专利名称：猫ω干扰素及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及猫ω干扰素及其编码基因与其在制备猫自血病病毒、FIV以及狗细小病毒的抗感染药物中的应用。
背景技术：
干扰素是细胞对病毒感染或各种合成及生物诱生作用反应，而产生并分泌的一类天然生成的蛋白分子，分子量为15,000-21,000道尔顿。已经确定的干扰素有两大类I型和II型。I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-τ四个亚型，II型干扰素主要有IFN-γ。
1992年，日本东丽株式会社(Toray Industries，Inc.)的Nakamura等人首次分离到了猫干扰素基因(Molecular cloning of feline interferon cDNA by directexpression.Biosci Biotechnol Biochem.1992，56(2)211-4)，并于1993年将其归类于ω型干扰素(Homogenous production of feline interferon in silkworm byreplacing single amino acid code in signal peptide region in recombinantbaculovirus and characterization of the product.J.Vet.Med.Sci.1993，55(2)251-8)。1994年，以其为基础的重组干扰素药物Intercat在日本上市，并被用于治疗猫calicivirus感染和狗细小病毒感染。此后，猫IFN-α、IFN-β和IFN-γ相继被分离到。但是，2002年Ramani Wonderling等人发表的文章显示，Nakamura等人分离到的猫ω型干扰素基因与猫α型干扰素基因同源性达94-99％(Cloning，expression，purification，and biological activity of five feline type Iinterferons.Vet Immunol Immunopathol.2002，89(1-2)13-27)。并且，1997年Roberts RM等人对IFN-α和IFN-ω的区别进行了定义(New and atypical families oftype I interferons in mammalscomparative functions，structures，andevolutionary relationships.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.1997，56287-325)，区别主要有两点第一，IFN-ω在C端具有由六个氨基酸残基组成的保守氨基酸序列，而这个序列在IFN-α、IFN-β和IFN-τ中均不存在；第二，脯氨酸的位置和数目具有高度保守性，IFN-α在自N端第4，26，39，110和139位存在保守的脯氨酸，而IFN-ω缺乏自N端第139位的脯氨酸。Nakamura等人分离到的猫ω型干扰素基因既不具备IFN-ωC端应具有的保守氨基酸序列，而且在自N端第142位存在脯氨酸，因此认为Nakamura等人分离到的猫ω型干扰素基因实际上应为猫α型干扰素基因。
发明内容
本发明的目的是提供一个猫ω干扰素及其编码基因。
本发明所提供的猫ω干扰素，来源于家猫(Felis sivestris)，是具有下述猫ω干扰素家族的氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)序列表中的SEQ ID №3；4)序列表中的SEQ ID №4；5)序列表中的SEQ ID №5；6)序列表中的SEQ ID №6；7)序列表中的SEQ ID №7；8)序列表中的SEQ ID №8；9)序列表中的SEQ ID №9；10)序列表中的SEQ ID №10；11)序列表中的SEQ ID №11；12)序列表中的SEQ ID №12；13)序列表中的SEQ ID №13；14)将序列表中SEQ ID№1-13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对猫白血病病毒、FIV以及狗细小病毒具有抗感染作用的蛋白质。
具有序列表中SEQ ID №1-13氨基酸残基序列的蛋白可分别命名为FeIFN-ω1至FeIFN-13，序列表中的SEQ ID №1-11由196个氨基酸残基组成，SEQ ID №12-13由203个氨基酸残基组成。
上述猫ω干扰素的编码基因，选自下述猫ω干扰素家族的核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №14的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №15的DNA序列；3)序列表中SEQ ID №16的DNA序列；4)序列表中SEQ ID №17的DNA序列；5)序列表中SEQ ID №18的DNA序列；6)序列表中SEQ ID №19的DNA序列；7)序列表中SEQ ID №20的DNA序列；8)序列表中SEQ ID №21的DNA序列；
9)序列表中SEQ ID №22的DNA序列；10)序列表中SEQ ID №23的DNA序列；11)序列表中SEQ ID №24的DNA序列；12)序列表中SEQ ID №25的DNA序列；13)序列表中SEQ ID №26的DNA序列；14)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №14-26限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；15)编码序列表中SEQ ID №1蛋白的DNA序列；16)编码序列表中SEQ ID №2蛋白的DNA序列；17)编码序列表中SEQ ID №3蛋白的DNA序列；18)编码序列表中SEQ ID №4蛋白的DNA序列；19)编码序列表中SEQ ID №5蛋白的DNA序列；20)编码序列表中SEQ ID №6蛋白的DNA序列；21)编码序列表中SEQ ID №7蛋白的DNA序列；22)编码序列表中SEQ ID №8蛋白的DNA序列；23)编码序列表中SEQ ID №9蛋白的DNA序列；24)编码序列表中SEQ ID №10蛋白的DNA序列；25)编码序列表中SEQ ID №11蛋白的DNA序列；26)编码序列表中SEQ ID №12蛋白的DNA序列；27)编码序列表中SEQ ID №13蛋白的DNA序列；所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
具有序列表中SEQ ID №14-26多核苷酸序列的基因可分别命名为FeIFN-ω1至FeIFN-ωω13，序列表中的SEQ ID №14-24由591个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-第591位碱基，分别编码具有序列表中SEQ ID №1-11氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID №25-26由612个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-第612位碱基分别编码具有序列表中SEQ ID №12-13氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌以及扩增猫ω干扰素编码基因中任一片段的引物对均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述猫ω干扰素的方法。
本发明所提供的表达上述猫ω干扰素的方法，是将含有上述猫ω干扰素编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到猫ω干扰素。
所述宿主为任一可表达外源基因的原核或真核细胞。
所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli DH5α、E.coli TB1或E.coli BL21DE3等。
所述真核细胞可为酵母细胞、哺乳动物细胞和植物细胞等，包括酵母菌SMD1168H、酵母菌GS115、酵母菌X-33、酵母菌KM71H、COS-7、CHO或BHK-21等。
用于构建含有猫ω干扰素编码基因的重组表达载体的出发载体可为pLLp-STII(美国基因动力实验室)、pPICZαA(美国invitrogen公司)、pET载体系列、pQE载体系列、pPIC9K或pPICZα。
以pLLp-STII为出发载体，构建的含有所述去整合素基因的重组表达载体为FeIFN-ω/pLLp-STII。
以pPICZαA为出发载体，构建的含有所述去整合素基因的重组表达载体为FeIFN-ω/pPICZαA。
当所述宿主为大肠肝菌时，需加入IPTG进行诱导表达，所加入IPTG的浓度为0.2-1.0mM，优选为0.2mM。
当所述宿主为酵母菌时，需加入甲醇进行诱导表达，所加入甲醇的终浓度为0.1-1.0％，优选为0.5％。
培养含有本发明的去整合素编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
本发明还提供了一种猫白血病病毒、猫爱滋病毒以及狗细小病毒的抗感染药物。
本发明所提供的抗感染药物，其活性成分均为上述猫ω干扰素。
需要的时候，在上述抗感染药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为1-2.5MU/kg体重，连续给药或隔天给药，疗程为3-7天。
本发明所提供的猫干扰素与羊和人的ω型干扰素的氨基酸残基序列的同源性分别为64％和58％。而且，其氨基酸序列具备IFN-ωC端应具有的六个保守氨基酸序列，同时在自N端第139位氨基酸残基附近不存在脯氨酸，具备ω型干扰素的特征。本发明的猫ω干扰素及其编码基因有望制备成临床猫白血病病毒、FIV以及狗细小病毒的抗感染药物，将在动物疾病的防治中发挥重要作用。
图1为猫ω型干扰素基因的大肠杆菌表达产物的SDS-PAGE检测结果图2为猫ω型干扰素基因的酵母表达产物的SDS-PAGE检测结果图3为经纯化的重组猫ω型干扰素的SDS-PAGE检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有引物合成及测序工作均由上海生工完成。而且，实验表明，在以下的所有实验中，13种不同猫ω干扰素亚型基因的结果是一致的。
实施例1、猫ω干扰素基因的克隆1、引物设计根据干扰素家族的保守氨基酸残基序列，并参照人ω干扰素基因序列设计一对引物，引物序列如下P15’-atggccctcctgctccctct-3’P25’-tcaagatgassccaggtctccatc-3’2、猫脾总RNA的提取取患急性腹膜炎的猫脾组织约200mg，迅速剪碎后转移到玻璃研磨器中，加入2mLTrizol试剂(Invitrogen公司)，与脾组织混匀后置于冰上15min，研磨10-15次，使脾细胞充分裂解。然后，将Trizol-脾组织匀浆转移到1.5mL RNase-free离心管中，加入1/5匀浆体积的氯仿，剧烈混匀15sec，离心15min。取上清，再加入与上清等体积的异丙醇，室温沉淀10min，离心10min。弃上清，用75％乙醇离心洗涤沉淀一次，沉淀置于空气中晾干。最后，加入30μl双蒸水(RNase-free)溶解RNA沉淀，即得猫脾总RNA。
3、RT-PCR扩增猫ω干扰素基因以提取的猫脾总RNA为模板，在引物P1和引物P2的引导下，利用QIAGEN one-stepRT-PCR试剂盒(QIAGEN公司)并参照试剂盒说明书进行猫ω干扰素基因的扩增，反应条件为首先50℃ 30min；其次94℃ 10min；再次94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 5min。将PCR产物于4℃保存。
4、测序及序列分析将PCR扩增的大小约600bp左右的目的DNA亚克隆入T载体pGEM-T(promega公司)中，经筛选后挑取单克隆测序，测序结果表明共得到13种不同的干扰素亚型基因序列，分别具有序列表中的SEQ ID №14-26的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №14-24由591个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-第591位碱基，分别编码具有序列表中SEQ ID №1-11的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID №25-26由612个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-第612位碱基，分别编码具有序列表中SEQ ID №12-13的氨基酸残基序列的蛋白质。将所分离基因编码的氨基酸残基序列与羊和人的ω型干扰素的氨基酸残基序列进行同源性比较，与羊ω型干扰素的同源性为64％，与人ω型干扰素同源性为58％，Nakamura等人分离到的干扰素与羊ω型干扰素的氨基酸序列同源性为49％，与人ω型干扰素的氨基酸序列同源性为53％。而且，分离到的干扰素基因编码氨基酸序列具备IFN-ωC端应具有的六个保守氨基酸序列，同时在自N端第139位氨基酸残基附近不存在脯氨酸，具备ω型干扰素的特征。
实施例2、猫ω型干扰素基因的表达及其表达产物的纯化一、猫ω型干扰素基因在大肠杆菌中的表达及发酵生产1、含猫ω型干扰素基因的大肠杆菌表达载体FeIFN-ω/pLLp-STII的构建分别将含13种不同猫ω型干扰素亚型基因序列的质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后亚克隆入经同样酶双酶切的载体pLLp-STII中，将构建的原核表达质粒统称为FeIFN-ω/pLLp-STII，转化大肠杆菌DH5α。经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组菌，扩增培养工程菌，加入终浓度为0.2mM的诱导剂IPTG，在30℃下诱导3小时。培养结束后，对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为表达产物)，在19kD左右处出现一条蛋白条带，与预期结果相符，表明猫ω型干扰素基因在大肠杆菌中正确表达。
2、重组猫ω干扰素的发酵生产挑取步骤1获得阳性克隆单菌落，将其接种于100毫升含有100毫克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇瓶培养12小时，作为一级种子液；再以1％接种量将一级种子液转接于含6升LB液体培养基的发酵罐中，在与步骤1相同的条件下培养致OD600值为1.0。
冷休克处理发酵液发酵结束后，离心收集菌体，用含30mM Tris-HCl，质量百分含量为20％的蔗糖，1mM EDTA pH8.0(按每克菌体80mL计)的溶液悬浮菌体，冰浴，轻轻振荡10分钟。然后，8000g离心4℃，去除上清，将沉淀用5mM MgSO4悬浮后冰浴，轻轻振荡10分钟。12000g离心15分钟，取上清即为经冷休克处理后的发酵液。
二、猫ω型干扰素基因在酵母中的表达及发酵生产1、含猫ω型干扰素基因的酵母表达载体FeIFN-ω/pPICZαA的构建分别将含13种不同猫ω型干扰素亚型基因序列的质粒用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切后亚克隆入经同样酶双酶切的载体pPICZαA中，将构建的酵母分泌表达质粒统称为FeIFN-ω/pPICZαA，电转化SMD1168H酵母菌株，将转化子铺于含zeocin(Invitrogen公司)100μg/mL的YPDS(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，2％琼脂)平板，30℃培养2-3天，直至长出单菌落，经PCR鉴定后获得阳性重组菌。将阳性重组菌先接种于BMGY(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾(pH 6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)培养基中，30℃培养18h-20h，待OD600值为2-6时，1500g离心5min收集菌体，再换成BMMY培养基(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾(pH 6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)，在相同条件下继续培养使其OD600达到1，然后每24小时加入终浓度为0.5％的甲醇诱导表达，每24小时收集一次样品，30℃诱导48小时。培养结束后，对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图2所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为表达产物)，在19kD左右处出现一条蛋白条带，与预期结果相符，表明猫ω型干扰素基因在酵母菌中正确表达。
2、重组猫ω干扰素的发酵生产发酵罐为B.Braun公司的Biostat B.，容量为5升。具体的发酵过程为，挑取步骤1获得阳性克隆单菌落，将其接种于20mL含0.1μg/mL zeocin的YPD培养基(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃、250rpm培养30小时，再接入200mL无zeocin的YPD培养基中，30℃、250rpm培养24h。培养结束后，离心收集菌体，将菌体接种到2升BMGY培养基(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾(pH 6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)中，在30℃、溶氧30％以上、pH为5.5下，培养15h后，补加50％甘油，流速20mL甘油/L菌液/小时，当细胞湿重达240g/L时停补甘油，当溶氧大幅上升，pH值上升，培养基中甘油耗尽，开始滴加24％甲醇诱导表达，流速3.6mL甲醇/L菌液/hr，在8小时内，将甲醇浓度增加到70％，共诱导表达5天，使猫ω干扰素基因获得表达。
三、重组猫ω干扰素的纯化取步骤一和步骤二的发酵液，步骤一发酵液冷休克处理后离心取上清，步骤二发酵液10000g、离心10min沉淀菌体，取上清，用醋酸调节pH值为4.5，过阳离子交换层析柱(HiTrap SP FF，Amersham Biosciences)，收集目标洗脱峰，再过阴离子交换层析柱(HiTrap Q FF，Amersham Biosciences)，收集目标洗脱峰，过Sephacryl分子筛层析柱(Amersham Biosciences)，收集目标洗脱峰，过滤除菌后得到纯化的重组猫ω干扰素，对纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为纯化产物)，在19kD左右处出现一条蛋白条带，与预期结果相符，表明获得了纯度较高的猫ω型干扰素基。
实施例3、细胞病变抑制法鉴定重组猫omega干扰素的生物活性采用猫胚成纤维细胞和水疱性口炎病毒(VSV)测定重组猫omega干扰素的抗病毒效价，具体方法为取怀孕15天的猫胚，去头、四肢及内脏，无菌状态下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成单个细胞后上96孔板，培养至全部贴壁生长后，去除培养液，分两组，一组每孔加入4倍倍比(40-411U/mL)稀释的实施例2获得的大肠杆菌表达并经纯化的重组猫omega干扰素，另一组每孔加入4倍倍比(40-411U/mL)稀释的实施例2获得的毕赤酵母表达并经纯化的重组猫omega干扰素，用100TCID50剂量的病毒进行攻毒，对照孔加无病毒的培养液，同时设立阴性对照(只加经倍比稀释的重组猫omega干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)、空白对照(不加干扰素，不加病毒)，在倒置显微镜下观察对照孔出现50％以上病变的时候判断结果。24小时后进行观察，阳性对照孔出现100％严重病变，加入有经410，49和48U/mL倍比稀释的在大肠杆菌表达并经纯化的重组猫ω干扰素的细胞孔分别出现70％，40％，0％的病变，在加入高于4-8浓度干扰素的细胞孔，细胞状态良好，毕赤酵母表达的纯化重组猫ω干扰素进行411、410和49U/mL倍比稀释后所加入的细胞孔分别有80％，30％，0％的病变，在加入高于4-9浓度干扰素的细胞孔，细胞状态良好。阴性对照孔中是正常的细胞。上述结果表明大肠杆菌表达的重组猫omega干扰素的生物学活性为48U/mL，毕赤酵母表达的重组猫omega干扰素的生物学活性为49U/mL。
实施例4、安全性实验1、取200只9个月到两岁龄的猫(雌雄各半)，每只静脉注射107U/kg重组猫omega干扰素，结果76只猫出现轻微嗜睡，5-6小时后症状消失。25只猫体温略有升高，但在正常范围之内。体液中电解质指标未见异常。
2、取200只一岁到7岁龄的比格犬(雌雄各半)，每只静脉注射107U/kg重组猫omega干扰素，结果5只犬出现轻微嗜睡，5-6小时后症状消失。体液中电解质指标未见异常。
实施例5、重组猫ω干扰素的临床试用效果1、取感染有白血病病毒的猫30只，分为给药组和对照组，每组15只。给药组每天皮下注射1MU/kg的重组猫ω干扰素，对照组只注射安慰剂，连续注射三天。结果表明重组猫ω干扰素可以有效地治疗猫白血病病毒感染，发病猫病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热症状消失。
2、取30只一岁到7岁龄的比格犬(雌雄各半)，分为给药组和对照组，每组15只。给所有犬接种II型犬细小病毒(CPV)，至出现细小病毒感染症状。再将给药组每天静脉注射2.5MU/kg的重组猫ω干扰素，对照组只注射安慰剂，连续注射三天。结果表明重组猫ω干扰素可以有效地治疗犬细小病毒感染，发病犬病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热、呕吐、腹泻症状消失。
序列表<160>26<210>1<211>196<212>PRT<213>家猫(Felis sivestris)<400>1Met Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Thr Cys1 5 10 15Arg Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Ala Leu Pro Gly Ser His Ala Gln20 25 30Val Ser Arg Asp Asn Leu Val Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Arg Ala Arg Lys Asp Phe Arg Phe Pro Arg Glu50 55 60Met Leu Glu Gly Gly Gln Leu Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Val65 70 75 80Leu Arg Glu Leu Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Leu His Thr Glu Arg85 90 95Ser Ser Ala Ala Trp Ser Pro Ala Pro Leu His Gly Leu Arg Ser Gly100 105 110Leu His Arg Gln Leu Glu Ala Leu Asp Ala Cys Trp Leu Gln Ala Thr115 120 125Gly Glu Gly Glu Arg Ala Pro Gly Met His Gly Pro Ala Leu Ala Ile130 135 140Lys Arg Tyr Phe Gln Asp Ile Arg Val Tyr Leu Glu Asp Glu Gly Tyr145 150 155 160Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ala Leu165 170 175Ser Ser Ser Ala Thr Leu Gln Asp Ser Leu Ala Ile Lys Asp Gly Asp
180 185190Leu Ala Ser Ser195<210>2<211>196<212>PRT<213>家猫(Felis sivestris)<400>2Met Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Thr Cys1 5 10 15Arg Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Ala Leu Pro Gly Ser His Ala Gln20 25 30Val Ser Arg Asp Asn Leu Val Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Arg Ala Arg Lys Asp Phe Arg Phe Pro Arg Glu50 55 60Met Leu Glu Gly Gly Gln Leu Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Val65 70 75 80Leu Arg Glu Leu Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Leu His Thr Glu Arg85 90 95Ser Ser Ala Ala Trp Ser Pro Ala Pro Leu His Gly Leu Arg Ser Gly100 105 110Leu His Arg Gln Leu Glu Ala Leu Asp Ala Cys Leu Leu Gln Ala Thr115 120 125Gly Glu Gly Glu Arg Ala Pro Gly Met His Gly Pro Ala Leu Ala Ile130 135 140Lys Arg Tyr Phe Gln Asp Ile Arg Val Tyr Leu Glu Asp Glu Gly Tyr145 150 155 160Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ala Leu165 170 175Ser Ser Ser Ala Thr Leu Gln Asp Ser Leu Ala Ile Lys Asp Gly Asp
180 185190Leu Ala Ser Ser195<210>3<211>196<212>PRT<213>家猫(Felis sivestris)<400>3Met Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Leu Val Leu Leu Thr Cys1 5 10 15Arg Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Ala Leu Pro Gly Ser His Ala Gln20 25 30Val Ser Arg Asp Asn Leu Val Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Arg Ala Arg Lys Asp Phe Arg Phe Pro Arg Glu50 55 60Met Leu Glu Gly Gly Gln Leu Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Val65 70 75 80Leu Arg Glu Leu Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Leu His Thr Glu Arg85 90 95Ser Ser Ala Ala Trp Ser Pro Ala Pro Leu His Gly Leu Arg Ser Gly100 105 110Leu His Arg Gln Leu Glu Ala Leu Asp Ala Cys Leu Leu Gln Ala Thr115 120 125Gly Glu Gly Glu Arg Ala Pro Gly Met His Gly Ser Ala Leu Ala Ile130 135 140Lys Arg Tyr Phe Gln Asp Ile Arg Val Tyr Leu Glu Asp Glu Gly Tyr145 150 155 160Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ala Leu165 170 175Ser Ser Ser Ala Thr Leu Gln Asp Ser Leu Ala Ile Lys Asp Gly Asp
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1.猫ω干扰素，是具有下述猫ω干扰素家族的氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)序列表中的SEQ ID №3；4)序列表中的SEQ ID №4；5)序列表中的SEQ ID №5；6)序列表中的SEQ ID №6；7)序列表中的SEQ ID №7；8)序列表中的SEQ ID №8；9)序列表中的SEQ ID №9；10)序列表中的SEQ ID №10；11)序列表中的SEQ ID №11；12)序列表中的SEQ ID №12；13)序列表中的SEQ ID №13；14)将序列表中SEQ ID №1-13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对猫白血病病毒、FIV以及狗细小病毒具有抗感染作用的蛋白质。
2.编码权利要求1所述猫ω干扰素的基因，选自下述猫ω干扰素家族的核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №14的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №15的DNA序列；3)序列表中SEQ ID №16的DNA序列；4)序列表中SEQ ID №17的DNA序列；5)序列表中SEQ ID №18的DNA序列；6)序列表中SEQ ID №19的DNA序列；7)序列表中SEQ ID №20的DNA序列；8)序列表中SEQ ID №21的DNA序列；9)序列表中SEQ ID №22的DNA序列；10)序列表中SEQ ID №23的DNA序列；11)序列表中SEQ ID №24的DNA序列；12)序列表中SEQ ID №25的DNA序列；13)序列表中SEQ ID №26的DNA序列；17)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №14-26限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；18)编码序列表中SEQ ID №1蛋白的DNA序列；19)编码序列表中SEQ ID №2蛋白的DNA序列；20)编码序列表中SEQ ID №3蛋白的DNA序列；21)编码序列表中SEQ ID №4蛋白的DNA序列；22)编码序列表中SEQ ID №5蛋白的DNA序列；23)编码序列表中SEQ ID №6蛋白的DNA序列；24)编码序列表中SEQ ID №7蛋白的DNA序列；25)编码序列表中SEQ ID №8蛋白的DNA序列；26)编码序列表中SEQ ID №9蛋白的DNA序列；27)编码序列表中SEQ ID №10蛋白的DNA序列；28)编码序列表中SEQ ID №11蛋白的DNA序列；29)编码序列表中SEQ ID №12蛋白的DNA序列；30)编码序列表中SEQ ID №13蛋白的DNA序列；
3.含有权利要求2所述猫ω干扰素编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
4.一种表达权利要求1所述猫ω干扰素的方法，是将含有权利要求2所述猫ω干扰素编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到猫ω干扰素。
5.根据权利要求4所述猫ω干扰素的方法，其特征在于所述用于构建含有权利要求2所述猫ω干扰素编码基因的重组表达载体的出发载体为pLLp-STII、pPICZαA、pET载体系列、pQE载体系列、pPIC9K或pPICZα。
6.根据权利要求5所述猫ω干扰素的方法，其特征在于所述重组表达载体为FeIFN-ω/pLLp-STII。
7.根据权利要求5所述猫ω干扰素的方法，其特征在于所述重组表达载体为FeIFN-ω/pPICZαA。
8.根据权利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述宿主为E.coli DH5α、E.coli TB1、E.coli DE3、酵母菌SMD1168H、酵母菌GS115、酵母菌X-33或酵母菌KM71H。
9.根据权利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述宿主为大肠肝菌时，需加入IPTG进行诱导表达，所加入IPTG的浓度为0.2-1mM；所述宿主为酵母菌时，需加入甲醇进行诱导表达，所加入甲醇的终浓度为0.1-1.0％。
10.权利要求1所述的猫ω干扰素在制备猫白血病病毒、FIV以及狗细小病毒的抗感染药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猫ω干扰素及其编码基因与应用。该猫ω干扰素是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)序列表中的SEQ ID №3；4)序列表中的SEQ ID №4；5)序列表中的SEQID №5；6)序列表中的SEQ ID №6；7)序列表中的SEQ ID №7；8)序列表中的SEQ ID №8；9)序列表中的SEQ ID №9；10)序列表中的SEQ ID №10；11)序列表中的SEQ ID №11；12)序列表中的SEQ ID №12；13)序列表中的SEQ ID №13；14)将序列表中SEQ ID №1－13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对猫白血病病毒、FIV以及狗细小病毒具有抗感染作用的蛋白质。
文档编号A61K38/21GK1730491SQ20051008986
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者刘文军, 杨利敏, 杨帆 申请人:中国科学院微生物研究所