专利名称：强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种白腐真菌的发酵方法。
技术背景随着工农业生产的发展，越来越多的难降解有机物以各种形式被排放到环 境中，对人类的生存环境造成了极大危害，严重地威胁着地球生态系统的安全。 目前，处理染料废水的方法主要分为物理化学方法和生物法。常用的物理化学 技术主要有吸附脱色技术、混凝沉淀技术、化学氧化技术、离子交换技术、超 滤膜脱色技术、光催化技术、热氧化技术、高压脉冲电解技术等。物理化学方法对废水色度的去除率比较高，简便易行，但COD的去除率比较低，处理费 用高，产生大量废渣、污泥等副产品会对环境造成二次污染。相比之下，生物 法则是一种既经济又彻底的方法，而且不会造成二次污染。白腐真菌所分泌的锰过氧化物酶对有机物有很好的降解能力，且被本领域 技术人员所公认。但是，目前白腐真菌分泌(或发酵)锰过氧化物酶的周期长(为6天)，.且锰过氧化物酶产量低(接种量为107/100mL条件下培养6天、 锰过氧化物酶产量低于228 U/L)。
发明内容
'本发明的目的是为了解决目前白腐真菌分泌(或发酵)锰过氧化物酶的周 期长、且锰过氧化物酶产量低的问题，而提供的一种强化白腐真菌分泌锰过氧 化物酶的方法。强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶按以下步骤进行 一、将PDA固体培养 基中生长旺盛的白腐真菌接种于无菌水中，充分振荡后过滤，再将滤液中的白 腐真菌孢子接种到有泡沫载体的液体强化培养基；二、液体强化培养基用灭菌 封口膜密封，然后置于37士rC、转速为160r/min的环境中培养3天，即实现 强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶；其中步骤一强化培养基中白腐真菌孢子的接 种量为107/100mL;步骤一中1L液体强化培养基由10g葡萄糖、2g酒石酸铵、 2.0gKH2PO4、0.535gMgSO4、0.1gCaCl2、20mmol乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.035g MnS04、 0.07gNaCl、 0.007g CoCl2、 0.007g FeS04.7H20、 0.007g ZnS04'7H20、0.007gCuSO4、 0.7mgAlK(SO4)2.12H2O、 0.7mgNa2Mo04.2H20、 0.7mgH3BO3、 0.105g次氮基三乙酸酯、0.105 mmol藜芦醇和余量的水组成；步骤一 lOOmL 液体强化培养基中加入有1 1.4g泡沫载体。本发明强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法在白腐真菌培养第3天时 发酵液中出现酶活高峰，比现有白腐真菌发酵锰过氧化物酶的方法提前了 3 天，发酵周期縮短了一半。本发明方法锰过氧化物酶的产量高于900U/L，约 是现有方法产酶量的4倍。
图1是培养-脱色3天的泡沫载体外表面的25倍扫描电镜照片，图2是培 养-脱色3天的泡沫载体外表面的1000倍扫描电镜照片，图3是培养-脱色3 天的泡沬载体内部剖面的IOOO倍扫描电镜照片，具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶按以下步骤 进行 一、将PDA固体培养基中生长旺盛的白腐真菌接种于无菌水中，充分 振荡后过滤，再将滤液中的白腐真菌孢子接种到有泡沫载体的液体强化培养 基；二、液体强化培养基用灭菌封口膜密封，然后置于37士rC、转速为160r/min 的环境中培养3天，即实现强化白腐真菌分泌i孟过氧化物酶；其中步骤一强化 培养基中白腐真菌孢子的接种量为107/100mL;步骤一中1L液体强化培养基 由10g葡萄糖、2g酒石酸铵、2.0g KH2P04、 0.535g MgS04、 O.lg CaCl2、 20mmol 乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.035g MnS04、 0.07g NaCl、 0.007g CoCl2、 0.007g FeS04.7H20、 0.007g ZnS04.7H20、 0.007g CuS04、 0.7mg A1K(S04)2.12H20、 0.7mg Na2MoO4,2H2O、0.7mg H3BO3、0.105g次氮基三乙酸酉旨(Nitrilotriacetate)、 0.105 mmol藜芦醇和余量的水组成；步骤一 lOOmL液体强化培养基中加入有 1 1.4g泡沫载体。本实施方式中将白腐真菌固定于泡沫载体上(不同于现有技术中白腐真菌 在发酵液中悬浮培养)，泡沫载体上密布的孔隙为白腐真菌菌丝体的生长提供 足够大的伸展空间，有利于白腐真菌的生长和繁殖；而且白腐真菌菌丝体能牢 固地与泡沫载体独特的蜂窝状物理结构缠绕，形成稳定而牢固的微环境，所以 即使在振荡培养条件下发酵液中的菌丝体量也极少，便于后期锰过氧化物酶的 分离和纯化。本实施方式方法发酵过程中泡沫载体处于半浸没状态，大部分菌丝体暴露于空气中，增大了白腐真菌与空气的接触面积，提高了氧及营养物质 的传质效率，更有利于白腐真菌利用液体强化培养基中的营养元素，使白腐真 菌的次生代谢提前，加快发酵周期。液体强化培养基中的泡沫载体内部由于固、液、气之间的表面张力使得泡 沫载体孔隙内并不完全被液体培养基充满，而是固、液、气三相同时存在并处于动态平衡，有利于白腐真菌的生长；由于泡沫载体孔径的相对均一，白腐真 菌可均匀分布于泡沫载体，提高了液体强化培养基的利用率。本实施方式方法发酵培养3天，在泡沫载体表面形成厚厚的一层白色粉末 状菌体，说明白腐真菌生长旺盛。.图1是培养-脱色3天的泡沫载体外表面的 扫描电镜照片(X25倍)，图2是培养-脱色3天的泡沬载体外表面的扫描电镜 照片(X 1000倍)，图3是培养-脱色3天的泡沫载体内部剖面的扫描电镜照片 (X1000倍)，从图1 3上可以看出泡沫载体的孔隙内布满了白腐真菌菌丝 体(犹如蜘蛛网一般)。对比试验结果证明暴露在空气中的白腐真菌比浸没于培养液中的白腐真 菌生长更为旺盛、锰过氧化物酶的产量也更高。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中的 白腐真菌为黄孢原毛平革菌。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中选用的黄孢原毛平革菌(/Vw"erac/2wfe c/7oww/ oWMm,简称 A C7zo^w;x^"m)是一种常用生物研究材料。"根癌农杆菌介导的白腐丝状真 菌——黄孢原毛平革菌的转化"(《微生物学报》2005年45巻5期784-787页) 及"黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)对3种酚酸物质的降解作 用"(《安全与环境学报》2006年6巻5期8-10页)中都选用了黄孢原毛平革 菌作为生物材料。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中用 双层纱布进行过滤。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一滤液 中白腐真菌孢子在37士rC条件下培养至650nm紫外光吸光度值为0.5，再接种 到液体强化培养基。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式650nm紫外光吸光度值为0.5时滤液中白腐真菌孢子数为 2.5xl06/mL。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中的 泡沬载体为三棱柱状。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一或五的不同点是步骤一 中的泡沫载体为聚氨酯泡沫。其它步骤及参数与实施方式一或五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
六的不同点是步骤一中的聚氨酯泡沬的孔径为0.31mm，密度为0.039g/cm3，聚氨酯泡沫的体积为l.Ocm3。 其它步骤及参数与实施方式六相同。本实施方式中聚氨酯泡沫横截面是底边长为lcm，高为lcm的等腰三角形。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一 100mL液体强化培养基中加入有1.2g泡沫载体。其它步骤及参数与实施方式 一相同。
具体实施方式
九本实施方式强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶按以下步骤 进行 一、将PDA固体培养基中生长旺盛的白腐真菌接种于无菌水中，充分振荡后过滤，再将滤液中的白腐真菌孢子接种到有三棱柱状聚氨酯泡沫载体的液体强化培养基；二、液体强化培养基用灭菌封口膜密封，然后置于37°C、 转速为160r/min的环境中培养3天，即实现强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶； 其中步骤一强化培养基中白腐真菌孢子的接种量为107/100mL;步骤一中1L 液体强化培养基由10g葡萄糖、2g酒石酸铵、'2.0gKH2PO4、 0.535gMgSO4、 0.1gCaCl2、 20mmol乙酸-乙酸钠纟j冲溶液、0.035gMnSO4、 0.07gNaCl、 0.007g CoCl2、 0.007g FeS04'7H20、 0.007g ZnS04'7H20 、 0.007g CuS04 、 0.7mg A1K(S04)2'12H20、 0.7mgNa2MoO4.2H2O、 0.7mgH3BO3、 0.105g次氮基三乙酸 酉旨(Nitrilotriacetate)、 0.105 mmol藜芦醇和余量的水组成；步骤一 lOOmL液体强化培养基中加入有1.2g聚氨酯泡沫载体；步骤一滤液中白腐真菌孢子在37'C条件下培养至650nm紫外光吸光度值为0.5，再接种到液体强化培养基。 本实施方式方法分泌(发酵培养)3天，然后将液体强化培养基取出(挤 压泡沫载体，得到泡沬载体中的液体强化培养基)进行检测，液体强化培养基 中锰过氧化物酶的产酶量为915.62 U/L，是现有方法发酵培养6天产酶量的4 倍以上。
权利要求
1、强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，其特征在于强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶按以下步骤进行一、将PDA固体培养基中生长旺盛的白腐真菌接种于无菌水中，充分振荡后过滤，再将滤液中的白腐真菌孢子接种到有泡沫载体的液体强化培养基；二、液体强化培养基用灭菌封口膜密封，然后置于37±1℃、转速为160r/min的环境中培养3天，即实现强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶；其中步骤一强化培养基中白腐真菌孢子的接种量为107/100mL；步骤一中1L液体强化培养基由10g葡萄糖、2g酒石酸铵、2.0g KH2PO4、0.535gMgSO4、0.1g CaCl2、20mmol乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.035g MnSO4、0.07g NaCl、0.007g CoCl2、0.007g FeSO4·7H2O、0.007g ZnSO4·7H2O、0.007g CuSO4、0.7mgAlK(SO4)2·12H2O、0.7mg Na2MoO4·2H2O、0.7mg H3BO3、0.105g次氮基三乙酸酯、0.105mmol藜芦醇和余量的水组成；步骤一100mL液体强化培养基中加入有1～1.4g泡沫载体。
2、 根据权利要求1所述的强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，其特 征在于步骤一中的白腐真菌为黄孢原毛平革菌。
3、 根据权利要求1所述的强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，其特 征在于步骤一中用双层纱布进行过滤。
4、 根据权利要求1所述的强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，其特 征在于步骤一滤液中白腐真菌孢子在37士rC条件下培养至650nm紫外光吸光 度值为0.5，再接种到液体强化培养基。
5、 根据权利要求1所述的强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，其特 征在于步骤一中的泡沬载体为三棱柱状。
6、 根据权利要求1或5所述的强化白腐寘菌分泌锰过氧化物酶的方法， 其特征在于步骤一中的泡沫载体为聚氨酯泡沬。
7、 根据权利要求6所述的强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，其特 征在于步骤一中的聚氨酯泡沫的孔径为0.31mm，密度为0.039g/cm3，聚氨酯 泡沫的体积为1.0 cm3。
8、 根据权利要求1所述的强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，其特 征在于步骤一 lOOmL液体强化培养基中加入有1.2g泡沫载体。
全文摘要
强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法，它涉及一种白腐真菌的发酵方法。它解决了目前白腐真菌分泌(或发酵)锰过氧化物酶的周期长、且锰过氧化物酶产量低的问题。方法1.将PDA固体培养基中生长旺盛的白腐真菌接种于无菌水中，充分振荡后过滤，再将滤液中的白腐真菌孢子接种到有泡沫载体的液体强化培养基；2.液体强化培养基用灭菌封口膜密封，然后置于37±1℃、转速为160r/min的环境中培养3天，即实现强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶。本发明强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶的方法在白腐真菌培养第3天时发酵液中出现酶活高峰，比现有白腐真菌发酵锰过氧化物酶的方法提前了3天，发酵周期缩短了一半。本发明方法锰过氧化物酶的产量高于900U/L，约是现有方法产酶量的4倍。
文档编号C12N1/14GK101260388SQ20081006433
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月18日 优先权日2008年4月18日
发明者曾永刚, 红 梁, 高大文 申请人:东北林业大学