专利名称：高效表达的串联猪α、γ干扰素基因及其表达蛋白的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的基因表达，特别涉及一种串联高效表达的猪α、Υ干扰素，还涉及所述干扰素的编码基因及其表达蛋白的用途。
背景技术：
干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子。IFN可分为两个型(I型和II型)，IFN-α属于I型干扰素，是机体细胞抵抗病毒感染的第一道防线， 具有三大功能抗病毒作用、抗肿瘤作用和免疫调节作用。Lefevre等1990年首先克隆了猪 IFN-α (pIFN-α )基因并将其成熟蛋白基因在大肠杆菌中表达，具有较强的抗病毒活性。 随后国内外学者用大肠杆菌、腺病毒、酵母等表达了 pIFN-α，对其生物学活性进行了大量研究。本课题组也曾将PlFN-α克隆入真核表达载体pVAXl°，转染ΗΕΚ493Α细胞后表达的 PIFN-α 活性较低，仅为 lX106_°U/0. ImL0IFN-Y属于II型干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用。1973年朴叫吐和 Slavin发现来自淋巴细胞培养上清液中存在一种与以往发现的IFN抗原性不同的IFN，命名为II型干扰素。国外研究表明，猪IFN-γ (pIFN-γ )能明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的增殖，在抗猪瘟病毒的细胞免疫中也具有重要作用。国内许多学者用大肠杆菌原核表达系统、真核质粒表达系统、腺病毒系统、毕赤酵母等表达了 PlFN-γ，对其生物学活性进行了大量研究。本课题组也曾将pIFN-γ克隆入真核表达载体pVAXl°，转染ΗΕΚ493Α 细胞后表达的pIFN-γ活性较低，仅为lX105_°U/0. lmL。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，俗称〃猪蓝耳病"，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种能够高效表达的、对高致病性蓝耳病等病毒性疾病有很好防治效果的串联猪α、Y干扰素基因。本发明还提供了所述串联猪α、Y干扰素基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。本发明还提供了所述串联猪α、Y干扰素基因的制备方法。本发明还提供了所述串联猪α、Y干扰素基因的表达蛋白的用途。本发明是通过以下措施实现的
一种高效表达的串联猪α、y干扰素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。一种所述序列2的基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。一种所述的串联猪α、Y干扰素基因的合成方法，包括以下步骤
1、将真核质粒PVAX1°改造为pMVAXl°
由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882，在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入T7启动子序列和feoRI酶切位点，人工合成后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将此段基因序列通过Ai酶切位点插入pVAXl°载体中，转化感受态细菌，提取质粒经筛选得到SstV ^oRI双酶切阳性克隆，命名为pMVAXl° ；
所述 pCMV 即刻早期启动子的一段序列为5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCA TCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 启动子序列为5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，；
2、构建表达pIFN-α/γ的重组真核质粒pMVAXl°-pIFN- α/γ 2.1引物的设计及合成
分别设计一对扩增PlFN-α成熟蛋白和一对扩增pIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特异性引物，引物序列如下
pIFN-α -Fwd :5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3’ pIFN-a -Rev :5’ -CTGGCAGTAAGAGCCACCGCCACCGCCACCCTCCTTCTTCCTGAGT-3’ ρIFN-y-Fwd
5 ’ -ACTCAGGAAGAAGGAGGGTGGCGGTGGCGGTGGCTCTTACTGCCAG-3’ pIFN-y-Rev :5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTATTTTGATGCTCTCTG-3’ ； 2. 2从猪的脾或外周血淋巴细胞中提取RNA，经反转录后得到pIFN- α和pIFN- γ的成熟蛋白基因，分别以所述pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因为模板，以相对应的引物在两管中进行PCR扩增，分别扩增出pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR产物； 2.3 pIFN-a/y融合蛋白基因的扩增
将pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR产物分别胶回收作为下一步PCR反应的模板，PCR过程中生成pIFN-a/γ融合蛋白基因，用引物pIFN-a-Fwd和pIFN-γ-Rev扩增pIFN-α/γ融合蛋白基因，产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，得pIFN-α/γ融合蛋白基因的扩增产物；
2. 4重组真核表达质粒pMVAXl°-pIFN- a/y的构建
用和损ol限制性内切酶双酶切pIFN-a/Y融合蛋白基因的扩增产物，胶回收得到编码pIFN-α/γ成熟蛋白的融合蛋白基因片段1，用和损ol限制性内切酶双酶切质粒pMVAXl°，胶回收得到包含序列1的载体基因片段2，将融合蛋白基因片段1和载体基因片段2连接，转化感受态细菌，培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行feoRI/ZAoI双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，得重组真核表达质粒pMVAXl°-pIFN- a / Y，真核质粒PVAX1°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。步骤2.2 中 PCR反应体系为 25μ 中，含 cDNA lPL，Mg2+ 1. 5mmol/L,dNTP 200Mmol/ L，IOXLA PCR Buffer 2. 5PL，pIFN_ a-Fwd和pIFN-a-Rev各400nmol/L或者pIFN-γ-Fwd 和 pIFN-￥-1^￥各4001111101/1，131^1^ LA Taq 2U ；反应条件为预变性 95°C 5min ；然后进行；35个循环，循环条件为95°C 45s, 62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。步骤2. 3中PCR反应体系为25μ 中，含pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的扩增产物各 1ML，Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ , pIFN-α -Fwd 和 ρIFN- γ -Rev 浓度均为 400nmol/L, TaKaRa LA Taq 2U ；反应条件为预变性 95°C 5min ； 然后进行35个循环，循环条件为95°C 45s, 62°C 45s, 72°C lmin ；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。
步骤2. 2中猪RNA的提取步骤为无菌采集猪的脾脏或者外周血，用淋巴细胞分离液分离脾或者血液淋巴细胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C含CO2 5v%的培养箱中培养 lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA刺激12h后，用TRIzol试剂提取总RNA。所述的高效表达的串联猪α、Y干扰素基因的表达蛋白在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。本发明的有益效果是
(1)用改造过的真核质粒pVAXl°即pMVAXl°表达pIFN-α/γ串联融合蛋白，突破了通过pVAXl°载体表达pIFN-α、pIFN-γ过程中遇到的表达量较低和活性较差的局限性；
(2)体外抗病毒试验证明，本发明构建的pIFN-α/γ表达活性很高，转染Wg pMVAXl°-pIFN- α / γ至ΗΕΚ-293Α细胞的裂解物，用VSV检测IFN的活性单位高达 lX108 °U/0. ImL,当活性在100U以上时能够明显抑制高致病性PRRSV在Marc_145细胞上的增殖，专用于对高致病性PRRSV等病毒性疾病的预防治疗及减少猪场的经济损失。
图1为本发明改造真核质粒pVAXl°为pMVAXl°及克隆pIFN-a/Y融合蛋白基因入 PMVAXl0的示意图，
图2为本发明重组质粒pMVAXl°5^I/^boRI双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2，000 DNA Marker,
1为重组阳性质粒pMVAXl°的5^1/^boRI双酶切结果，
图3为本发明重组质粒pMVAXl°-pIFN-a/Y的feoRI/损ol双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2，000 DNA Marker,
1和2为两个不同重组阳性质粒pMVAXl°-pIFN- α/γ的feoRI/损ol双酶切结果。
具体实施例方式.将真核质粒pVAXl°改造为pMVAXl° 1.1插入基因的人工合成
由 GenBank公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列(GenBank No: V00882)，在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入Τ7启动子序列和 ^coRI酶切位点，所述pCMV即刻早期启动子的一段序列为5’-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTG GAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 启动子序列为 5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，；
将这段基因序列拼接在一起交由TaKaRa公司人工合成，人工合成后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，并将此段基因序列克隆入T载体。1. 2 pMVAXl°的构建及鉴定从T载体上5^1/^boRI双酶切目的基因并胶回收，与同样经过5^1/^boRI双酶切的真核质粒pVAXl°并胶回收的载体片段在16°C过夜连接，转化DH5ci感受态细菌，37°C过夜培养16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中37°C过夜振荡培养，第二天提取质粒， 进行双酶切鉴定。鉴定为阳性的质粒命名为pMVAXl°，交由TaKaRa公司测序， PVAXl0中插入的基因序列与序列表中的序列1相吻合。. pIFN-α/γ融合蛋白的基因克隆入pMVAXl° 2.1引物的设计及合成
根据 GenBank 公布的 pIFN-α 的基因序列(GenBank no. X57191)和 pIFN-γ 的基因序列(GenBank no. DQ839398 )，分别设计一对扩增ρIFN- α成熟蛋白和一对扩增 PIFN- γ成熟蛋白的基因序列的特异性引物pIFN- α -Fwd, ρIFN- α -Rev和pIFN- y -Fwd, PlFN-Y-Rev0在引物pIFN-α-Fwd的5，端引入feoRI酶切位点和Kozak序列；引物 ρIFN- α -Rev和pIFN- y -Fwd的设计按照S0E-PCR的设计原则并在pIFN- α禾口 pIFN- γ的基因序列之间引入5个甘氨酸(Gly)序列作为linker ；在引物pIFN-γ-Rev的5’端引入 Xhol酶切位点，引物序列如下
ρIFN-α -Fwd 5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3 ’ pIFN-α -Rev: 5' -CTGGCAGTAAGAGCCACCGCCACCGCCACCCTCCTTCTTCCTGAGT-3' ρIFN-y-Fwd:5’ -ACTCAGGAAGAAGGAGGGTGGCGGTGGCGGTGGCTCTTACTGCCAG-3， ρIFN-y-Rev: 5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTATTTTGATGCTCTCTG-3’ 两对引物分别横跨pIFN-a和pIFN-γ成熟蛋白编码区，预计扩增片段长度分别为 550bp和490bp左右，引物由TaKaRa公司合成。2. 2猪脾淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取
无菌采集约克猪的脾脏或者外周血，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞或外周血淋巴细胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C 5v%的CO2培养lh。然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA刺激12h后，用TRIzoI试剂提取总RNA，作为RT-PCR的模板。2. 3 RT-PCR 扩增
RNA经Oligo d(T)反转录后得到pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因，以pIFN-a 禾口 pIFN- γ的成熟蛋白基因为模板，分别以pIFN- a -Fwd/pIFN- a -Rev禾口 pIFN- y -Fwd/ pIFN-γ-Rev两对引物在两管中进行PCR扩增，PCR反应体系为25μ 中，含cDNA Ιμ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2. 5μ , ρIFN-a-Fwd 禾口 ρIFN-a-Rev 各 400nmol/L 或者 pIFN-丫-卩胃(1和？正^^-1^￥各400歷01/1，131^1^ LA Taq 2U。反应条件为预变性95°C 5min;然后进行35个循环，循环条件为95°C 45s, 62°C 45s, 72°C Imin ； 然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。这样采用RT-PCR技术分别扩增出了 PlFN-α ^PpIFN-Y的成熟蛋白基因的PCR产物。2. 4 pIFN-α / y融合蛋白基因的扩增
将pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR产物分别胶回收作为下一步PCR反应的模板，PCR过程中生成ρIFN- α / γ融合蛋白基因，用引物ρIFN- α -Fwd和ρIFN- γ -Rev扩增 pIFN-α/γ融合蛋白的基因。PCR反应体系为25PL，含pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白cDNA 模板各 lML，Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2· 5μ ，pIFN-α-Fwd 禾口 pIFN-γ-Rev 的浓度均为 400nmol/L，TaKaRa LA Taq 2U。反应条件为预变性 95°C 5min ；然后进行35个循环，循环条件为95°C 45s, 62°C 45s，72°C lmin ；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收获得PlFN-α / γ融合蛋白基因的PCR产物。 2. 5重组真核表达质粒的构建及鉴定
用和损ο 限制性内切酶双酶切pIFN-α/γ融合蛋白基因的扩增产物，胶回收得到编码pIFN-α/γ成熟蛋白的融合蛋白基因片段1，用和损ol限制性内切酶双酶切质粒pMVAXl°，胶回收得到包含序列1的载体基因片段2，融合蛋白基因片段1和载体基因片段2在16°C过夜连接，转化DH5ci感受态细菌，37°C过夜培养16h。挑取菌落于卡那霉素抗性的LB培养基中37°C过夜振荡培养，第二天提取质粒，进行feoRI/ZAoI双酶切鉴定。 鉴定为阳性的质粒pMVAXl°-pIFN- α / γ交由TaKaRa公司测序。用Vector NTI和DNAStar 软件分析所插入的基因序列和推导氨基酸序列。真核质粒PVAX1°中插入的核苷酸序列如序列表中序列2所示，推导氨基酸序列如序列表中序列3所示。重组真核质粒表达的pIFN-α/γ融合蛋白的抗病毒活性测定 3. 1 重组质粒 pMVAXl°-pIFN- α /y 转染 HEK-293A 细胞
实验组具体操作按Lipofectamine 2000 (Invitrogen)说明书进行。转染在6孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化HEK-293A细胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素)稀释细胞，使其密度达到2. 5 X IO5个细胞/mL，在6孔细胞板上每孔接种2. 5mL,于37°C 5v%的CO2培养箱中培养。在灭菌的1. 5mL的离心管中先加入500μ 37°C预热的OPTI-MEM 无血清培养基，然后加入1. 0μδ的重组质粒pMVAXl°-pIFN- α/γ,轻轻混勻；在另一个灭菌的1. 5mL的离心管中先加入500μ 37°C预热的OPTI-MEM无血清培养基，然后加入2. 5μ Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混勻，在室温放置5min ；然后将两个1. 5mL的离心管中的液体混勻在一起，室温放置20min ；从CO2培养箱中取出细胞板，弃去上清，把混合物轻轻加入到细胞面上，然后立即把细胞板放入CO2培养箱中；温育6h后，吸掉上清，轻轻加入 2. OmL 37°C预热的10%的胎牛血清DMEM，放入CO2培养箱继续培养24h，然后反复冻融细胞转染物2次，12000rpm离心5min，取上清待检。对照组1 将实验组的pMVAXl°-pIFN- α/γ替换为空载体质粒pMVAXl°，其余方法同实验组一致，作为对照。对照组2 将实验组的pMVAXl°-pIFN- α/γ替换为pVAXl°-pIFN_ α，其余方法同实验组一致，作为对照。对照组3 将实验组的pMVAXl°-pIFN- α/γ替换为pVAXl°-pIFN_ γ，其余方法同实验组一致，作为对照。所述pVAXl°-pIFN- α和pVAXl°-pIFN- γ为真核质粒载体pVAXl°中只插入 ρIFN-α 或 pIFN-γ 基因，而不插入 Rabbit β -Globin Intron II 基因。3. 2重组质粒pMVAXl°-pIFN- α/γ表达的融合蛋白抗VSV活性检测
向生长于96孔板上的Marc-145细胞单层分别加入上述实验组、对照组1、对照组2和对照组3得到的倍比维持液稀释的冻融裂解上清，每个稀释度4个孔，于37°C作用24h，吸去上清，每孔接种IOOTCID5ci的VSV，于37°C含C025v%的培养箱中培养。24_36h观察各孔细胞病变，以能抑制50%细胞病变的样品的最高稀释度定义为IFN的1个活性单位(1U)。经检测，1. 0μδ的重组质粒pMVAXl°-pIFN- α/γ转染ΗΕΚ-293Α细胞后的裂解上清中，IFN的活性单位高达1 X 108 °U/0. ImL ；而对照组1空载体质粒pMVAXl°转染HEK-293A细胞后的裂解上清无抗VSV活性；对照组2载体质粒PVAXf-PlFN- α转染ΗΕΚ-293Α细胞后的裂解上清中，IFN的活性单位只有1 X 106_°U/0. ImL ；对照组3载体质粒pVAXl°-pIFN_ γ 转染ΗΕΚ-293Α细胞后的裂解上清中，IFN的活性单位只有1 X 105_°U/0. ImL因此，重组质粒pMVAXl°-pIFN- α/γ表达的IFN活性相比pVAXl°-pIFN- α提高了 100倍，比 pVAXl°-pIFN- γ 提高了 1000 倍。
3. 3重组质粒pMVAXl°-pIFN- α/γ表达的融合蛋白抗高致病性PRRSV活性检测
向生长于96孔板上的Marc-145细胞单层分别加入上述实验组、对照组1、对照组2和对照组3得到的倍比维持液稀释的冻融裂解上清，每个稀释度4个孔，于37°C作用24h， 吸去上清，每孔接种IOOTCID5ci的高致病性PRRSV，于37°C含C025v%的培养箱中培养。3 天后，观察细胞病变情况，对照组1空载体PMVAXf细胞均产生明显的细胞病变；对照组2 pVAXl°-pIFN-a在稀释度为1:104_°以下，对照组3 pVAXl°-pIFN-γ在稀释度为1:103_°以下，而pMVAXr-pIFN-α/γ实验组在稀释度为1: 106_°以下时(稀释度1 106_°即为100U)， 均无细胞病变。说明本发明重组质粒pMVAXl°-pIFN-a/Y表达的IFN具有非常强的抗高致病性PRRSV的作用。ρIFN-α的量为100U(稀释度1: IO6.0即为100U)以上时，对IOOTCID50 的高致病性PRRSV具有明显的抑制效果，可以应用于制备治疗高致病性PRRSV的药物中。
权利要求
1.一种高效表达的串联猪α、Y干扰素基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.—种权利要求1所述序列2的基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。
3.—种权利要求1所述的串联猪α、Y干扰素基因的合成方法，其特征是包括以下步骤3. 1将真核质粒pVAXl°改造为pMVAXl° 由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882，在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入T7启动子序列和feoRI酶切位点，人工合成后的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将此段基因序列通过Ai酶切位点插入pVAXl°载体中，转化感受态细菌，提取质粒经筛选得到SstV ^oRI双酶切阳性克隆，命名为pMVAXl° ；所述 pCMV 即刻早期启动子的一段序列为5，-GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCA TCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3’， 所述 T7 启动子序列为5，-AATACGACTCACTATAGGG-3，； 3. 2构建表达pIFN- α /y的重组真核质粒pMVAXl°-pIFN_ α/γ 3.2.1引物的设计及合成分别设计一对扩增PlFN-α成熟蛋白和一对扩增pIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特异性引物，引物序列如下pIFN-α -Fwd :5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGGCTGCGACCTGCCTCAGA-3’ pIFN-a -Rev :5’ -CTGGCAGTAAGAGCCACCGCCACCGCCACCCTCCTTCTTCCTGAGT-3’ ρIFN-y-Fwd 5 ’ -ACTCAGGAAGAAGGAGGGTGGCGGTGGCGGTGGCTCTTACTGCCAG-3’ pIFN-y-Rev :5’ -GAGCTCGAGAAGCTTATTATTTTGATGCTCTCTG-3’ ； 3. 2. 2从猪的脾或外周血淋巴细胞中提取RNA，经反转录后得到pIFN- α和pIFN- γ的成熟蛋白基因，分别以所述pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因为模板，以相对应的引物在两管中进行PCR扩增，分别扩增出pIFN-a和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR产物； 3.2.3 pIFN-a/y融合蛋白基因的扩增将pIFN-α和pIFN-γ的成熟蛋白基因的PCR产物分别胶回收作为下一步PCR反应的模板，PCR过程中生成pIFN-a/γ融合蛋白基因，用引物pIFN-a-Fwd和pIFN-γ-Rev扩增pIFN-α/γ融合蛋白基因，产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，得pIFN-α/γ融合蛋白基因的扩增产物；3.2. 4重组真核表达质粒pMVAXl°-pIFN- a/y的构建用和损ol限制性内切酶双酶切pIFN-a/Y融合蛋白基因的扩增产物，胶回收得到编码pIFN-α/γ成熟蛋白的融合蛋白基因片段1，用和损ol限制性内切酶双酶切质粒pMVAXl°，胶回收得到包含序列1的载体基因片段2，将融合蛋白基因片段1和载体基因片段2连接，转化感受态细菌，培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行feoRI/ZAoI双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，得重组真核表达质粒pMVAXl°-pIFN- a / Y，真核质粒PVAX1°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于步骤3.2. 2中PCR反应体系为25μ 中，含 cDNA μ , Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, 10XLA PCR Buffer 2. 5μ , pIFN-α -Fwd 和 ρIFN- α -Rev 各 400nmol/L 或者 ρIFN- γ -Fwd 和 ρIFN- γ -Rev 各 400nmol/L, TaKaRa LA Taq 2U ；反应条件为预变性95°C 5min ；然后进行35个循环，循环条件为95°C 45s，62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于步骤3.2. 3中PCR反应体系为25PL 中，含pIFN- α和pIFN- γ的成熟蛋白基因的扩增产物各 μ ，Mg2+ 1. 5mmol/L, dNTP 200Mmol/L, IOXLA PCR Buffer 2· 5μ ，pIFN-α-Fwd 和 pIFN-γ-Rev 浓度均为 400nmol/L， TaKaRa LA Taq 2U ；反应条件为预变性95°C 5min ；然后进行35个循环，循环条件为95°C 45s, 62°C 45s, 72°C Imin ；然后72°C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于步骤3.2. 2中猪RNA的提取步骤为无菌采集猪的脾脏或者外周血，用淋巴细胞分离液分离脾或者血液淋巴细胞，用10%胎牛血清的1640液在37°C含CO2 5v%的培养箱中培养lh，然后加入50(^g/mL的植物血凝素PHA 刺激1 !后，用TRIzoI试剂提取总RNA。
7.—种权利要求1所述的高效表达的串联猪α、Y干扰素基因的表达蛋白在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因表达领域，高效表达的串联猪α、γ干扰素基因核苷酸序列见序列2。序列2的基因克隆至真核表达载体获得的重组质粒。串联猪α、γ干扰素基因的合成方法将Rabbitβ-GlobinIntronII、pCMV即刻早期启动子、T7启动子插入pVAX1 、得到pMVAX1 ，将融合蛋白基因pIFN-α/γ插入pMVAX1 ，得pMVAX1 -pIFN-α/γ。其表达蛋白在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。突破了通过pVAX1 表达pIFN-α、pIFN-γ时表达量低活性差的局限性，活性达1×108.0U/0.1mL，能明显抑制高致病性PRRSV增殖，减少猪场的经济损失。
文档编号A61P31/14GK102212539SQ20111008755
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者丛小燕, 吴家强, 孙文博, 张秀美, 时建立, 李俊, 杜以军, 王金宝, 齐静 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所