一种重组鸡α干扰素基因及其重组载体的制作方法

专利名称：：一种重组鸡α干扰素基因及其重组载体的制作方法
技术领域：
：本发明一种重组鸡a干扰素的基因序列及其重组载体，属于基因工程生物制品领域的产品。与天然的鸡a干扰素相比，有更强的抗病毒活性，可针对性的用于鸡的各种病毒性疾病的防制和早期治疗。二
背景技术：
：鸡a干扰素(Interferonalpha,IFN-a)是一类具有抗病毒、抗肿瘤、抗增殖作用等功能(OritaniK,MedinaKL,TomiyamaYa/.Limitin:aninterferonlikecytokinethatpreferentiallyinfluencesB21ymphocyteprecursors)的'糖蛋白。1994年，Sekellick等首先克隆得到鸡胚成纤维细胞IFN-a基因，并进行了结构分析。1996年Sick，Scultz等对鸡a干扰素基因进行了克隆与表达，并对表达产物进行了抗病毒活性的研究。研究表明鸡a干扰素是无内含子的多拷贝基因，编码162个氨基酸的成熟蛋白，有4个糖基化位点，推测其大小为19KD(PeiJ，SekellickMJ,MarcusPI"a/.ChickeninterferontypeIinhibitsinfectionsbronchitisvirusreplicationandassociatedrespiratoryillness[J])。现已证明重组鸡a干扰素对新城疫病毒(NDV)(MarcusPI，HeideLVD，SekellickMJ.InterferonActiononAvianViruses.I.OralAdministrationofChickenInterferondamelioratesNewcastleDisease[J])、禽流感病毒(AIV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)等(李凤华，林云圣，崔丽,等.家禽基因工程干扰素生物学作用及其在禽病防治中的应用[J])都有抵抗作用。近年来干扰素的研究取得了一些进展，已有商品化的猪、犬、鸡等重组IFN产品面市，但目前干扰素的研究仍停留在基础研究和临床试验阶段，在兽医临床的应用上还主要局限于宠物疾病的治疗。新型重组干扰素即为一种复合干扰素(Consensusinterferon,IFN-Con),是一种重组的、非天然的I型干扰素。80年代初，美国安进公司将已知的13种a干扰素序列进行比较,把出现频率最高的氨基酸分配到各自相应的位置，并对个别位置做了修改，得到复合干扰素的氨基酸序列，并在大肠杆菌中成功表达(BlattLM,DavisJM,KleinSB，a/.Thebiologicactivityandmolecularcharacterizationofanovelsyntheticinterferon-alphaspecies,consensusinterferon[J])。体夕卜实验表明,IFN-Con-1的抗病毒活性、抗增殖活性及诱导NK细胞的活性均高于IFNa-2a和IFNa-2b，可能与其与更多的细胞表面受，结合,且具有更强的亲和力有关。1997年,FDA批准IFN-Con-1用于慢性丙型肝炎的治疗，商品名为干i津。鸡的病毒性疾病尤其是烈性传染性病毒性疾病,如禽流感、新城疫、马立克氏病等的地区性流行给养鸡业带来数亿计的损失。因此，急需从多个角度对干扰素的结构进行改造，以赋于其新的功能以及大量生产高质量的干扰素制剂研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增强剂用于增强鸡体的抵抗力和提高现有疫苗的保护率。为了进一步研究干扰素作用和扩大干扰素在生物领域的发展应用，我们进行了鸡新型复合干扰素的研究工作设计该干扰素时选择野生型及抗病力较强的品种的a干扰素亚型为模板；将收集的干扰素氨基酸序列用DANMAN或者LasegeneDNAstar等软件进行比对分析，以择量录取原则，选择出现频率最高的氨基酸，拼接出一个人造干扰素氨基酸序列模板。LasergeneDNAstar分析新干扰素氨基酸结构，与其他表达或不表达蛋白质结构进行比较结构越简单越有利于表达；确定好氨基酸序列后，按照偏嗜密码子的偏嗜性改造新型干扰素基因序列，在偏嗜性差别不大或密码子出现频率不很极端的情况下，选择GC含量高的偏嗜密码子，使酵母表达的基因GC含量控制在45y。左右，接近酵母本身基因组的GC含量。确定好新基因序列后根据其长度设计引物，用PrimerPremier5.0软件共设计了十六条引物，根据扩增长度按常规扩增条件反应进行扩增。由诱生剂诱导产生的鸡IFN-a,因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多限制而价格昂贵,极大限制了临床和科研的应用。原核表达存在着表达蛋白的产量低,不易于纯化以及菌株不稳定等问题，限制了向规模化生产的转化。而且大肠杆菌表达的鸡干扰素主要以包涵体的形式存在，包涵体在变性、复性上对人员技术及设备的要求都很高，且工序繁琐，损失得较多，这些增加了重组鸡干扰素工业产品的成本及生产难度。因此，本试验釆用酵母表达系统(J丄.Cereghino，J.M.Cregg，HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris)，这有禾ll于干扰素的产业化生产。三
发明内容技术问题本发明的目的在于对鸡a干扰素结构进行改造，以赋于其新的功能，研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增强剂用于增强鸡体的抵抗力和提高现有疫苗的保护率，同时克服现有技术中由诱生剂诱导产生鸡IFN-a的来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多限制，以及大肠杆菌表达的鸡干扰素主要以包涵体的形式存在，包涵体在变性、复性上对人员技术及设备的要求都很高，且s:序繁琐，损失得较多，这些增加了重组鸡干扰素工业产品的成本及生产难度。因此，我们研究出一种复合重组鸡a干扰素的基因序列的生产方法及其重组表达载体，达到高表达、高稳定、高分泌、高活性的生产，可广泛用于包括新城疫、禽流感在内的鸡的各种病毒性疾病的防制和早期治疗，以及增强鸡群的整体免疫力。技术方案一种重组鸡a干扰素基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1，其大小为582bp;上述重组鸡a干扰素基因的应用，包括(一)含有鸡a干扰素基因酵母表达载体的构建与鉴定将人工合成的权利要求1所述重组鸡a干扰素基因SEQIDNO.1加fcoRI和J力al两个酶切位点或者将以该基因设计引物用PCR扩增该鸡a干扰素基因SEQIDNO.1的产物与pPICZa-A酵母载体，分别进行I和JAal双酶切，回收酶切产物，T4DNALigase连接过夜，连接产物转化感受态E.coliDH5细胞得到重组表达载体，重组表达载体再进行酶为EcoRl和Xbal的双酶切鉴定，酶切切下大小为582bp的条带则鉴定为阳性载体，并将阳性载体送上海英俊公司进行DNA序列测定，序列测定完全符合SEQIDNO.1，其阳性载体即为构建的含有鸡a干扰素基因酵母表达载体，命名为pPICZa-A-rChIFN-a;(二)酵母菌感受态细胞的制备挑取毕赤酵母X-33菌平板上的一个单菌落转接于2mLYPD试管中，28'C250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500pL活化后的毕赤酵母X-33菌液转接于50mL的含有无菌5mLYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28。C恒温摇床250rpin摇荡培养20h左右，待菌液0D6。。=1.3-1.5时,4°C2500rpm/min离心lmin收获毕赤酵母X-33菌体，菌体依次用lmL冰预冷水洗涤两遍，再用lmL冰预冷的lmol山梨醇洗漆一次，4°C2500rpm/min离心lmin，最后用0.8mL冰预冷的lmol山梨醇悬浮菌体，分装不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即为为制备的酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞；(三)含有鸡a干扰素基因酵母表达载体电转化入酵母菌(1)取经Sacl酶线性化后的上述含有鸡a干扰素基因的酵母表达载体10)iL，与80上述感受态酵母菌毕赤酵母X-33混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转化杯中，冰上放置5min;(2)将电转化杯放在电穿孔仪上用脉冲电流进行电击一次，电击条件电压1500V,电容25uF,电阻200Q，时间5ms;(3)电击结束，立即加入lmL冰预冷的lmol山梨醇，混匀，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28"C恒温培养箱，培养lh，然后取250pL转化物涂含有100ng/mLZeocin抗性的YPDS培养基平皿上，置28'C恒温培养2-4天，将在YPDS培养基上生长的含pPICZa-A-rChlFN-a的载体重组酵母菌落进行阳性鉴定；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a载体重组酵母菌株的阳性鉴定(1)提取酵母基因组DNA:将上述YPDS培养基上生长的pPICZa-A-rChlFN-a载体重组酵母菌落挑至含lOOng/mLZeocin的YPDS液体培养基中，28'C摇床培养36h-48h，然后从该菌液中提取酵母基因组DNA:取IraL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min离心lmin,弃上清，用lmL的灭菌水重悬菌体，重复两次，然后加lOOpL的灭菌水，10(TC煮10分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，IO(TC煮IO分钟，12000rpm/min离心取上清液，即为酵母基因组DNA;(2)用来阳性鉴定的AOXl引物上游-5'陽gactggttccaattgagaagc-3，下游-5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR扩增鉴定以酵母基因组DNA为模板，以A0X1引物为特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为10XPCKBuffer5.OpL;10mMdNTPs1.OpL;20pmol/nL5'A0X1引物0.5(iL:基因组DNA模板5.OjxL;20pmol/VL3'A0X1引物0.5|iL;Taq酶0.5)iL;灭菌水补体积至50pL扩增程序95。C5min，94。Clmin,54。C1.5min，72。C2.5min,30个循环，72。C7min，扩增结束，取5HL反应液做琼脂糖凝胶电泳观察，获得扩增片段总长度为U68bp的条带，则为含有pPICZci-A-rChIFN-a载体的重组酵母阳性菌株；(五)高拷贝酵母菌株的筛选将YPDS培养基平皿中长出的上述含有pPICZa-rChlFN-a载体的重组酵母阳性菌落，以影印法依次接种到含Zeocin抗生素浓度梯度为250，500，1000)ig/raL的YPDS固体培养基中，筛选的Zeocin抗性菌株即为含有pPICZa-rChlFN-a基因的高拷贝菌株；(六)含有PPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母高拷贝菌株的诱导表达从含有上述高拷贝菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株接于25mL的BMGY液体培养基中，经28。C摇床培养至0D60O=2-6时，室温1500rpm/min离心5min收获菌体，将收获的菌体用lOOmL的BMMY培养液悬浮于500mL的三角瓶中，置于28'C摇床进行诱导表达，每24h向培养基中补加终浓度为体积比1%的甲醇，以保持诱导的持续表达，在诱导72h时收集培养的含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母菌体表达的上清备用；(七)含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的高表达酵母菌株表达产物的获得将上述收集的含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母菌体的表达上清装入透析袋，用1XPBS进行透析除盐离子，透析后用直径0.22陶的滤膜进行过滤除菌及杂质，即得到了本发明重组鸡a干扰素基因的表达蛋白；有益效果本发明鸡a干扰素的基因序列及氨基酸序列，是查找了目前GenBank上公布的27种鸡a干扰素基因序列，将收集的这27种干扰素的氨基酸序列用DANMAN或者LasergeneDNAstar等软件进行比对分析，以择量录取原则，选择出现频率最高的氨基酸，拼接出一个人造干扰素氨基酸序列模板。用LasergeneDNAstar分析新干扰素氨基酸结构，与其他表达或不表达蛋白质结构进行比较，结构越简单越有利于表达；确定好氨基酸序列后，按照偏嗜密码子的偏嗜性进行设计新干扰素基因序列在偏嗜性差别不大或密码子出现频率不很极端的情况下，选择GC含量高的偏嗜密码子，使酵母表达的基因GC含量控制在45%左右，接近酵母本身基因组的GC含量。确定好新基因序列后根据其长度设计引物，用PrimerPremier5.0软件共设计十六条引物，根据扩增长度按常规扩增条件反应进行，设计而成。本发明所用巴氏德毕赤酵母表达系统即巴氏德毕赤酵母X-33菌是已被国内外广泛用来表达外源蛋白质的一种公知菌株(齐连权，人"干扰素在巴士德毕赤酵母中的表达，2003年军事医学科学院院刊；Cereghino等，Heterogousproteinexpressioninthemethylotrophicyeast尸j'c/iapasWs)它能利用甲醇作为唯一碳源大量合成蛋白质，主要有以下几个生物特性a:利用甲醇作为唯一碳源快速生长；B:毕赤酵母中存在许多微体细胞器，它们可以大量储存蛋白质，该特点对表达外源蛋白质非常有利，可以使其免受蛋白酶的降解；C:可以对表达的外源蛋白进行适度的糖基化等修饰，使外源蛋白能够最大程度上保持其天然结构U丄.Cereghino，J.M.Cregg,HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris)。利用巴氏德毕赤酵母表达载体表达外源蛋白的优点A:高表达含有醇氧化酶的强启动子，细胞生长速度快，能够较高的表达外源蛋白；B:高稳定该载体不是以自主复制的形式存在而是整合在酵母菌的染色体上，所以构建的重组菌株很稳定；C:高分泌1995年RomanosM.等报道含有a交配因子的分泌和先导序列，可以使外源蛋白分泌到培养上清，而且表达的外源蛋白的纯度达到75%以上；D:培养成本低，产物易分离纯化；E:可以大体积高密度连续发酵培养；F:作为真核表达系统，可对目的蛋白进行翻译后加工和修饰；G:该表达系统有多种受体菌和表达载体供选择,进行胞内表达或分泌表达，有利于产物的提取和加工。本发明将新型鸡a干扰素的基因序列通过电转化方式整合到酵母上的特定位置。这株重组菌表达的干扰素经抗病毒活性测定具有很高的抗病毒活性，本设计研制出的干扰素的抗病毒活性与山东某公司的天然a干扰素的工程菌的活性进行了比较其活性提高了6.8倍。并且采用毕赤酵母表达系统表达外源基因，酵母本身蛋白分泌到上清中的很少，这样就增加了所表达外源蛋白的纯度，有利于该干扰素的规模化生产。我国是一个养鸡大国，但目前有多种传染病严重危害着我国养鸡业的发展，影响了我国鸡肉的对外贸易。鸡的病毒性疾病尤其是烈性传染性病毒性疾病，如禽流感、新城疫、马立克氏病等的地区性流行给养鸡业带来数亿计的损失。因此，急需从多个角度对IFN的结构进行改造，以赋于其新的功能以及大量生产高质量的IFN制剂研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增强剂用于增强鸡体的抵抗力和提高现有疫苗的保护率，这也是本发明设计的目的。本研究采用的毕赤氏酵母基因工程菌生产的新型鸡a干扰素与传统生产的鸡a干扰素和用大肠杆菌表达的a干扰素相比有以下几个优点A获得具有生物活性的重组鸡a干扰素方法和程序都简单只需收集表达的上清进行透析除盐、过滤除菌处理后无需纯化即可投入临床使用；B无毒害物质酵母不会分泌向大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对鸡体细胞有毒害的毒素；C纯度高酵母表达的鸡a干扰素的SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母鸡a干扰素的目的条带占总表达蛋白量的80%;D广谱抗病毒作用现国外资料表明鸡干扰素对鸡的各种病毒性疾病的病毒(劳氏肉瘤病毒等等)均有较好的抑制作用，尤其对一些烈性传染性病毒性疾病如禽流感、新城疫、马立克氏病、法氏囊病的早期治疗和防制有很好的作用，能在很大程度上遏制各种鸡传染性的病毒性疾病的流行和爆发；E抗病毒作用强该新型基因组表达的蛋白经过4365158.3倍稀释后，能完全抑制100-1000TCID50的水疱性口炎病毒的攻击。与天然的鸡a干扰素相比，有更强的抗病毒作用，其抗病毒作用提高了6.8倍。本试验还测定经lOOOU/mL和100U/mL的新型重组的鸡a干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中新城疫病毒的滴度分别比对照降低了1.71Logl0TCID5。和0.87LoglOTCID5。；经lOOOU/mL和100U/mL的新型重组的鸡a干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中禽流感病毒的滴度分别比对照降低了1.81Logl0TCIDs。和0.90LoglOTCIDM。，高浓度的干扰素作用更明显；F有强大的免疫调节作用医学临床把干扰素用于SARS、肝炎以及各种病毒性疾病治疗和预防的成功例子为重组鸡a干扰素用于鸡群各种病毒性疾病的治疗和防制提供了可靠的依据。近年我国鸡群因爆发的流行性的病毒性疾病给养殖业带来的损失数以亿计，而且诸如禽流感等病毒性传染病的局部地区的流行给养鸡业和人群的安全带来很大的威胁，这种损失是难以用金钱来衡量的。重组酵母鸡a干扰素的研制成功并具有较强的抗病毒活性，以及它所具有的一系列的便于工业化生产的优点，必将给我国鸡病毒性疾病的防制带来新的局面。四图1:重组鸡a干扰素基因PCR产物电泳分析1，DNA分子量标准；2-9,第一轮PCR产物;10-13，第二轮PCR产物;14-15,第三轮PCR产物;16,第四轮PCR产物，为最终目的片段图2:pPICZa-A-chlFN-con-a阳性克隆载体的酶切鉴定1，空质粒酶切对照；2,EcoRI和Xbal酶切的重组表达载体；3，4500DNA分子量标准图3:重组酵母菌的PCR鉴定1，4500DNA分子量标准；2，未重组上的空酵母X-33对照；3，阳性重组酵母菌图4:PCR扩增示意图五具体实施例方式一、试验材料Ssc/en'cWaco//DH5a,酵母菌X-33，pPICZa-A载体购自南京天根生化科技公司；新城疫病毒、禽流感病毒购自江苏农科院兽医所；SPF鸡胚购自南京乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂；所用化学试剂均购自Takara公司；商品鸡天然a干扰素购于山东某生物科技有限公司；设计该干扰素时选择野生型及抗病力较强的品种的a千扰素亚型为模板；将收集的干扰素氨基酸序列用DANMAN或者LasergeneDNAstar等软件进行比对分析，以择量录取原则，选择出现频率最高的氨基酸，拼接出一个人造干扰素氨基酸序列模板。LasergeneDNAstar分析新干扰素氨基酸结构，与其他表达或不表达蛋白质结构进行比较结构越简单越有利于表达；确定好氨基酸序列后，按照偏嗜密码子的偏嗜性改造新型干扰素基因序列，在偏嗜性差别不大或密码子出现频率不很极端的情况下，选择GC含量高的偏嗜密码子，使酵母表达的基因GC含量控制在45。/。左右，接近酵母本身基因组的GC含量。确定好新基因序列后根据其长度设计引物，用PrimerPremier5.0软件共设计了十六条引物，根据扩增长度按常规扩增条件反应进行扩增。二、试验设计及生产方法(一)重组到毕赤酵母上的新型鸡a干扰素的基因序列的的设计及扩增(A)在GenBank上查找鸡ci干扰素的基因序列，选择野生型及抗病力较强的品种的a干扰素亚型为模板共27种；(B)通过DNAStar进行基因序列比较，以择量录取原则，将出现频率高的氨基酸进行重新组合，拼接出一个人造干扰素氨基酸序列模板，该氨基酸序列模板为含582bp的新的碱基序列SEQIDNO.l,加两个酶切位点及保护性碱基，共597bp,根据密码子偏嗜性，全部换用酵母的偏嗜性密码子(赵翔霍克克李育阳毕赤酵母的密码子用法分析)。基因GC含量控制在45%左右，接近酵母本身基因组GC含量(GrahamSinclair,FrancisY.M.Choy.Synonymouscodonusagebiasandtheexpressionofhumanglucocerebrosidaseinthemethylotrophicyeast,Pichiapastoris);(C)确定好新基因序列后根据其长度设计引物，用PrimerPremier5.0进行引物设计，共设计16条，每条引物之间重叠15-20bp见表1。表l设计的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(D)SOE法进行PCR扩增，见图4反应体系5XPrimeSTARBuffer10.0|xL;P上游引物1.0;P下游引物1.0|_iL;ddH2033如L;在PCR仪上设置95°C5min，随后94'Cl8s,54°C18s，72°C18s，共30个循环，结束循环后72°C10min;对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡a干扰素基因大小。以上面体系对引物两两进行扩增，然后回收PCR产物，再以PCR产物为模板进行如下体系扩增5XPrimeSTARBuffer10.0|_iL;PrimeSTAR0.4;P上游引物0.25nL;dNTP4.0nL;P下游引物0.25模板l2.0nL;模板22.0|iL;ddH2031.1pL;在PCR仪上设置95。C5min,随后94。Cl8s，54。C18s,72'Cl8s，共30个循环，结束循环后72°C10min;对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡a千扰素基因大小。最后扩增出PCR产物的基因片段大小为597bp见图1;(二)含有鸡a干扰素基因酵母表达载体的构建与鉴定将人工合成的重组鸡a干扰素基因SEQIDNO.1加￡coRI和Z力al两个酶切位点或者将以该基因设计引物用PCR扩增该鸡a干扰素基因SEQIDNO.1的产物与pPICZa-A酵母载体，分别进行I和Xfel双酶切，回收酶切产物，T4DNALigase连接过夜,连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞得到重组表达载体，重组表达载体再进行酶为EcoRI和XbaI的双酶切鉴定，酶切切下大小为582bp的条带则鉴定为阳性载体,对阳性载体送上海英俊公司进行DNA序列测定，序列测定完全符合SEQIDNO.1，其阳性载体即为构建的含有鸡a干扰素基因酵母表达载体，命名为pPICZa-A-rChlFN-a;见图2;(三)酵母菌感受态细胞的制备挑取毕赤酵母X-33菌平板上的一个单菌落转接于2mLYPD试管中，28'C250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500pL的活化后的毕赤酵母X-33菌液转接于50mL的含有无菌5mLYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28'C恒温摇床250rpra摇荡培养20h左右，待菌液0D6。。=1.3-1.5时，4°C2500rpm/min离心lmin收获毕赤酵母X-33菌体，菌体依次用lmL冰预冷水洗涤两遍，再ffllmL冰预冷的lmol山梨醇洗涤，4'C2500rpm/min离心lmin，最后用0.8mL冰预冷的lmol山梨醇悬浮菌体，分装不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即为为制备的酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a的表达载体电转化入酵母菌(1)取经SacI酶线性化后的上述含有鸡a干扰素基因的酵母表达载体lOjiL,与80上述酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转化杯中,冰上放置5min:(2)将电转化杯放在电穿孔仪上用脉冲电流进行电击一次，电击条件电压1500V,电容25uF,电阻200Q,时间5ms;(3)电击结束，立即加入lmL冰预冷的lmol山梨醇，混匀，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28'C恒温培养箱，培养lh，然后取250nL转化物涂含有100pg/mLZeocin抗性的YPDS培养基平皿上，置28'C恒温培养2-4天，将在YPDS培养基上生长的pPICZa-A-rChIFN-a载体重组酵母菌落进行阳性鉴定；(五)含pPICZa-A-rChlFN-a载体重组酵母菌株的阳性鉴定(1)提取酵母基因组DNA:将上述YPDS培养基上生长的pPICZa-A-rChIFN-a载体重组酵母菌落挑至含lOOng/mLZeocin的YPDS液体培养基中，28。C摇床培养36h_48h，然后从该菌液中提取酵母基因组DNA:取lmL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min离心lmin,弃上清，用lmL的灭菌水重悬菌体，重复两次，然后加lOOpL的灭菌水，IO(TC煮IO分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，IOO'C煮IO分钟，12000rpm/niin离心取上清液，即为酵母基因组DNA,以其为模板进行PCR阳性鉴定(Linder，S.,Schliwa,M.，Kube-Granderath，E.,1996.DirectPCRscreeningof,/。加"》clones.BioTechniques);(2)用来阳性鉴定的AOX1引物上游5，-gactggttccaattgagaagc-3，下游5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR扩增鉴定以酵母基因组DNA为模板，以A0X1引物为特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为10XPCRBuffer:5.OpL;10mMdNTPs:l.O(xL;20pmol/VL5'A0X1引物0.5jaL;基因组DNA模板5.0)iL;20pmol/iaL3'A0X1引物0.5pL;T叫酶0.5pL;灭菌水补体积至50nL扩增程序95'C5min,94。Clmin，54。C1.5min,72°C2.5min,30个循环，72。C7min，扩增结束，取5|xL反应液做琼脂糖凝胶电泳观察，获得扩增片段总长度为U68bp的条带，则为含有pPICZa-A-rChIFN-a载体的重组酵母阳性菌株；见图3;(六)高拷贝酵母菌株的筛选将YPDS培养基平皿中长出的上述含有pPICZa-A-rChIFN-a载体的重组酵母阳性菌落，以影印法依次接种到含Zeocin抗生素浓度梯度为250，500，1000ng/mL的YPDS固体培养基中，筛选的Zeocin抗性菌株即为含有pPICZa-A-rChlFN-a基因的高拷贝菌株；(七)含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母高拷贝菌株的诱导表达从含有上述高拷贝菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株接于25mL的BMGY液体培养基中，经28。C摇床培养至0D6a)=2-6时，室温1500rPm/min离心5min收获菌体，将收获的菌体用lOOmL的BMMY培养液悬浮于500mL的三角瓶中，置于28'C摇床进行诱导表达，每24h向培养基中补加终浓度为体积比1%的甲醇，以保持诱导的持续表达，在诱导72h时收集培养的含有pPICZa-A-rChIFN-a载体的重组酵母菌体表达的上清备用；(八)含有pPICZa-A-rChIFN-a载体高表达酵母菌株表达产物的获得将上述收集的含有pPICZa-A-rChIFN-a载体的重组酵母菌体的表达上清装入透析袋，用1XPBS进行透析除盐离子，透析后用直径0.22陶的滤膜进行过滤除菌及杂质，即得到了本发明重组鸡a干扰素基因的表达蛋白；同时通过不同时段取样的电泳分析，进行SDS-PAGE电泳(U.K.Laemmli,CleavageofstructuralproteinsduringassemblyoftheheadofbacteriophageT4)发现在诱导了72h时的上清的电泳图上在31千道尔顿与44千道尔顿之间有一条大约37千道尔顿的明显的蛋白电泳条带，比预测的分子量大，其原因可能在表达时有不同程度的糖基化；(九)酵母表达的鸡a干扰素的生物活性的测定，并与商业鸡天然a干扰素进行活性比较采用微量细胞病变抑制法(侯云德.分子病毒学[M])取孵化9-10d的SPF鸡胚，去头、四肢及内脏，无菌状态下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成单个细胞后上96孔板，生长约12h使细胞全部贴壁生长后，去除生长液，每孔加入IO倍倍比稀释的干扰素，用100个TCID5o的剂量的口泡炎病毒(VSV)进行攻毒，细胞对照则加无病毒的营养液，同时设立阴性对照(只加10倍稀释的干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)，空白对照(不加干扰素，不加病毒)，在倒置显微镜下观察待对照孔出现75%以上病变的时候，判断结果；商业鸡天然a干扰素进行同样的活性测定；A、抗水疱性口炎病毒的结果接入病毒24小时后观察可见阳性对照孔完全出现100%严重病变，而加入进行10倍倍比稀释的酵母表达干扰素的细胞孔中，106未见任何细胞病变，在107稀释的孔中有45%左右的出现轻微病变，阴性对照孔中的鸡胚成纤维细胞未见异常。从上述结果得出重组酵母鸡a干扰素的生物学活性为4.43X10eU/mL;商业鸡天然a干扰素的生物学活性为6.51X105U/mL，重组酵母鸡a干扰素的生物学活性是天然a干扰素的生物学活性的6.8倍；表.2、pPICZa-A-rChIFN-a与商业鸡天然a干扰素生物学活性的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>B、重组酵母菌表达的鸡a干扰素的抗NDV、AIV的结果(1)AIV、NDV的TCIDBo的测定在96孔细胞板上，鸡胚成纤维细胞测定新城疫病毒、禽流感病毒的TCIDs。。；(2)对病毒的抑制作用(曹瑞兵，周国栋，周海霞，等.猪e干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用)鸡胚成纤维细胞记数后用培养液稀释到适当的密度，滴加到24孔板，置于37°C，5%C02的培养箱中待细胞贴壁成单层(约12-18h)后。分别加入终浓度为1000U/mL和100U/mL的复合重组a鸡干扰素继续培养，每个处理8个孔，同时设4孔病毒对照和4孔空白对照。24h后去上清，用无血清培养液洗涤细胞后，每孔加入100TCID5。/mL的AIV、NDVlmL。37'C吸附lh后，弃去病毒液。每孔加入lmL的含2%小牛血清的营养液，置于37'C，5%C02的培养箱继续培养至病毒对照孔的细胞出现明显的病变，当阳性对照出现明显病变时约60h-72h，将24孔板在-20'C冻融2次，各处理分别取3个样测定病毒滴度。(3)抗NDV、AIV的结果表.3、抗新城疫病毒的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分析经1000U/mL和100U/mL的新型重组的鸡a干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中NDV的滴度分别比对照降低了1.71LoglOTCID50禾Q0.87LoglOTCID50;表.4、抗禽流感病毒的结果处理方法干扰素浓度病毒滴度(loglOTCID50/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分析经1000U/mL和100U/mL的新型复合重组的鸡a干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中AIV的滴度分别比对照降低了1.81LoglOTCID50禾Q0.90LoglOTCID50;根据以上实验可以说明新型复合重组酵母鸡a干扰素己被成功研制出来,其4365158.3倍稀释便可完全抑制住100TCIDso水疱性口炎病毒的增殖。阴性对照孔中的细胞生长良好，说明酵母干扰素上清对鸡体细胞没有明显毒害。而且该复合重组酵母鸡a干扰素对AIV和NDV等都具有较强的抑制能力经1000U/mL和100U/mL该重组的鸡a干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中新城疫病毒的滴度分别比对照降低了1.71Logl0TCID5。和0.87LoglOTCIDs。；经lOOOU/mL和lOOU/mL该重组的鸡a干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中禽流感病毒的滴度分别比对照降低了1.81Logl0TCIDs。和0.90LoglOTCID5。。结果表明该基因表达的蛋白可抑制新城疫病毒和禽流感病毒的增殖，高浓度的干扰素作用更明显。该研究为重组鸡a干扰素的商业生产及在养鸡业中的应用提供了实验基础，为干扰素在鸡病防治应用中提供了试验依据。序列表<110>南京农业大学<120>一种重组鸡a干扰素基因及其重组载体<130>说明书<140>00<141>2008-06-12<160>18<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>582<212>DNA<213>SEQIDNO.3<220><221>鸡a干扰素成熟蛋白的基因序列<222>(1)..(582)<223><400>1atggctgttccagcttctccacaacatccaagaggttacggtattttgttgttgactttg60ttgttgaaggctttggctactactgcttctgcttgcaaccaccttcgcccccaggatgcc120accttctctcacgacagcctccagctcctccgggacatggctcccacactaccccagctg180tgcccacagcacaacgcgtcttgctccttcaacgacaccatcctggacaccagcaacacc240cggcaagccgacaaaaccacccacgacatccttcagcacctcttcaaaatcctcagcagc300cccagcactccagcccactggaacgacagccaacgccaaagcctcctcaaccggatccac360cgctacacccagcacctcgagcaatgcttggacagcagcgacacgcgctcccggacgcga420tggcctcgcaaccttcacctcaccatcaaaaaacacttcagctgcctccacaccttcctc480caagacaacgattacagcgcctgcgcctgggaacacgtccgcctgcaagctcgtgcctgg540ttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttag582<210>2<211>193<212>PRT<213>人工合成<220><221>鸡a干扰素成熟蛋白的氨基酸序列<222>(1)..(193)<223><400>2MetAlaValProAlaSerProGinHisProArgGlyTyrGlylieLeu151015LeuLeuThrLeuLeuLeuLysAlaLeuAlaThrThrAlaSerAlaCys202530AsnHisLeuArgProGinAspAlaThrPheSerHisAspSerLeuGin354045LeuLeuArgAspMetAlaProThrLeuProGinLeuCysProGinHis505560AsnAlaSerCysSerPheAsnAspThrlieLeuAspThrSerAsnThr65707580ArgGinAlaAspLysThrThrHisAsplieLeuGinHisLeuPheLys859095lieLeuSerSerProSerThrProAlaHisTrpAsnAspSerGinArg100105110GinSerLeuLeuAsnArglieHisArgTyrThrGinHisLeuGluGin115120125CysLeuAspSerSerAspThrArgSerArgThrArgTrpProArgAsn130135140LeuHisLeuThrlieLysLysHisPheSerCysLeuHisThrPheLeu145150155160GinAspAsnAspTyrSerAlaCysAlaTrpGluHisValArgLeuGin165170175AlaArgAlaTrpPheLeuHislieHisAsnLeuThrGlyAsnThrArg180185190Thr<210>3<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-Pl<222>(1)..(59)<223><400>3gcagaattcatggctgttccagcttctccacaacatccaagaggttacggtattttgtt59<210>4<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P2(43-101):<222>(1)..(59)<223><400>4cagaagcagtagtagccaaagccttcaacaacaaagtcaacaacaaaataccgtaacct59<210>5<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P3(81-139)<222>(1)..(59)<223><400>5ctttggctactactgcttctgcttgcaaccaccttcgcccccaggatgccaccttctct59<210>6<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P4(119-177)<222>(1)..(59)<223><400>6gtgggagccatgtcccggaggagctggaggctgtcgtgagagaaggtggcatcctgggg59<210>7<211>58<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P5(157-214)<222>(1)..(58)<223><400>7cctccgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcgtcttgc58<210>8<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P6(193-251)<222>(1)..(59)<223><400>8cgggtgttgctggtgtccaggatggtgtcgttgaaggagcaagacgcgttgtgctgtgg59<210>9<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P7(232-291)<222>(1)..(59)<223><400>9ctggacaccagcaacacccggcaagccgacaaaaccacccacgacatccttcagcacct59<210>10<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P8(271-329)<222>(1)..(59)<223><400>10cagtgggetggagtgctggggctgctgagga加gaagaggtgctgaaggatgtcgtg59<210>11<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P9(309-368)<222>(1)..(59)<223><400>11ccccagcactccagcccactggaacgacagccaacgccaaagcctcctcaaccggatcc59<210>12<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P10(348-406)<222>(1)..(59)<223><400>12gctgtccaagcattgctcgaggtgctgggtgtagcggtggatccggttgaggaggcttt59<210>13<211>56<22>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P11(386-441)<222>(1)..(56)<223><400>13ctcgagcaatgcttggacagcagcgacacgcgctcccggacgcgatggcctcgcaa56<210>14<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P12(421-479)<222>(1)..(59)<223><400>14tggaggcagctgaagtgttttttgatggtgaggtgaaggttgcgaggccatcgcgtccg59<210>15<2U>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P13(459-517)<222>(1)..(59)<223><400>15aaaacscttcagctgcctccacaccttcctccaagacaacgattacagcgcctgcgcct59<210>16<211>58<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P14<222>(1)..(58)<223><400>16aggaaccaggcacgagcttgcaggcggacgtgttcccaggcgcaggcgctgtaatcgt58<210>17<211>64<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P15(534-597)<222>(l).洲<223><400>17gcaagctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttctag60atga<210>18<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P16(73-597)<222>(1)..(25)<223>40O18tccgttgtgcgcgtgaagatctact2权利要求1、一种重组鸡α干扰素基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1，其大小为582bp。2、权利要求l所述重组鸡a干扰素基因的应用，包括(一)含有鸡a干扰素基因酵母表达载体的构建与鉴定将人工合成的权利要求1所述重组鸡a干扰素基因SEQIDNO.1加AcoRI和J6al两个酶切位点或者将以该基因设计引物用PCR扩增该鸡a干扰素基因SEQIDNO.1的产物与pPICZa-A酵母载体，分别进行￡coRI和Jtel双酶切，回收酶切产物，T4DNALigase连接过夜,连接产物转化感受态E.coliDH5a得到重组表达载体，重组表达载体再进行酶为EcoRI和XbaI的双酶切鉴定，酶切切下大小为582bp的条带则鉴定为阳性载体，并将阳性载体送上海英俊公司进行DNA序列测定，完全正确的阳性载体即为构建的含有鸡a干扰素基因酵母表达载体，命名为pPICZa-A-rChIFN-a;(二)酵母菌感受态细胞的制备挑取毕赤酵母X-33菌平板上的一个单菌落转接于2mLYPD试管中，28'C250rpm恒温摇过夜活化12h后,取500pL的活化后的毕赤酵母X-33菌液转接于50mL的含有无菌5mLYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28'C恒温摇床250rpm摇荡培养20h左右，待菌液ODeoo=l.3-1.5时，4°C2500rpm/min离心lmin收获毕赤酵母X-33菌体，菌体依次用lmL冰预冷水洗涤两遍，再用lmL冰预冷的lmol山梨醇洗涤，4。C2500rpm/min离心lmin，最后用0.8mL冰预冷的lmol山梨醇悬浮菌体，分装不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即为制备的酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞；(三)含有鸡a干扰素基因酵母表达载体电转化入酵母菌感受态细胞(1)取经Sacl酶线性化后的上述含有鸡a干扰素基因的酵母表达载体10pL，与80上述酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转化杯中，冰上放置5min;(2)将电转化杯放在电穿孔仪上用脉冲电流进行电击一次，电击条件电压1500V，电容25uF,电阻200Q,时间5ms;(3)电击结束，立即加入lmL冰预冷的lmol山梨醇，混匀，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28'C恒温培养箱，培养lh,然后取25(^L转化物涂含有100^ig/mLZeocin抗性的YPDS培养基平皿上，置28'C恒温培养2-4天，将在YPDS培养基上生长的含pPICZa-A-rChIFN-a载体的重组酵母菌落进行阳性鉴定；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a载体重组酵母菌株的阳性鉴定(1)提取酵母基因组DNA:将上述YPDS培养基上生长的含pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母菌落挑至含100ug/mLZeocin的YPDS液体培养基中，28'C摇床培养36h-48h，然后从该菌液中提取酵母基因组DNA:取lmL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min离心lrain，弃上清，用lmL的灭菌水重悬菌体，重复两次，然后加100uL的灭菌水，100'C煮10分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，IOO'C煮10分钟，120000rpm/min离心取上清液，即为酵母基因组DNA;(2)用来阳性鉴定的A0X1引物上游-5，-gactggttccaattgagaagc-3，下游.'5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR扩增鉴定以酵母基因组DNA为模板，以A0X1引物为特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为:5.OpL;0.5^L;0.5)LlL;10mMd,s基因组DNA模板Taq酶1.OpL;5.OpL;0.5pL;10XPCRBuffer20pmol/pL5'A0X1引物20pmolAiL3'A0X1引物灭菌水补体积至50pL扩增程序95。C5min，94。Clmin,54。C1.5min，72。C2.5min，30个循环，72。C7min，扩增结束，取5HL反应液做琼脂糖凝胶电泳观察，获得扩增片段总长度为U68bp的条带，则为含有pPICZa-A-rChIFN-a载体的重组酵母阳性菌株；(五)高拷贝酵母菌株的筛选将YPDS培养基平皿中长出的上述含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母阳性菌落，以影印法依次接种到含Zeocin抗生素浓度梯度为250，500，1000吗/mL的YPDS固体培养基中，筛选的Zeocin抗性菌株即为含有pPICZa-A-rChlFN-a基因的高拷贝菌株；(六)含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母高拷贝菌株的诱导表达从含有上述高拷贝菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株接于25mL的BMGY液体培养基中，经28'C摇床培养至ODeoo-2-6时，室温1500rpm/min离心5min收获菌体，将收获的菌体用lOOmL的BMMY培养液悬浮于500mL的三角瓶中，置于28'C摇床进行诱导表达，每24h向培养基中补加终浓度为体积比lX的甲醇，以保持诱导的持续表达，在诱导72h时收集培养的含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母菌体表达的上清备用；(七)含有pPICZa-rChlFN-a载体的高表达酵母菌株表达产物的获得将上述收集的含有pPICZa-A-rChlFN-a载体的重组酵母菌体的表达上清装入透析袋，用1XPBS进行透析除盐离子，透析后用直径0.22Mm的滤膜进行过滤除菌及杂质，即得到了本发明重组鸡a千扰素基因的表达蛋白。3、权利要求2的所述重组鸡a干扰素基因的应用中所构建的酵母表达载体pPICZa-A-rChIFN-a。4、权利要求2的所述重组鸡a干扰素基因的应用中所获得的含有pPICZa-A-rChIFN-a载体的重组酵母载体的菌株。5、权利要求2的所述重组鸡a干扰素基因的应用中所获得的重组鸡a干扰素基因的表达蛋白。全文摘要本发明涉及一种新型重组鸡α干扰素基因序列，并构建其重组表达载体，属于用分子生物学方法获得的基因工程生物制品。将新设计的鸡α干扰素的基因序列重组到pPICZα-A载体，然后通过电转化方式整合到酵母菌上的特定位置。并采用毕赤酵母表达系统表达外源基因，有利于鸡干扰素商业化生产。该基因组表达的蛋白经过4365158.3倍稀释后，能完全抑制100-1000TCID₅₀的水疱性口炎病毒的攻击。与天然的鸡α干扰素相比，有更强的抗病毒作用，其抗病毒作用提高了6.8倍。试验还测定该基因表达的蛋白可抑制新城疫病毒和禽流感病毒的增殖，且高浓度的干扰素作用更明显。文档编号C12N15/19GK101338314SQ20081012399公开日2009年1月7日申请日期2008年6月16日优先权日2008年6月16日发明者侯凤香,珂刘,陈溥言申请人:南京农业大学