专利名称：一种大黄鱼干扰素(ifn)基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种大黄鱼干扰素(IFN)基因全长cDNA序列及其克隆方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
大黄鱼是我国海水网箱养殖量最大的鱼类，年产量7万吨，年产值30多亿元。但是目前大黄鱼的养殖受到多种疾病的严重威胁，其中病毒继发感染是导致鱼类大规模死亡最主要的原因之一。在1957 年就已确认干扰素的作用[Isaacs A, Lindenmann J, 1957. Virus interference. I. The interferon. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 147: 258-267]。但是到2003年才首次从斑马鱼中克隆到第一个鱼类干扰素基因[Altmarm SM, Mellon MT, Distel DL, Kim CH, 2003. Molecular and functional analysis of an interferon gene from the zebrafish, Danio rerio. J Virol. 77: 1992-2002]。干扰素的生物学作用干扰素anterferons)是一类主要由病毒诱导产生的细胞因子，能够诱导鱼类进入抗病毒状态。干扰素系统包括应答外界刺激(如病毒感染)而合成干扰素的细胞和应答干扰素作用而建立抗病毒状态的细胞，是机体防御反应中出现最早的防御系统[Zou J, Secombes CJ, 2011. Teleost fish interferons and their role in immunity, Dev Comp Immunol, doi:10. 1016/j. dci. 2011.07.001, In publish.]。干扰素系统是连接机体非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[Le Bon A, Tough DF. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr Opin Immunol 2002; 14:432-6] 0除了抗病毒作用外，它还具有抗菌功能[Bogdan C. The function of type I interferons in antimicrobial immunity. Curr Opin Immunol 2000;12:419-24.]以及参与其他重要的生理过程，如调节细胞的生长、分化、凋亡以及机体免疫反应等[Maher SGj Romero-Weaver ALj Scarzello AJj Gamero AM. Interferon: cellular executioner or white knight Curr Med Chem 2007;14:1279-89·]。目前在鱼类中发现的干扰素具有重要的抗病毒等疾病、免疫保护等功能[Collet B, Munro ES, Gahlawat S， Acosta F， Garcia J， Roemelt C， et al. 2007. Infectious pancreatic necrosis virus suppresses type I interferon signalling in rainbow trout gonad cell line but not in Atlantic salmon macrophages. Fish Shellfish Immunol. 22: 44-56； Zou J， Secombes CJj 2011. Teleost fish interferons and their role in immunity, Dev Comp Immunol, doi : 10· 1016/j. dci. 2011. 07. 001， In publish ； Robertsen B， 2006. The interferon system of teleost fish. Fish Shellfish Immunol. 20: 172-191.]。但是，目前尚无对大黄鱼干扰素基因的序列信息报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种大黄鱼干扰素(IFN)全长蛋白编码区的cDNA序列及其克隆方法。本发明在大黄鱼疾病防治及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，并为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一种大黄鱼干扰素(IFN)基因，其蛋白编码区的cDNA序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1 碱基序列及SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。一种大黄鱼干扰素(IFN)基因的克隆方法，包括如下步骤
(1)从大黄鱼的肝脏和皮肤组织中提取总RNA；
(2)然后进行cDNA第一链合成；
(3)根据硬骨鱼类IFN的同源片段序列设计引物进行嵌套聚合酶链式PCR反应，以肝脏为模板，得到大黄鱼IFN基因片段，其中正向引物Fl :5' ATGCTCAACAGGATTTTCT 3'， F2 5' GGCTAATAACTCCACTAAC3’，反向引物 Rl :5, TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3' ，R2 5' TGTGTTCTCCTCCCATGA 3'；
(4)又以大黄鱼皮肤组织为模板，用2条基因特异性正向引物3F1 5，ACAGCCAGGCGTCCAAAG 3，，3F2 :5，TCAGGTTCTGGAGGAGGC 3’ 进行大黄鱼 IFN cDNA 3， 端快速扩增(3’ RACE)；
(5)然后以大黄鱼皮肤组织为模板，用2条基因反向引物Rl 5，TCAGCTCCCAGGCTTCAGC3’ R2 :5，TGTGTTCTCCTCCCATGA 3'进行对大黄鱼 IFN cDNA 5'端克隆(5，RACE)。本发明的有益效果为本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3，端cDNA快速扩增(3，- RACE)以及5，端cDNA快速扩增(5，-RACE)的方法，对大黄鱼一种干扰素基因全长cDNA进行了研究，首次从大黄鱼中克隆到了一种干扰素基因全长cDNA序列，用于干扰素基因的重组表达和功能研究。采用本发明中所述方法，能够从大黄鱼肝脏和皮肤中克隆到1种干扰素基因(称为大黄鱼IFN基因)，采用本发明对大黄鱼IFN基因的成功克隆和测序，首次得到了 1种大黄鱼的IFN基因，搞清了它们的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因(所以可以不用以上引物和方法)，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达。通过网上相似性和同源性检索，提示大黄鱼IFN可以激活大黄鱼的免疫反应，在大黄鱼的病害防治中具有广泛的应用价值。采用本发明使通过重组表达，生产重组表达大黄鱼IFN的重组蛋白药物，环境友好，无污染。在大黄鱼疾病防治及进一步开发为海水鱼类医药产品方面具有良好应用前；同时，可以以此为基础，筛选与抗病相关的单个苷酸多态性(SNP)，为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。
具体实施例方式实施例1
本实施例的一种克隆的大黄鱼干扰素基因，具有序列表中SEQ ID NO. 1碱基序列。(1) SEQ ID NO 1的信息(参见序列表) (a)序列特征
*长度:878碱基对*类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA
(c)假设否
(d)反义否
(e )最初来源大黄鱼 iLarimich thys crocea )。本实施例的一种克隆的大黄鱼干扰素基因，具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列
(2) SEQ ID NO. 2的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度185氨基酸 *类型氨基酸 *链型单链 *拓扑结构线性
(b)分子类型蛋白质
其中大黄鱼干扰素基因的克隆方法为
1.总RNA提取用手术剪刀解剖活的大黄鱼，取其肝脏、皮肤，迅速放到RNA保护液(百泰克)中，样品保存按照产品说明书进行，保存的样品用于RNA的提取。总RNA的提取使用 Invitrogen (中国，上海)生物公司的Trizol RNA提取试剂，提取方法参照使用说明书。2. cDNA 第一链合成据 Ferments life sience 公司 RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒说明书进行。3.大黄鱼干扰素基因cDNA片段克隆
(1)根据GenBank中报道的鱼类干扰素的保守序列设计引物，用于PCR扩增，得到大黄鱼干扰素基因片段。2 条正向引物 Fl: 5' ATGCTCAACAGGATTTTCT3’，F2 :5’ GGCTAATAACTCCACTAAC 3，，2 条反向引物 Rl :5，TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3，，R2 :5，TGTGTTCTCCTCCCATGA 3，。聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件
10 χ PCR 缓冲液(Mg2+浓度为 15 mM) 2μ 1 (TaKaRa,大连) 模板大黄鱼肝脏cDNA1 μ 1
正向引物(ΙΟμΜ) (Fl 5’ ATGCTCAACAGGATTTTCT3’ ) 1 μ 1 反向引物(ΙΟμΜ) (R1 5 TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3 ) 1 μ 1 脱氧核苷酸混合物(dNTP，2. 5mM)1.6μ 1 (TaKaRa,大连)
DNA 聚合酶(5U/ μ L)0· 2 μ 1 (TaKaRa,大连)
灭菌水13. 2 μ 1
PCR反应程序为94°C预变性:3min，然后进入下列循环94 °C 45s, 50 °C 30s, 72 °C 50s (30个循环)；72°C 8min ；上述PCR程序反应结束后，在20 μ L PCR反应体系中，模板更换为入1 :10稀释的首轮PCR扩增产物1 μ L，引物更换为IFN F2(10yM) (5’ GGCTAATAACTCCACTAAC 3’，)禾口 IFN R2(10yM) (5，TGTGTTCTCCTCCCATGA 3’)各 1 μ L，进行第二轮PCR扩增，退火温度由50°C更换为52°C，其他反应条件同前，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。(2)反应产物纯化利用上海生工生物工程有限公司产品(DNA UNIQ-10柱式DNA 胶回收试剂盒)，操作步骤按产品说明书进行。(3)基因片段的克隆纯化的PCR产物与pMD 19_T载体(宝生物工程(大连)有限公司)连接，转化TOP 10 (天根公司)菌株，进行氨苄抗性筛选，挑取单克隆扩增培养后，以 1 μ L菌液PCR为模板，以F2、R2为引物做PCR检测，重复上述PCR条件，扩增后琼脂糖电泳检测，确认插入片段大小后进行测序。4.大黄鱼 IFN cDNA 3，端快速扩增(3，一 RACE)
根据得到的大黄鱼IFN基因片段序列，又设计2条特异性正向引物 3F1:5，ACAGCCAGGCGTCCAAAG 3'，3F2:5' TCAGGTTCTGGAGGAGGC,及通用引物 A0LP: 5，GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)^ 3，禾口 AP: 5，GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3 讲行 cDNA 3，端快速扩增，PCR反应的试剂与条件为
10 χ PCR 缓冲液(Mg2+浓度为 15mM) 2μ 1 (TaKaRa,大连) 模板皮肤cDNA1 μ 1
正向引物 3F1 (ΙΟμΜ)0. 5μ 1
反向引物 AOLP (10 μ Μ)0. 5μ 1
脱氧核苷酸混合物(dNTP，2. 5mM)1.6μ1 (TaKaRa,大连)
DNA 聚合酶(5U/ μ L)0· 2 μ 1 (TaKaRa,大连)
灭菌水14. 2 μ 1
PCR 反应条件为94°C 变性:3min ；94°C 变性 45s ；56°C 退火 30s ；72°C 延伸 30s ；30 个循环；最后72°C延伸8min。PCR第一轮扩增后，在20 μ L PCR反应体系中，模板更换为1:10稀释的首轮PCR扩增产物lyL，引物更换为基因特异性引物IFN 3F2 (5’ TCAGGTTCTGGAGGAGGC 3')和锚定引物 AP (5’ GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3’)各 0. 5 μ L，进行第二轮PCR扩增，退火温度改为58 °C，其它反应条件同前。5.大黄鱼 IFN cDNA 5，端快速扩增(5，一 RACE) (1)第一链cDNA合成
以从大黄鱼皮肤组织提取的RNA为模板，用Oligo (dT) 18为引物进行反转录得到第一链cDNA，采用TaKaRa逆转录试剂盒进行(TaKaRa,大连)。反应体系如下0. 1 — 5 μ g RNA, 1 μ L Oligo (dT) 18 Primer (0· 5 μ g/ μ L)，加入无 RNase 的水补足到 12 μ L，混勻，简单离心，65°C下水浴5min，取出立即冰上放置。然后按照顺序加入如下反应体系， 5 X反应缓冲液4 μ 1
Ribolock RNase 抑制剂(20U/μ 1，Fermentas, MBI) 1 μ 1 dNTP mix (IOmM)2 μ 1
RevertAid M-Mulv 反转录酶(200υ/μ 1)1 μ 1
混勻离心，42°C保温60min，最后70°C保温5min终止反应。(2 ) cDNA第一链的纯化
采用TaKaRa DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa，大连)，按照试剂盒操作说明进行。(3)加尾合成的cDNA经DNA纯化试剂盒(TaKaRa，大连)纯化后，用末端转移酶(TdT， Fermentas)在新合成的cDNA末端加上poly C尾。(3)第一轮 PCR 扩增
以加尾的 dC-cDNA 为樽板，用接头引物 AAP(5，GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG 3') 和基因特异性引物IFN Rl(5’ TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3’),扩增序列的5’末端。20 yL反应体系中包括10XPCR buffer (Mg2+浓度为 15 mM) 2 μ LCTaKaRa,大连)，dNTP (2. 5mM) 1.6 μ L(TaKaR￡i，大连)，正向引物MP (10 μ Μ) 0.5 μ L，反向引物 Rl (10 μ Μ) 0.5 μ L， 模板(cDNA 3，端加尾产物)1 UL, Taq酶(5 U/μ L) 0.2 μ L (TaKaRa,大连)，灭菌双蒸水 14. 2μ L。PCR 反应条件94°C 3 min ;94°C 45 s ；55°C 30 s ；72°C 40s ;30 个循环；最后 720C 8 min。(3)半巢式PCR扩增
PCR第一轮扩增后，在20 PL PCR反应体系中，加入1 μ L首轮PCR扩增产物，基因特异性引物IFN R2(5’ TGTGTTCTCCTCCCATGA 3，)和通用引物AP各0. 5 yL，进行第二轮PCR 扩增，退火温度改为53°C，72°C延伸改为40s，其它反应条件同前。(4)反应产物纯化、克隆和测序同前。大黄鱼IFN cDNA序列验证根据拼接得到的大黄鱼IFN cDNA全序列的5，和3， 端特异性序列，设计1对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。通过网上相似性和同源性检索，提示大黄鱼IFN与其他鱼类的IFN的序列相似性较高。大黄鱼IFN cDNA可以编码185个氨基酸的蛋白质，预测分子量为20. 94kDa，等电点为6. 35，酸性蛋白质。应用SMART在线分析软件预测含有20个氨基酸的信号肽，预测其成熟肽等电点为6. 20，分子量18. SlkDa0氨基酸序列用SMART软件分析发现该蛋白具有一个结构域，为I型干扰素同源区(IFabd domain)，从60到171个氨基酸。大黄鱼的IFN在不同组织中可以受病毒模式分子polyI:C、副溶血弧菌、LPS等激活，被激活后，可以激发产生抗病毒、抗菌反应，在大黄鱼疾病防治、鱼药受体方面及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，并以此为基础，筛选抗病分子标记，在为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。
权利要求
1.一种大黄鱼干扰素基因，其特征在于其蛋白编码区的CDNA序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1碱基序列及SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.一种如权利要求1所述的大黄鱼干扰素基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤(1)从大黄鱼的肝脏和皮肤组织中提取总RNA；(2)然后进行cDNA第一链合成；(3)根据硬骨鱼类IFN的同源片段序列设计引物进行嵌套聚合酶链式PCR反应，得到大黄鱼IFN基因片段，其中正向引物Fl :5，ATGCTCAACAGGATTTTCT 3’， F2 5 GGCTAATAACTCCACTAAC 3，，反向引物 Rl 5 TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3 , R2 5， TGTGTTCTCCTCCCATGA 3，；(4)又用2 条基因特异件 ιΗ 向引物 3F1 :5’ ACAGCCAGGCGTCCAAAG 3’ , 3F2 :5’ TCAGGTTCTGGAGGAGGC 3’ 进行大黄鱼 IFN cDNA 3’ 端快速扩增(3’ RACE)；(5)然后用2 条基因反向引物 Rl 5’ TCAGCTCCCAGGCTTCAGC3 ’ R2 5’ TGTGTTCTCCTCCCATGA 3’ 进行对大黄鱼 IFN cDNA 5’ 端克隆(5’ RACE)。
全文摘要
本发明公开一种大黄鱼干扰素基因，其特征在于其蛋白编码区的cDNA序列，具有序列表中SEQIDNO.1碱基序列及SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；及其克隆方法。本发明在大黄鱼病害防治及进一步开发为生物渔药产品方面具有良好应用前景，在为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。
文档编号C12N15/20GK102559695SQ201110363640
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者姚翠鸾, 李婵, 王志勇 申请人:集美大学