专利名称：一种生产抗癌药物工程菌的发酵方法
技术领域：
本发明是一种生产抗癌药物工程菌即DH5a-pBVnm23-H1的发酵方法，它属于基因工程药物制备领域。
背景技术：
本发明所指工程菌即DH5a-pBVnm23-H1是一种抗癌转移基因工程药物Nm23-H1的中试发酵方法研究。从Dialog国际联机检索数据库的检索结果来看，虽然有许多研究表明nm23基因的表达水平和恶性肿瘤的转移有关，但其中未发现涉及nm23-H1工程菌的中试发酵的研究及其文献报道。
本发明工程菌的发酵方法包括如下步骤发酵培养基配方和发酵工艺。培养基的筛选是在首先了解单个因素对工程菌的生长及目标蛋白表达的影响后，再通过正交实验综合考虑各因素之间的交互作用，经统计学分析后确定发酵配方，同时进行发酵工艺检验和优选，至选定发酵工艺条件。
发明内容
本发明的目的是探索一种工程菌的发酵方法，筛选出能满足设计要求的发酵培养基配方和发酵工艺条件，进而达到高菌体得率与高目标蛋白表达。
本发明的目的可以通过如下措施来达到一种生产抗癌药物工程菌即DH5a-pBVnm23-H1的发酵方法，它包括如下步骤发酵培养基配方筛选和发酵工艺条件的选定。按配制10L发酵液，发酵培养基配方(重量百分比)如下酵母提取物(Yeast extract) 0.30～3.0蛋白胨(Typtone) 0.30～3.0氯化钠(NaCl)0.50～1.5葡萄糖(Glucose) 0.30～5.0微量元素适量发酵工艺条件为(1)菌种的加入量菌种的接种量为培养基溶液的5～15％，菌种的光密度(OD值)为1～3。
(2)工程菌生长和诱导表达的时间及温度工程菌发酵过程中，长菌温度为28～35℃，时间2～5小时，诱导表达的温度为39～45℃，时间3～7小时。
(3)加糖时刻及方式选择加糖方式采取慢速加糖方式，加糖量为100～350g，且在0.5～3小时加完。
(4)发酵液酸碱度调节采用酸碱自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.5～7.5之间。
(5)溶氧水平通过通气量与转速自动调节溶氧，维持在40％以上水平。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到调节发酵液pH值采用氢氧化钠(NaOH)和盐酸(HCL)自动平衡调节。
本发明具有如下特点(1)菌体得率高，达10～60菌体湿重/L发酵液。
(2)目标蛋白表达量高(包括相对含量和绝对含量)，其含量可达15～45％。
(3)发酵时间短。
(4)发酵成本低。
具体实施例方式本发明下面将结合实施例作进一步详述。
例一A发酵培养基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.0％蛋白胨(Typtone)2.0％氯化钠(NaCl) 1.0％葡萄糖(Glucose)2.0％微量元素 适量B发酵工艺按上述配方配制10L发酵液(用去离子水)于发酵罐中，经灭菌后接种菌种，菌种的接种量为培养基溶液的10％，光密度(OD值)为2.5。同时设定溶氧水平为50％，用氢氧化钠和盐酸调节pH值为7.0，开始进行培养。在开始培养2小时后把葡萄糖100g(首先配成50％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，用时2.5小时。发酵过程中长菌温度为30℃，时间3小时，诱导温度40℃，时间7小时。
发酵完毕经分离，菌体得率为30g菌体湿得/L发酵液，目标蛋白含量达35％。
例二A发酵培养基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.2％蛋白胨(Typtone)2.0％氯化钠(NaCl) 0.9％葡萄糖(Glucose)1.7％微量元素 适量B发酵工艺按上述配方配制10L发酵液(用去离子水)于发酵罐中，经灭菌后接种菌种，菌种的接种量为培养基溶液的10％，光密度(OD值)为2.3。同时设定溶氧水平为45％，用氢氧化钠和盐酸调节pH值为7.0，开始进行培养。培养3小时后开始把葡萄糖150g慢速加入发酵罐，用时3小时，发酵过程中长菌温度为31℃，时间3.5小时，诱导温度42℃，时间6.5小时。
发酵完毕经分离，菌体得率为33g菌体湿重/L发酵液，目标蛋白含量达33％。
例三A发酵培养基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.0％蛋白胨(Typtone)2.2％氯化钠(NaCl) 1.0％葡萄糖(Glucose)1.5％微量元素 适量B发酵工艺按上述配方配制10L发酵液(用去离子水)于发酵罐中，经灭菌后接种菌种，菌种的接种量为培养基溶液的8％，光密度(OD值)为3。同时设定溶氧水平为55％，用氢氧化钠和盐酸调节pH值至7.2，开始进行培养。培养1小时后把葡萄糖180g慢速加入发酵罐，用时3小时。发酵过程中长菌温度为34℃，时间4小时，诱导温度43.5℃，时间5.5小时。
发酵完毕经分离，菌体得率为38g菌体湿重/L发酵液，目标蛋白含量达32.5％。
权利要求
1.一种生产抗癌药物工程菌的发酵方法，其特征是A.按配制10L发酵液，发酵培养基配方重量百分比如下酵母提取物(Yeast extract)0.30～3.0蛋白胨(Typtone) 0.30～3.0氯化钠(NaCl) 0.50～1.5葡萄糖(Glucose) 0.30～5.0微量元素 适量B.发酵工艺(1)菌种的加入量菌种的接种量为培养基溶液的5～15％，菌种的光密度为1～3；(2)工程菌生长和诱导表达的时间及温度工程菌发酵过程中，长菌温度为28～35℃，时间2～5小时，诱导表达的温度为39～45℃，时间3～7小时；(3)加糖时刻及方式选择加糖方式采取慢速加糖方式，加糖量为100～350g，且在0.5～3小时加完；(4)发酵液酸碱度调节采用酸碱自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.5～7.5之间；(5)溶氧水平通过通气量与转速自动调节溶氧，维持在40％以上水平。
2.根据权利要求1所述之方法，其特征是调节发酵液pH值采用氢氧化钠和盐酸自动平衡调节。
全文摘要
本发明是一种生产抗癌药物工程菌即DH5a－pBVnm23－H1的发酵方法研究。该法包括如下步骤发酵培养基配方筛选和发酵工艺条件选定。配方包括酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等组成，发酵工艺包括菌种的加入量及其最佳生长时期，工程菌生长和诱导表达的时间及温度、加糖时刻及方式选择，发酵液酸碱度的调节等。用本发明培养基配方及所建立的发酵工艺进行DH5a－pBVnm23－H1的发酵，具有菌体得率高、目标蛋白表达量高、时间短、成本低等特点。
文档编号A61P35/00GK1412297SQ01129780
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月18日 优先权日2001年10月18日
发明者王一飞, 张美英, 钱垂文, 李久香 申请人:暨南大学