峰,说明该组分中有羧酸存在,推知该胞外多糖组分为酸性多糖。3、云芝EPS抗氧化性能的测定用邻二氮菲法测定云芝EPS对· OH自由基的清除率,结果见表1。表1多糖对· OH自由基的清除效率
权利要求
1.一种发酵云芝高产EPS的发酵培养基配方,其特征在于培养基配方为多价胨4_7g/ L,麦芽糖50-55g/L,起始pH为5。
2.根据权利要求1所述的发酵云芝高产EPS的发酵培养基配方,其特征在于培养基配方为多价胨5. 870g/L,麦芽糖53. 120g/L,起始pH为5。
3.一种液体发酵云芝培养物的方法,其特征在于以4 %的接种量将种子培养液接种于优化培养基中培养,培养基配方为多价胨4-7g/L,麦芽糖50-55g/L,起始pH为5,在 28 0C,150r/min条件下培养7_9天。
4.根据权利要求2所述的液体发酵云芝培养物的方法,其特征在于以4%的接种量将种子培养液接种于优化培养基中培养,培养基配方为多价胨5. 870g/L,麦芽糖53. 120g/L, 起始pH为5,在,150r/min条件下培养8天。
5.根据权利要求3或4所述的液体发酵云芝培养物的方法,其特征在于所述的种子培养液为菌种Cfcc 87458的斜面培养物经一次平板培养和一次液体培养的产物,斜面培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;接种后培养4-6天;平板培养基配方为250g/L 土豆,麦芽糖10g/L,蛋白胨4g/L,2%琼脂;接种后在培养6-8天;液体培养基配方为多价胨4-7g/L,麦芽糖50-55g/L,起始pH为5,以4%的接种量接种后在,150r/min条件下培养4_6天。
6.一种从云芝培养发酵液中分离纯化胞外多糖的方法,其特征在于发酵液通过旋蒸仪浓缩至原体积的1/4-1/5,然后加入4倍体积的无水乙醇,4°C过夜; 10000r/min离心lOmin,得沉淀为粗多糖;将粗多糖样品用蒸馏水溶解,加入1/4体积的氯仿-正丁醇溶液,氯仿与正丁醇的体积比为4 1,置于具塞容器中,充分振摇30min后,经离心机lOOOr/min离心5min,然后将水相与氯仿相分开;将水相再加入相当于其体积1/4的氯仿-正丁醇溶液,重复上述过程,共计重复二次;纯化出的胞外多糖成分用旋转蒸发仪浓缩,透析除去NaCl,得精制云芝胞外多糖,真空冷冻干燥保存。
7.云芝胞外多糖在卷烟中的应用,其特征在于将精制的云芝胞外多糖的喷入烟丝或注入烟卷中,胞外多糖含量为烟丝质量的0. 01 % -0. 04%,然后放入恒温恒湿箱在温度 22°C,湿度60%下平衡48h。
全文摘要
本发明公开了一种发酵云芝高产胞外多糖(EPS)的培养基配方及液体发酵云芝培养物的方法,发酵培养方法为以4%的接种量将种子培养液接种于基础培养基中培养,培养基配方为多价胨4-7g/L,麦芽糖50-55g/L,起始pH为5,在28℃,150r/min条件下培养7-9天。采用该发明的培养基配方及培养方法,多糖得率为10.0982g/L。并对EPS在卷烟中的应用进行了探索,为大规模发酵生产云芝EPS及其在医药食品行业中的进一步应用做好了准备。
文档编号C08B37/00GK102399840SQ20111036229
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者毛多斌, 王吉中, 耿卢婧, 许春平 申请人:郑州轻工业学院
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