专利名称：一种牛干扰素-α多肽基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牛干扰素-Ol基因。
背景技术：
干扰素(interferon.IFN)最早是由英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年 发现。1980年国际干扰素命名委员会正式将其定名为interferon,简写为IFN。 牛基因工程干扰素-(x的研究始于上世纪80年代中期，1985年Velan等最先以 人干扰素-a基因为探针从牛的cDNA文库中克隆了牛干扰素-(x基因，目前为 止已克隆并测序了 8个牛干扰素-cx基因亚型。重组牛干扰素-a的体外表达具 有抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、呼吸道合胞体病毒、 副流感以及非洲猪瘟等多种病毒的作用，因此需要将牛干扰素-(X转入原核表达 体系进行表达(大肠杆菌是最为常用和最普遍的原核表达体系)。但由于牛干 扰素-a基因属于真核基因，所以在原核表达体系(如大肠杆菌)内存在低表达 和构建表达载体后转录的mRNA翻译活性低的问题，所以限制了牛干扰素-a 在实际畜牧生产中的应用和推广。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前牛干扰素-ot基因在原核表达体系(如大肠杆 菌)内存在低表达和构建表达载体后转录的mRNA翻译活性低的问题，而提 供的一种牛干扰素-(x多肽基因。
本发明牛干扰素-a多肽基因序列如SEQIDNO: 1所示。本发明木糖还原 酶基因序全长516bp， 7bp处有起始密码子ATG， 508bp处有终止密码子TAA， 有504bp完整的开放阅读框。
本发明牛干扰素-a多肽基因所编码的氨基酸序列与天然的牛干扰素-(x多 肽相同，但本发明牛干扰素-a多肽基因序列中43bp 48bp处的碱基为 "CGTCGC"(此处天然牛干扰素-a多肽基因碱基为"AGGAGG")， 73bp 78bp 处的碱基为"CGTCGC"(此处天然牛干扰素-a多肽基因碱基为"AGAAGG")， 106bp 108bp处的碱基为"CGC"(此处天然牛干扰素-oc多肽基因碱基为"AGA")， 262bp 264bp处的碱基为"CTG"(此处天然牛干扰素-a多肽基 因碱基为"CTA")， 370bp 372bp处的碱基为"CGC"(此处天然牛干扰素-a 多肽基因碱基为"AGG")， 385bp 387bp处的碱基为"CGT"(此处天然牛 干扰素-a多肽基因碱基为"AGA")， 412bp 414bp处的碱基为"CGC"(此 处天然牛干扰素-a多肽基因碱基为"AGA")， 442bp 444bp处的碱基为"CGC"
(此处天然牛干扰素-a多肽基因碱基为"AGA")， 457bp 459bp处的碱基为
"CGC"(此处天然牛干扰素-a多肽基因碱基为"AGA")， 496bp 501bp处 的碱基为"CGTCGC"(此处天然牛干扰素-(x多肽基因碱基为"AGGAGA")。 本发明利用原核表达系统(大肠杆菌)优势表达基因(偏爱密码子)对牛 干扰素-a多肽基因进行基因改造；由于密码子的改变本发明的牛干扰素-a多 肽基因的密码子及密码子对均为优势密码子和密码子对，所以本发明的牛干扰 素-(x多肽基因在大肠杆菌中的蛋白表达量明显提高，密码子分析结果如图2、 11、 12、 13和14所示，明显强于天然牛干扰素-a多肽基因(如图1、 7、 8、 9 和10所示)，因此本发明牛干扰素-(x多肽基因可以在原核表达系统(大肠杆菌) 中高效表达牛干扰素-a成熟多肽。
本发明的牛干扰素-a多肽基因的5'端自由能图如图3所示，天然牛干扰 素-(x多肽基因的5'端自由能图如图4所示，本发明的牛干扰素-a多肽基因的3' 端自由能图如图5所示，天然牛千扰素-a多肽基因的3'端自由能图如图6所 示；经RNAstructure (Version 4.3)软件分析本发明牛干扰素-a多肽基因5，端
自由能高于天然牛干扰素-a多肽基因，而且在本发明牛干扰素-oi多肽基因翻 译起始区周围的序列不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件易被核糖体 识别和结合，所以本发明的牛干扰素-a多肽基因转录后mRNA的二级结构明 显优于天然牛干扰素-a多肽基因，提高牛干扰素-a的mRNA翻译活性。
本发明所比对用天然牛干扰素-a多肽基因与天然牛干扰素-oiA型基因同 源，相似性大于99%。
图1是天然牛干扰素-a多肽基因在大肠杆菌中密码子分析结果图，图2 是本发明牛干扰素-a多肽基因在大肠杆菌中密码子分析结果图，图3是本发明 牛干扰素-a多肽基因的5'端自由能图，图4是天然牛干扰素-a多肽基因的5，端自由能图，图5是本发明牛干扰素-ot多肽基因的3'端自由能图，图6是天 然牛干扰素-a多肽基因的3，端自由能图，图7是图1中A部放大图，图8是 图1中B部放大图，图9是图1中C部放大图，图IO是图1中D部放大图， 图11是图2中E部放大图，图11是图2中F部放大图，图11是图2中G部 放大图，图11是图2中H部放大图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式牛干扰素-a多肽基因序列如下所示
AAAGCTTTCGTCGC AAAG ATTAAGTCGAC 。
本实施方式牛干扰素-(x多肽基因序列由上海生工生物工程技术服务有限 公司合成。
本实施方式中借助DNAstar软件推导基因的氨基酸序列，并根据氨基酸序 列借助http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html在线密码子分析工具推导大肠 杆菌优势表达的基因序列。
本实施方式用RNAstmcture (Version 4.3)软件设计基因5'末端及3，末端 自由能值，提高牛干扰素-a多肽基因的mRNA的5，端自由能值，使得核糖体 结合位点区域二级结构简单；并降低3，端自由能，使得3，端结构稳定性提高， 延长mRNA在体内的半衰期。
将本实施方式牛干扰素-a多肽基因转入原核无毒基因编码物种特异性抗 性表达载体(pWL载体)，然后在大肠杆菌DH5ci中进行非融合表达，通过SDS-PAGE鉴定产物表达量。检测结果显示本实施方式牛干扰素-a多肽基因在 大肠杆菌中进行了高效表达，蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上(而天然的 牛干扰素-a多肽基因连接到pWL载体中在大肠杆菌中则基本不表达)，说明 了本实施方式牛干扰素-a多肽基因可以在大肠杆菌表达体系内高效表达。序列表
<110>东北农业大学
<120> —种牛干扰素-a多肽基因
<160>2
<210> 1 <211>516 <212> DNA <213>人工序列
<220> <221> CDS <222〉 (7)…(508)
<220>
<223>牛干扰素-ot多肽基因 〈400〉 1
gaattc atg tgc cat ctg ccg cat acc cat age ctg gcg aac cgt cgc gtg 51 Met Cys His Leu Pro His Thr His Ser Leu Ala Asn Arg Arg Val 15 10 15
ctg atg ctg ctg cag cag ctg cgt cgc gtg age ccg age age tgc ctg 99 Leu Met Leu Leu Gin Gin Leu Arg Arg Val Ser Pro Ser Ser Cys Leu
20 25 30
cag gat cgc aac gat ttt gaa ttt ctg cag gaa gcg ctg ggc ggt age 147 Gin Asp Arg Asn Asp Phe Glu Phe Leu Gin Glu Ala Leu Gly Gly Ser
35 40 45
cag ctg cag aaa gcg cag gcg att age gtg ctg cat gaa gtg acc cag 195 Gin Leu Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Val Thr Gin 50 55 60cat acc His Thr
65 3肪a_gc lys Ser 80
g3t Ctg
Asp Leu
ctg ctg Leu Leu
ctg acg Leu Thr
gtg gtg Val Val 145 cag gaa Gin Glu 160
ttt Phe
ctg Leu
C3g
Gin
ctg Leu
cag gcg Gin Ala
Lys
ctg Leu 130 cgc Arg
gaa Glu 115 tat Tyr
gcg Ala
age ttt Ser Phe
ctg ttt Leu Phe
gst aaa Asp Lys
85 tgc ctg Cys Leu 100
gat age Asp Ser
ctg cag Leu Gin
gaa gtg Glu Val
cgt cgc Arg Arg 165
age
Ser
70
ctg
Leu
3CC
Thr
Ser
g朋 Glu
atg Met 150 aaa Lys
a_cc Thr
cgc Arg
c缚 Gin
ctg Leu
a&a Lys 135 cgc Arg
gat Asp
g朋 Glu
gcg Ala
Glu
gcg Ala 120 cgc Arg
gcg Ala
ggc Gly
gcg Ala
g朋 Glu 105 gtg Val
cat His
Phe
age Ser
ctg
Leu
90
ggc
Gly
cgc Arg
age Ser
ccg
Pro
75
gat
Asp
ctg Leu
aaa Lys
ccg Pro
gcg acc tgg gat 243 Ala Thr Trp Asp
age Ser
age Ser 155 gtcgac 516
cag cag Gin Gin
cgc ggc Arg Gly
tat Tyr
tgc Cys 140 昭c Ser
ttt Phe 125 gcg Ala
acc Thr
ctg Leu
gcg Ala 110
cat His
acc 291
Thr
95
ccg 339 Pro
cgt 387 Arg
tgg gaa 435 Trp Glu
aac ctg 483 Asn Leu
<210>2 <211> 167 <212> PRT <213〉人工序列
〈400〉 2
Met Cys His丄eu Pro His Thr His Ser Leu Ala Asn Arg Arg Val Leu 15 10 15
Met Leu Leu Gin Gin Leu Arg Arg Val Ser Pro Ser Ser Cys Leu Gin 20 25 30Asp Arg Asn Asp Phe Glu Phe Leu Gin Glu Ala Leu'Gly Gly Ser Gin
35 40 45
Leu Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Val Thr Gin His
50 55 60
Thr Phe Gin Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Pro Alei Thr Trp Asp Lys 65 70 75 80
Ser Leu Leu Asp Lys Leu Arg Ala Ala Leu Asp Gin Gin Leu Thr Asp
85 90 95
Leu Gin Ala Cys Leu Thr Gin Glu Glu Gly Leu Arg Gly Ala Pro Leu
100 105 110
Leu Lys Glu Asp Ser Ser Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu
115 120 125
Thr Leu Tyr Leu Gin Glu Lys Arg His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
130 135 140
Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gin 145 150 155 160
Glu Ser Phe Arg Arg Lys Asp 16权利要求
1、一种牛干扰素-α多肽基因，其特征在于牛干扰素-α多肽基因序列如下所示GAATTCATGTGCCATCTGCCGCATACCCATAGCCTGGCGAACCGTCGCGTGCTGATGCTGCTGCAGCAGCTGCGTCGCGTGAGCCCGAGCAGCTGCCTGCAGGATCGCAACGATTTTGAATTTCTGCAGGAAGCGCTGGGCGGTAGCCAGCTGCAGAAAGCGCAGGCGATTAGCGTGCTGCATGAAGTGACCCAGCATACCTTTCAGCTGTTTAGCACCGAAGGCAGCCCGGCGACCTGGGATAAAAGCCTGCTGGATAAACTGCGCGCGGCGCTGGATCAGCAGCTGACCGATCTGCAGGCGTGCCTGACCCAGGAAGAAGGCCTGCGCGGCGCGCCGCTGCTGAAAGAAGATAGCAGCCTGGCGGTGCGCAAATATTTTCATCGTCTGACGCTGTATCTGCAGGAAAAACGCCATAGCCCGTGCGCGTGGGAAGTGGTGCGCGCGGAAGTGATGCGCGCGTTTAGCAGCAGCACCAACCTGCAGGAAAGCTTTCGTCGCAAAGATTAAGTCGAC。
全文摘要
一种牛干扰素-α多肽基因，它涉及一种牛干扰素-α基因。它解决了目前牛干扰素-α基因在原核表达体系内存在低表达和构建表达载体后转录的mRNA翻译活性低的问题。本发明牛干扰素-α多肽基因序列如SEQ ID NO1所示。本发明木糖还原酶基因序全长516bp，7bp处有起始密码子ATG，508bp处有终止密码子TAA，有504bp完整的开放阅读框。本发明牛干扰素-α多肽基因可以在原核表达系统中高效表达牛干扰素-α成熟多肽。本发明的牛干扰素-α多肽基因转录后mRNA的二级结构明显优于天然牛干扰素-α多肽基因，提高牛干扰素-α的mRNA翻译活性。
文档编号C12N15/21GK101591659SQ200810064638
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者孙仰峰, 勐 李, 李文辉, 王君伟 申请人:东北农业大学