专利名称：基因重组干扰素人体内定殖菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因重组干扰素人体内定殖菌株及其用途。属于基因工程生物技术领域。
二.
背景技术：
大肠菌自1885年Escherich氏从健康婴儿粪便中发现后的60年间大肠菌一直作为正常肠道菌丛的组成部分，认为是非致病菌。这类菌种自婴儿出生开始饮奶后即进入人体内寄殖在肠道中与人类互惠共存以至伴随终生。
干扰素是一种抗病毒，抗恶性肿瘤，提高免疫的生物制品，已普遍应用于临床，并取得可喜疗效。对干扰素的研究迄今已有40多年历史，在世界多个国家和在我国已作为正式药品于临床广泛使用，干扰素在生物基因工程研究方面取得的巨大进展，大大促进了干扰素生产工艺的改革，用基因工程生物技术大量生产干扰素，满足市场需要，是干扰素近40多年研究工作的一项突破，自1979年日本的Taniguchi等报导干扰素重组成功，几年后许多国家包括英国、美国、苏联、德国、加拿大等相继报导各种重组干扰素，如重组α干扰素，重组β干扰素和重组γ的基因工程均获得成功，候云德教授于1982年在国内率先重组干扰素αD获得成功。80年代初干扰素α和β表达水平均很低，经多年研究一系列改进，如改用PL启动子，Trp启动子及其他高效表达系统，同时采用不同的重组结合位点等，现在表达水平一般可达108-109IU/L。由于核苷酸合成仪的进步，用化学方法合成干扰素基因工作进展很快，目前已用化学方法合成干扰素α1、α2、β和γ等基因，而且表达都在107-109/L，以上，基因重组或化学合成的各类干扰素均在于提供干扰素产业化生产方面和作为药物供临床使用为目的。
基因重组干扰素生物技术发展至今技术已相当成熟，干扰素重组技术或化学合成以及基因杂交技术已进入一个高速发展阶段，对干扰素的产业化也在不断发展与提高，尽管目前已有大批工程菌生产干扰素投入市场，但在生产过程中仍然受各种条件影响，如对发酵系统的控制简化纯化过程，从技术上进一步提高产量和质量，以及降低成本，促使价格趋于合理，减轻患者经济负担方面仍有待不断改善。
三.技术内容本发明的目的即本发明需要解决的问题，是利用基因重组干扰素人体内常住菌，提供一种基因重组干扰素人体内定殖菌株及其用途。该菌株直接定殖人类体内，使宿主体内干扰素水平长期处于最佳状态，因而受体可获得对病毒和某些恶性肿瘤长期或终身免疫成为可能。
为了解决本发明提出的技术问题，可以采取如下技术解决方案基因重组干扰素人体内定殖菌株，其特点是利用生物基因工程，采用基因重组干扰素人体常住菌株，通过殖入所述干扰素工程菌株在人体内繁殖代谢不断释放干扰素；构成一种含有特殊药物功效遗传信息的基因重组干扰素微生态制品。
所述干扰素人体常住菌指基因重组干扰素大肠菌、基因重组干扰素双肢干菌株、基因重组干扰素乳酸菌株、基因重组干扰素厌氧菌株或基因重组干扰素粪链球菌。
所述基因重组干扰素指α干扰素，β干扰素、γ干扰素和包括用因基重组技术的重组人α-1干扰素、α-2干扰素以及其他亚型重组干扰素大肠菌株。
基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特点是通过培养、发酵达到相当浓度和生物活性再与基质组合成保健食品。
基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特点是利用基因工程生物技术，制成具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的保健食品。
基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特点是制成重组干扰素大肠菌口服液、重组干扰素大肠菌胶囊(肠溶胶囊)、重组干扰素大肠菌片、重组干扰素大肠菌粉、重组干扰素大肠菌膏、重组干扰素大肠菌散、重组干扰素大肠菌布丁、重组干扰素大肠菌冷品等保健食品。
基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特点是可用作重组治疗糖尿病药物、重组治疗免疫性疾病药物和重组异体组织移殖免疫抑制剂等，以构建重组药物肠道定殖工程菌和重组药物阴道定殖工程菌以及重组药物呼吸道定殖工程菌等，重组胰岛素肠道定殖工程菌和重组白细胞介素肠道定殖工程菌。
基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特点是准备两株已证明临床效果显著的基因重组人α-1和α-2两株干扰素大肠菌株，用获得的干扰素高效表达菌株，经在特殊培养基的传代和液体发酵，再用无菌脱脂奶粉充分吸附，通过冻干(含水分少于3％)装入肠溶胶囊，然后真空处理或用其他方法使上述菌株培养物组合成所述保健食品。
本发明是推广一种“微生态体内定殖给药法”，本方法亦可用于其它长期治疗的特殊药物，如用治疗糖尿病药物，治疗免疫性疾病药物和异体移殖免疫抑制剂药物等构建的肠道重组药物定殖工程菌和阴道重组药物定殖工程菌以及呼吸道药物重组定殖工程菌。
本发明以保健食品形式生产供保健市场需要，这些干扰素工程菌能直接定殖在人体的肠道中，当工程菌进入肠道后，能与人类和平共处，长期共存数十年以至伴随终生，在宿主内繁殖、代谢、不断释放α-1和α-2干扰素，使宿主对多种病毒和某些恶性肿瘤获长期或终生免疫，让一些干扰素适应症患者如病毒性肝炎患者和爱滋病患者等受益。
基因重组干扰素肠道定殖菌株的一种制备方法是准备两株已证明临床效果显著.的基因重组人α-1和α-2两株干扰素大肠菌株，用获得的干扰素高效表达菌株，经在特殊培养基的传代和液体发酵，再用无菌脱脂奶粉充分吸附，通过冻干(含水分少于3％)装入肠溶胶囊，然后真空处理或用其他方法使上述菌株培养物组合成所述保健食品。
基因重组干扰素肠道定殖菌株保健食品还可采用如下制备方法采用基因重组α-1和α-2干扰素两株工程菌，分别接种在改良LB液体培养基中，置摇床36℃培养16小时，转种三角烧瓶继续培养18小时，然后按1∶20比例转入发酵罐通气搅拌培养16小时，菌体浓度达到OD0.6，α-1和α-2工程菌等量合并(比活约6×109/L)，在4℃无菌条件下，用脱脂奶粉和右旋糖酐彻底吸附至半干状态，送入-20℃冰箱过夜，次日转送入冻干机分层格板上，启动制冷系统，对上述物料预冻，低温至-40℃，2小时，然后启动真空系统进行真空干燥，使冻干箱内的压强控制在毫米汞柱700范围内，调节加温器，使物料温度控制在30℃，不断升华，蒸发水份成粉状，调节加热器，使冻干箱内的温度由原来的温度至20-25℃，当物料的温度升至冻干箱温度一致并维持2小时以上，则冻干结束。取出物料，在无菌条件下分装小瓶内或分装肠溶胶囊，每小瓶或每粒胶囊为重组α-1和α-2干扰素10×108个工程菌，经纯菌试验合格供作保健应用。
所述改良LB液体培养基如表1所述化学成份构成表1发醇罐LB改良培养基
采用本发明具有如下突出效果1.本发明是用基因重组干扰素人体常住菌，如α-1和人α-2两株干优素工程菌进行组合(方法从略)使工程菌株表达水平大大提高，一般分泌体外都可达到来4×106/ml以上，其抗病毒活性和抗增殖活性比单一工程菌株更具优越性，稳定性好。已连续追踪鉴测十年，生物学特性和干扰素活性不受影响。用基因重组干扰素α、β、γ(包括)α1、α2b、α2A干扰素方法，已有大量文献报导，在世界范围内进行研究开发作为生物药品和用重组干扰素大肠菌株产业化大量生产干扰素，但用干扰素重组工程菌株作微生态定殖给药法尚未见有报导或未见有关专利。
2.本发明是采用基因重组干扰素人体常住菌株，如α-1和α-2干扰素大肠菌株，通过脱脂奶粉和右旋糖酐吸附和冻干成粉，分装在一种肠溶胶囊中，服用时直接吞下至肠道中分解，不受胃蛋白酶影响，有利于工程菌肠道定殖和稳定发育长期活存。干扰素工程菌进入肠道继续繁殖，代谢并释放干扰素，从而使宿获得对病毒和某些恶性肿瘤自动免疫。
3.本发明的目的在于更充份发挥干扰素的药效学长处，应用干扰素工程菌株对肠道殖入法，使菌株不断在体内繁殖代谢释放干扰素，利用肠道寄生菌株微生态平衡特点，使受体达到长期或终身干扰素高水平的保护效应，取得长久或终生对病毒和某些种恶性肿瘤非特异性自动免疫效果。本发明是目前对干扰素临床应用给药方法中，包括注射干扰素，口服干扰素，栓塞干扰素，外涂干扰素和气雾干扰素等均是无法可比的。
四.优选实施例实施例一分别取重组α-1和α-2干扰素大肠菌冻干菌种，启开菌种管加入BL培养基0.5ml，溶解后吸取0.2加入20ml BL肉汤管内，放置摇床30℃培养18小时BL肉汤培养基(内含胰蛋白胨，牛肉浸膏、酵母浸膏、萄葡糖和氯化钠)置36℃±1℃摇床培养16小时，再转种于三角烧瓶继续在摇床培养(工程菌种量与培养基比例为1∶20)18小时，然后转入发酵罐通气搅拌培养16小时，工程菌株浓度达到OD0.6，将菌液用上述肉汤培养基稀释至麦氏相当浓度0.5，重组α-1和α-2等量合并，然后迅速用无菌脱脂奶粉充分吸附(内含右旋糖酐)。于磁盆并送到-20℃冰箱速冻过夜，送入冻干箱的分层格板上，启动制冷系统对上述物料预冻，低温至-40℃，2小时，然后启动真空系统进行真空干燥，使冻干箱内的压强控制在毫米汞柱700范围内，调节加温器使物料温度控制在30℃，不断升华，蒸发水份变成粉状物体。调节加热器使冻干箱内的温度由原来的温度转至20-25℃，当物料温度升至冻干箱温度一致并维持2小时以上，则冻干结束。抽样测定冻干产品的活性，含水百分数及根据食品卫生国际标准项目检定，合格后在GmP无菌(室)车间分装入胶囊，每粒胶囊含基因重组干扰素大肠菌株20亿个/粒加外包装，抽样送成品检测。
实施例2分别取本发明的工程菌重组α-1和α-2大肠菌株，接种于液体改良LB培养基，在37℃摇床中培养16-18小时，然后用第三代菌株转入发酵罐用35℃低营养物培养16小时，将重组α-1和α-2大肠菌株等量合并，完成后取出置-20℃急冻一夜，在无菌条件下用灭菌的脱脂奶粉彻底吸附，再送入冻干机中冻干成粉(含水份应少于3％)取出定量分装在特制的玻璃小瓶中；使每瓶含20×108个/瓶工程菌。经真空处理，加上外包装，即为基因重组干扰素大肠菌株保健食品。(冻干祥细方法与实施例1同)以上产品贮存方法4-6℃贮存有效期5年，-20贮存有效10年。
贮存和有效期1.常温保存有效期2年2.4-8℃冷箱保存有效期5年3.-20℃保存真空保存，有效期10年4.-30℃真空保存 有效期20年
权利要求
1.基因重组干扰素人体内定殖菌株，其特征是利用生物基因工程，采用基因重组干扰素人体常住菌株，通过殖入所述干扰素工程菌株在人体内繁殖代谢不断释放干扰素；构成一种含有特殊药物功效遗传信息的基因重组干扰素微生态制品。
2.根据权利要求1所述的基因重组干扰素人体内定殖菌株，其特征是所述干扰素人体常住菌指基因重组干扰素大肠菌、基因重组干扰素双肢干菌株、基因重组干扰素乳酸菌株、基因重组干扰素厌氧菌株或基因重组干扰素粪链球菌。
3.根据权利要求1所述的基因重组干扰素人体内定殖菌株，其特征是所述基因重组干扰素指α干扰素，β干扰素、γ干扰素和包括用因基重组技术的重组人α-1干扰素、α-2干扰素以及其他亚型重组干扰素大肠菌株。
4.根据权利要求1所述的基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特征是通过培养、发酵达到相当浓度和生物活性再与基质组合成保健食品。
5.根据权利要求1所述的基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特征是利用基因工程生物技术，制成具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的保健食品。
6.根据权利要求1所述的基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特征是制成重组干扰素大肠菌口服液、重组干扰素大肠菌胶囊(肠溶胶囊)、重组干扰素大肠菌片、重组干扰素大肠菌粉、重组干扰素大肠菌膏、重组干扰素大肠菌散、重组干扰素大肠菌布丁、重组干扰素大肠菌冷品等保健食品。
7.根据权利要求1所述的基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特征是可用作重组治疗糖尿病药物、重组治疗免疫性疾病药物和重组异体组织移殖免疫抑制剂，构建重组药物肠道定殖工程菌和重组药物阴道定殖工程菌以及重组药物呼吸道定殖工程菌，以及重组胰岛素肠道定殖工程菌和重组白细胞介素肠道定殖工程菌。
8.根据权利要求1所述的基因重组干扰素人体内定殖菌株的用途，其特征是准备两株已证明临床效果显著的基因重组人α-1和α-2两株干扰素大肠菌株，用获得的干扰素高效表达菌株，经在特殊培养基的传代和液体发酵，再用无菌脱脂奶粉充分吸附，通过冻干(含水分少于3％)装入肠溶胶囊，然后真空处理或用其他方法使上述菌株培养物组合成所述保健食品。
全文摘要
本发明涉及基因重组干扰素人体内定殖菌株及其用途，其特点是利用基因工程生物技术，采用基因重组干扰素人体常住菌株，通过殖入所述干扰素工程菌株在人体内繁殖代谢不断释放干扰素；构成一种含有特殊药物功效遗传信息的基因重组干扰素微生态制品。本发明以保健食品形式使干扰素工程菌能直接定殖在人体内，伴随人类终生，在宿主内繁殖、代谢并不断释放干扰素，使宿主对多种病毒和某些恶性肿瘤获长期或终生免疫。
文档编号A61K35/74GK1403569SQ0112971
公开日2003年3月19日 申请日期2001年9月29日 优先权日2001年9月29日
发明者余国华 申请人:余国华