专利名称：一种除硫脱氮自养菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种自养菌的筛选方法。
技术背景生物脱硫工艺因去除率高、无需投加化学药剂、可生成单质硫回收等优点而日益受到关注，其中硫杆菌属(77^6mz7/w)是一类具有除硫脱氮功能的微 生物，他们可以通过氧化硫化合物获得能量，同时还可以将硝酸盐作为电子受 体将其还原为氮气，整个除硫脱氮过程中不需要外加有机碳源，且可通过控制 适宜的生态条件，得到最大化的单质硫转化率，实现单质硫的回收，是一类有 重要意义的工程菌。目前，分离除硫脱氮自养菌菌株都是采用平板划线法，但由于除硫脱氮自 养菌的生长非常缓慢，时代时间较长，较难在培养基上获得生长好的单菌落， 且采用平板划线法时，培养基的存放条件需要保持厌氧条件，这样也使得在分 离纯菌的过程变得更加复杂，增加了获得纯培养的难度。发明内容本发明目的是为了解决现有分离除硫脱氮自养菌的方法复杂、所得单菌落 生长不好的问题，而提供一种除硫脱氮自养菌的筛选方法。一种除硫脱氮自养菌的筛选方法按以下步骤实现 一、取样品菌悬液接种于除硫脱氮自养菌液体培养基中，在26 3(TC、 140 180r/min的条件下进行 分离扩大培养，培养期为14d; 二、取分离扩大培养后的菌悬液接种于固体分 离培养基上，浇盖培养基制成厌氧夹层培养基，在26 3(TC的条件下恒温培 养至培养基夹层中出现气泡；三、挑取气泡内的单菌落，转接于除硫脱氮自养 菌液体培养基中，在26 3(TC的条件下恒温扩大培养至培养基出现混浊；四、 挑取培养基中的菌液接种于固体分离培养基上，在26 3(TC的条件下恒温培 养至有单菌落长成，然后挑取单菌落转接于除硫脱氮自养菌液体培养基中；五、 重复步骤二、三和四至分离出单菌落，即为除硫脱氮自养菌；其中步骤一、三 和四中所用除硫脱氮自养菌液体培养基相同，每升除硫脱氮自养菌液体培养基均是由5.0g的Na2S203'5H20、 l.Og的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的 MgSO4'7H2O、3.0g的NaHC03、3.5g的KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnS04、 55.0ug的CaCl2、 50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024'4H20、 15.7ug 的CuS04*5H20、 16.1ug的CoCl2，6H20、 lmL的维生素液和余量的蒸馏水组成， 除硫脱氮自养菌液体培养基pH值为7.0;步骤二和四中所用固体分离培养基 相同，每升除硫脱氮自养菌固体体培养基均是由5.0g的Na2S203*5H20、 l.Og 的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的MgS04.7H20、 3.0g的NaHCO3、 3.5g的 KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2'4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024'4H20、 15.7ug的CuS04.5H20、 16.1ug的CoCl2.6H20、 lmL的维生素液、20g的琼脂和余量的蒸馏水组成，除硫脱氮自养菌液体培养 基pH值为7.0。本发明采用厌氧夹层法筛选除硫脱氮自养菌，厌氧夹层可以保持微量氧的 缺氧状态，这样更适合除硫脱氮自养菌在培养基上更快更好的长出单菌落，厌 氧夹层法不需要在严格厌氧条件下存放，放到室内环境即可，这样也简化了实 验操作程序，增加了分离方法的适用性，在夹层培养基上还可以看到菌落的产 气情况，因此可以判断哪些单菌落是需要分离的除硫脱氮自养菌落，同时也提 高了菌种筛选的效率。
图1是具体实施方式
五中筛选所得除硫脱氮自养菌的透射电镜图。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式一种除硫脱氮自养菌的筛选方法按以下步骤 实现 一、取样品菌悬液接种于除硫脱氮自养菌液体培养基中，在26 3(TC、 140 180r/min的条件下进行分离扩大培养，培养期为14d; 二、取分离扩大 培养后的菌悬液接种于固体分离培养基上，浇盖培养基制成厌氧夹层培养基， 在26 30。C的条件下恒温培养至培养基夹层中出现气泡；三、挑取气泡内的 单菌落，转接于除硫脱氮自养菌液体培养基中，在26 3(TC的条件下恒温扩 大培养至培养基出现混浊；四、挑取培养基中的菌液接种于固体分离培养基上， 在26 3(TC的条件下恒温培养至有单菌落长成，然后挑取单菌落转接于除硫 脱氮自养 菌液体培养基中；五、重复步骤二、三和四至分离出单菌落，即为除硫脱氮自养菌；其中步骤一、三和四中所用除硫脱氮自养菌液体培养基相同， 每升除硫脱氮自养菌液体培养基均是由5.0g的Na2S2Oy5H20、 l.Og的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的lv[gS04'7H20、 3.0g的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg 的EDTA、 22.0ug的ZnS04、 55.0ug的CaCl2、 50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug 的(NH4)6Mo024'4H20、 15.7ug的CuS(V5H20、 16.1ug的CoCl2'6H20、 lmL的 维生素液和余量的蒸馏水组成，除硫脱氮自养菌液体培养基pH值为7.0;步骤二和四中所用固体分离培养基相同，每升除硫脱氮自养菌固体体培养基均是由5.0g的Na2S203.5H20、 1 .Og的NH4Cl、2.Og的Na2HP04、0.8g的MgS04.7H20、 3.0g的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg的EDTA、 22.0ug的ZnS04、 55.0ug 的CaCl2、 50.6ug的MnCl2,4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024.4H20、 15.7ug的 CuS(V5H20、 16.1ug的CoCl2*6H20、 lmL的维生素液、20g的琼脂和余量的 蒸馏水组成，除硫脱氮自养菌液体培养基pH值为7.0。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中样品菌 悬液制备将采集菌胶团或土壤颗粒放入灭菌的锥形瓶中，加入无菌水稀释， 加入玻璃珠20 25个，以220r/min振荡24h。其它步骤及参数与具体实施方 式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中在28 °C、 160r/min的条件下进行分离扩大培养。其它步骤及参数与具体实施方式
一 相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中浇盖温 度为45 5(TC。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式一种除硫脱氮自养菌的筛选方法按以下步骤 实现 一、取样品菌悬液接种于除硫脱氮自养菌液体培养基中，在28°C、 160r/min的条件下进行分离扩大培养，培养期为14d; 二、取分离扩大培养后 的菌悬液接种于固体分离培养基上，浇盖培养基制成厌氧夹层培养基，在28T: 的条件下恒温培养至培养基夹层中出现气泡；三、挑取气泡内的单菌落，转接 于除硫脱氮自养菌液体培养基中，在28'C的条件下恒温扩大培养至培养基出 现混浊；四、挑取培养基中的菌液接种于固体分离培养基上，在28t的条件 下恒温培养至有单菌落长成，然后挑取单菌落转接于除硫脱氮自养菌液体培养基中；五、重复步骤二、三和四至分离出单菌落，即为除硫脱氮自养菌；其中 步骤一、三和四中所用除硫脱氮自养菌液体培养基相同，每升除硫脱氮自养菌 液体培养基均是由5.0g的Na2S203'5H20、 l.Og的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的MgS04,7H20、 3.0g的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg的EDTA、 22.0ug 的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug的(1^)6]^0024'4 120、 15.7ug的CuS04'5H20、 16.1ug的CoCl2'6H20、 ImL的维生素液和余量的蒸馏 水组成，除硫脱氮自养菌液体培养基pH值为7.0;步骤二和四中所用固体分 离培养基相同，每升除硫脱氮自养菌固体体培养基均是由5.0g的 Na2S203'5H20、 LOg的NH4Cl、 2.0g的Na2HP04、 0.8g的MgS04.7H20、 3.0g 的NaHC03、 3.5g的KN03、 0.5mg的EDTA、 22.0ug的ZnS04、 55.0ug的CaCl2、 50.6ug的MnCl2.4H20、 ll.Oug的(NH4)6Mo024.4H20、 15.7ug的CuS04.5H20、 16.1ug的CoCl2《H20、 lmL的维生素液、20g的琼脂和余量的蒸馏水组成，除 硫脱氮自养菌液体培养基pH值为7.0。本实施方式筛选得到的除硫脱氮自养菌，革兰氏染色阴性，菌株的形态由 图1所示，细胞呈杆状，单个、成对或短链状排列，具有单根极生鞭毛，无芽 孢，菌体大小为(0.3 0.5pm)x(10 15Mm)，对其进行的生理生化特性及其除硫 脱氮能力的鉴定，确定筛选得到的菌株是除硫脱氮自养菌。
权利要求
1、一种除硫脱氮自养菌的筛选方法，其特征在于除硫脱氮自养菌的筛选方法按以下步骤实现一、取样品菌悬液接种于除硫脱氮自养菌液体培养基中，在26～30℃、140～180r/min的条件下进行分离扩大培养，培养期为14d；二、取分离扩大培养后的菌悬液接种于固体分离培养基上，浇盖培养基制成厌氧夹层培养基，在26～30℃的条件下恒温培养至培养基夹层中出现气泡；三、挑取气泡内的单菌落，转接于除硫脱氮自养菌液体培养基中，在26～30℃的条件下恒温扩大培养至培养基出现混浊；四、挑取培养基中的菌液接种于固体分离培养基上，在26～30℃的条件下恒温培养至有单菌落长成，然后挑取单菌落转接于除硫脱氮自养菌液体培养基中；五、重复步骤二、三和四至分离出单菌落，即为除硫脱氮自养菌；其中步骤一、三和四中所用除硫脱氮自养菌液体培养基相同，每升除硫脱氮自养菌液体培养基均是由5.0g的Na2S2O3·5H2O、1.0g的NH4Cl、2.0g的Na2HPO4、0.8g的MgSO4·7H2O、3.0g的NaHCO3、3.5g的KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2·4H2O、11.0ug的(NH4)6MoO24·4H2O、15.7ug的CuSO4·5H2O、16.1ug的CoCl2·6H2O、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，除硫脱氮自养菌液体培养基pH值为7.0；步骤二和四中所用固体分离培养基相同，每升除硫脱氮自养菌固体体培养基均是由5.0g的Na2S2O3·5H2O、1.0g的NH4Cl、2.0g的Na2HPO4、0.8g的MgSO4·7H2O、3.0g的NaHCO3、3.5g的KNO3、0.5mg的EDTA、22.0ug的ZnSO4、55.0ug的CaCl2、50.6ug的MnCl2·4H2O、11.0ug的(NH4)6MoO24·4H2O、15.7ug的CuSO4·5H2O、16.1ug的CoCl2·6H2O、1mL的维生素液、20g的琼脂和余量的蒸馏水组成，除硫脱氮自养菌液体培养基pH值为7.0。
2、 根据权利要求1所述的一种除硫脱氮自养菌的筛选方法，其特征在于 步骤一中样品菌悬液制备将采集的菌胶团或土壤颗粒放入灭菌的锥形瓶中， 加入无菌水稀释，加入玻璃珠20 25个，以220r/min振荡24h。
3、 根据权利要求1所述的一种除硫脱氮自养菌的筛选方法，其特征在于 步骤一中在28°C、 160r/min的条件下进行分离扩大培养。
4、 根据权利要求l所述的一种除硫脱氮自养菌的筛选方法，其特征在于 步骤二中浇盖温度为45 50°C。
全文摘要
一种除硫脱氮自养菌的筛选方法，它涉及一种自养菌的筛选方法。它解决了现有分离除硫脱氮自养菌的方法复杂、所得单菌落生长不好的问题。方法1.取样品菌悬液，进行分离扩大培养；2.厌氧夹层培养出单菌落；3.挑取单菌落，进行扩大培养；4.挑取扩大培养后菌液，接种于固体分离培养至有单菌落长成，然后挑取单菌落转接液体培养基中；5.重复步骤二、三和四至分离出单菌落，即为除硫脱氮自养菌。本发明分离除硫脱氮自养菌的方法简单、单菌落生长好。
文档编号C12N1/20GK101307353SQ200810064468
公开日2008年11月19日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者万春黎, 刘春爽, 旭 周, 丹 孙, 杜大仲, 王爱杰, 阚洪晶, 川 陈, 高灵芳 申请人:哈尔滨工业大学