专利名称：东北野生大豆s-腺苷甲硫氨酸合成酶sams基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及现代分子生物学与基因工程技术，具体说就是一种东 北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因。
背景技术：
随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们 眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录表达的以后，生 物学家不再仅仅满足于探索生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设 想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。如果将一种生物的DNA 中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA 重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造 出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。随着工业现代化、灌溉地和塑料大棚面积的扩大，土壤次生盐渍 化也日趋严重，以盐碱为例，全国有盐碱地近15亿亩，仅黑龙江省 盐碱地就高达9000余万亩，全国有2000多万公顷盐碱荒地等待开垦 利用。因此如何通过提高作物抗渗透胁迫能力来充分利用盐碱地资源 增加耕地面积，增加粮食产量和节约水资源，已成为挖掘逆境农业生 态区的生产潜力、保持我国农业持续高效发展、解决粮食安全亟待解 决的重大问题。近年来现代分子生物学与基因工程技术发展迅猛，为 通过转基因技术培育耐盐碱转基因作物，改良盐碱地展示了美好的发 展空间，克隆具有自主知识产权的新基因是其重要前提。发明内容本发明的目的是公开一种从抗逆性极强的东北野生大豆中克隆 出来的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,简 称SAMS)基因，具有较强耐盐碱、低温、抗干旱的功能，是培育耐 盐碱、低温、干旱转基因植物的重要功能基因。本发明的目的是这样 实现的1. 东北野生大豆EST的筛选东北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆是通过筛选东 北野生大豆盐胁迫cDNA文库及EST库，经过cDNA序列与NCBI 等网上数据库进行同源性比对，筛选渗透胁迫相关基因。2. 东北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆采用RT-PCR的方法，获得到1178bp的片段。通过分析其氨基 酸序列，编码392个氨基酸，ORF査找具有完整的开放阅读框。初 步确定已经克隆得到了东北野生大豆的《X4MS基因，命名为G^X4MS， 将其DNA序列提交GenBank，登录号为EU145721 。3. C^&4MS基因的功能分析构建Gs&^必基因植物表达载体，对模式植物烟草进行转化， 获得整合Gs&^必基因的烟草植株，进行了分子生物学检测，包括 PCR检测、Southern-blot检测和RT-PCR检测；对转基因烟草进行了 抗逆性分析，包括与耐盐碱、低温及干旱能力相关的生理指标(不同 条件处理下叶绿素含量、丙二醛含量、电导率、脯氨酸含量、超氧化 物歧化酶活性)测定。结果表明转G^5^W5"基因烟草植株在不同的 胁迫处理条件下的各项生理指标不同程度的优于未转基因烟草对照， 并表现明显的抗性。证明GW^l必具有提高植物耐盐碱、低温及干旱 的功能。本发明所述的东北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基 因，该基因包括1178bp的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG 起始密码子和TAA终止密码子。本发明所述的东北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基 因，其核苷酸序列及氨基酸序列见序列表l。来源于东北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS，简称 6^54^5)基因是一种具有抗渗透胁迫功能的基因，尤其对盐胁迫的抗 性较为明显。因此为植物抗渗透胁迫基因工程提供了新的基因资源。 通过对转基因烟草的抗逆性检测，证明C^&4MS基因具有显著的耐盐 碱能力，对低温和干旱也表现出较强的抗性。是培育抗渗透胁迫转基 因作物的较理想基因。
图1为转G^S^WS基因烟草PCR检测结果；图2为转GsSAMS基因烟草Southern检测结果；图3为转GsSAMS基因烟草RT-PCR检测结果； 图4为野生大豆C^S^MS基因PCFl扩增结果；具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明1. 东北野生大豆ESTs筛选根据东北野生大豆盐胁迫cDNA文库及EST数据库，筛选EST得 到与渗透胁迫直接相关的cDNA序列，将cDNA序列与NCBI等网上数 据库进行同源性比对，从中筛选渗透胁迫相关基因。2. 东北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆采用RT-PCR的方法，获得到U78bp的片段。图4是SAMS基 因PCR扩增的电泳结果，其中M: DL2000 marker 1、 2、 3、 4:退 火温度分别为52°C、 54°C、 56°C、 58°C。PCR扩增的引物序列为GsSAMS UP: 5'- AgA Tgg CAg AgA CAT TCC T -3'GsSAMS5'- TgC ACC TTT CAA TAC CTA TAA -3' DOWN:根据测序及序列分析，得到了具有完整的开放阅读框的基因命名 为G^SL4il必；基因的全长DNA序列及氨基酸序列见序列表2。序列表l:1ATGGCAGAGACATTCCTATTTACCTCAGAGTCGGTGAACGAGGGACACC CTGACAAGCTC1 MAETFLFTSESVNEG H P D K LCAGACAGCAAA21 CDQISDAVLDACLEQ D P D S K121GTTGCCTGCGAAACATGCACCAAAACCAACTTGGTCATGGTCTTCGGAG AAATCACGACC41 VACETCTKTNLVMVF G E 工T T181AAGGCCAACGTTGACTACGAGAAGATAGTGCGTGACACCTGCAGGAACA TCGGCTTCGTC61 KANVDYEKIVRDTCR N I G F V241TTGAGCAGCAG 81 S NN 工 E Q QDVGLDAGNCKVLV301AAGAAATTGGT 101 S PP E E I GDAQGVHGHLTKK361GCTGGTGACCAGGGTCACATGTTTGGCTATGCCACTGATGAAACCCCTG AATTGATGCCA121 AGD(2GHMFGYATDET P E L M P421GCAAGAACGGT141 LSHVLATKLGARLTE V R K N G481ATTACAATGAC161 TCPWLRPDGKTQVTV E Y Y N D541AACACGACGAG181 NGARVP工RVHTVLIS T <2 H D E601AGCCTGTGATC201 TVTNDEIAADLKEHV I K P V I661GCCGTTTTGTC221 PEKYEDEKTIFHLNP S G R F VTCGATACTTAT241 工GGPHGDAGLTGRKI 工ID T Y781CCAAGGTTGAT261 GGWGAHGGGAFSGKD P T K V D841AGGAGTGGTGCTTACATTGTGAGACAGGCTGCTAAGAGCATTGTGGCAA GTGGACTTGCC281 RSGAYIVRQAAKSIV A S G L A901AGAAGGTGCATTGTGCAAGTGTCTTATGCCATTGGTGTGCCTGAGCCTT TGTCTGTGTTT301 RRCIVQVSYAIGVPE P L S V F961GTTGACACCTATGGCACTGGGAAGATCCATGATAAGGAGATTCTCAACA TTGTGAAGGAA321 VDTYGTGKIHDKEIL N I V K E1021GGGGTGGAAAT341 NFDFRPGMISINLDL K R G G N1081CTGACTTCACA361 NRFLKTAAYGHFGRE D P D F T1141 TGGGAAGTGGTCAAACCCCTCAAGTGGGAGAAGCCTAA 381 WEVVKPLKWEKP序列表2:1ATGGCAGAGACATTCCTATTTACCTCAGAGTCGGTGAACGAGGGACACC CTGACAAGCTC1 MAETFLFTSESVNEG H P D K L61CAGACAGCAAA21 CDQISDAVLDACLEQ D P D S K121AAATCACGACC41 VACETCTKTNLVMVF G EIT T181AAGGCCAACGTTGACTACGAGAAGATAGTGCGTGACACCTGCAGGAACA TCGGCTTCGTC61 KANVDYEK工VRDTCR N I G F V241TTGAGCAGCAG81 S N D VN工E Q QGLDAGNCKVLV301AAGAAATTGGT101 SP DP E EI GAQGVHGHLTKK361GCTGGTGACCAGGGTCACATGTTTGGCTATGCCACTGATGAAACCCCTG AATTGATGCCA121 AGDQGHMFGYATDET P E L M P421GCAAGAACGGT 141 L SV R K N GHVLATKLGARLTE481ATTACAATGAC 161 T CE Y Y N DPWLRPDGKT(2VTV541AATGGTGCCAGGGTTCCTATTCGTGTACACACCGTGCTAATCTCCACCC AACACGACGAG181 NGARVPIRVHTVLIS T <2 H D E601AGCCTGTGATC201 TVTNDEIAADLKEHV I K P V I661GCCGTTTTGTC221 PEKYLDEKTIFHLNP S G R F V721TCGATACTTAT241 IGGPHGDAGLTGRK工 II D T Y781GGAGGATGGGGTGCTCATGGTGGTGGTGCTTTCTCCGGGAAGGACCCTA CCAAGGTTGAT261 GGWGAHGGGAFSGKD P T K V D281 RSGAYIVRQAAKS IVA SG L A901TGTCTGTGTTT 301 R R CP L S V F961GTTGACACCTATGGCACTGGGAAGATCCATGATAAGGAGATTCTCAACA TTGTGAAGGAA321 VDTYGTGKIHDKEIL N I V K EV <2 V S Y AG V P E1021GGGGTGGAAAT341 NFDFRPGMISINLDL K R G G N1081AACAGGT T T T TGAAGACT GC T GCC TAT GGACAC T T T GGAAGAGAAGAC C CTGACTTCACA361 NRFLKTAAYGHFGRE D P D F T1141 TGGGAAGTGGTCAAACCCCTCAAGTGGGAGAAGCCTAA 381 WEVVKPLKWEKP
权利要求
1.一种东北野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS基因，其特征在于该基因包括1178bp的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAA终止密码子。
全文摘要
本发明公开一种从东北野生大豆中克隆的S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS基因，该基因包括1178bp完整的开放读码框，编码392个氨基酸，有ATG起始密码子和TAA终止密码子。其耐盐碱、低温和干旱的功能验证是通过转基因烟草进行，系统地测定了与盐碱、低温和干旱相关的生理指标，证明该基因具有提高植物耐盐碱、低温和干旱的功能。是一种具有抗渗透胁迫功能的基因，尤其对盐胁迫的抗性较为明显。为植物抗渗透胁迫基因工程提供新的基因资源。
文档编号C12N9/00GK101333534SQ200810064150
公开日2008年12月31日 申请日期2008年3月21日 优先权日2008年3月21日
发明者华 才, 朱延明, 勇 李, 锡 柏, 樊金萍, 巍 纪 申请人:东北农业大学