S-腺苷甲硫氨酸合成酶制剂、及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本公开涉及生物化学领域;具体而言涉及s-腺苷甲硫氨酸合成酶酶制剂及其生产 方法和用途。
【背景技术】
[0002] S-腺苷甲硫氨酸合成酶（以下简称MAT)(EC 2.5.1.6)是生物体内一种非常重要的 酶。在有Mg2+和K+存在的情况下，它可以催化L-Met与ATP反应，生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM)。 SAM是生物体内重要的中间代谢产物，参与体内多种生化反应。S-腺苷甲硫氨酸合成酶是一 种重要的原料酶。
[0003] 现有的S-腺苷甲硫氨酸合成酶生产方法主要采用酵母系统（参见1-4)，包括毕赤 酵母和酿酒酵母。这种方法的缺点主要是生产过程相对原核表达体系来说比较复杂，产量 较低，同时成本高。这最终导致MAT的生产成本提高。因此，本领域当中仍然需要一种成本更 有效的方法来生产高纯度的MAT。
[0004] 目前的临床检验中，对同型半胱氨酸(HCY)的检测以酶循环法为主导地位。现有技 术的循环酶法检测试剂盒有两种:一种为甲基转移酶和水解酶的循环酶法;另一种为胱硫 醚循环酶法。循环酶法简便易行，已经在临床广泛采纳。
[0005] 现有技术中，采用酶循环法测定HCY的检测试剂，包括但不限于如下文献中所报道 的：CN104140996A;CN104630324A ;CN104198726A;张传宝等人，对循环酶法同型半胱氨酸测 定试剂盒的评价，中华检验医学杂志，2006;叶余辉，循环酶法测定血清同型半胱氨酸试剂 盒的评价，中国医药指南，2013;王兴宁等人，循环酶法测定同型半胱氨酸试剂盒评价，标记 免疫分析与临床，2014。
[0006] 然而，胱硫醚循环酶法缺陷在于易受人体内源的胱硫醚干扰。甲基转移酶和水解 酶的循环酶法不受人体内源胱硫醚的干扰，但是依然存在稳定性差等缺点。因此，本领域依 然需要提供一种更加改进的循环酶法检测试剂。
【发明内容】
[0007] 根据本公开的一方面，提供一种酶制剂，其含有按质量计不低于90%的S-腺苷甲 硫氨酸合成酶；例如纯度不低于91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 99.5 %的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
[0008] 在本申请的上下文中，纯度表征了物质含杂质的程度，杂质越少，纯度越高。对于 蛋白质纯度的测定允许采用本领域技术人员公知的任何方法(包括现在的以及未来的测定 方法），包括但不限于电泳法、色谱法。在一些实施方式中，本申请中MAT酶制剂的纯度是通 过电泳法所确定的纯度。具体而言，在电泳法中，将样本上样于凝胶中进行电泳，然后对凝 胶进行染色，将代表着MAT的条带的染色强度和全部条带的染色强度进行比较，通过所获得 的比例确定MAT在酶制剂中的纯度。
[0009] 在另一些实施方式中，本申请MAT酶制剂的纯度是通过色谱法所确定的纯度。例 如，将样本上样于色谱柱上，当组分流出色谱柱时通过紫外检测信号，将代表着MAT的色谱 峰面积和全部色谱峰面积进行比较，通过所获得的比例确定MAT在酶制剂中的含量。
[0010]在一些实施方式中，所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0011] MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDΙΕΕITRNTVREIG YVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRK NGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRF VIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEP TSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK (SEQ ID NO.1)〇
[0012] 本公开的酶制剂，在7天37°C加速稳定性测试下，其酶活性不低于初始酶活性（BP 37°C加速稳定性测试初始时的酶活性)的95%。
[0013] 在一些实施方式中，本公开的酶制剂允许制备成液体或干粉形式;如为了便于保 存和运输，可以制成冻干粉形式。
[0014] 根据本公开的一方面，提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达载体，其包含如SEQ ID N0:2所示的核苷酸和pET载体。pET载体含有强T7启动子，不被大肠杆菌RNA聚合酶识别。 在无诱导剂的情况下，几乎没有表达。在有诱导剂（如IPTG或Lac)的情况下，目的基因可以 得到高水平的表达。载体上包含有抗生素标记(如Kan和Amp标记)和荧光标记等多种常用的 检测标记，有利于重组质粒的筛选。在一些实施方式中，pET载体是pET41a载体。载体的多克 隆位点上还含有多种限制性内切酶的酶切位点。环形的质粒经酶切后可以得到线性质粒， 与同样酶切的基因片段具有相同的粘性末端，两者连接后即可得到重组质粒。
[0015] SEQ ID N0.2如下所示：
[0016] ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGC CGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTT TAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGC TATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACAT CAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTA ATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAA AACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGG TATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAG AGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTC GTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCG TCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCG CGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCG ACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTT CGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTC ACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAG〇
[0017] 在一些实施方式中，SEQ ID N0:2所示的核苷酸插入到pET41a质粒的Ndel和Xhol 位点之间。
[0018] 根据本公开的一方面，提供一种表达宿主，其包含根据本公开的s-腺苷甲硫氨酸 合成酶的表达载体;其中所述宿主为大肠杆菌，包括但不限于JM109(DE3)、BL21 (DE3)、DH5a 或T0P10。在一些实施方式中，是大肠杆菌BL21(DE3)。
[0019] 根据本公开的一方面，提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶的生产方法，包括步骤：
[0020] 1)提供编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的多核苷酸，其中所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶 的氨基酸序列是SEQ ID N0:1;优选地，所述多核苷酸的序列包含SEQ ID N0:2;
[0021] 2)将多核苷酸插入到pET41a质粒的Ndel和Xho頂每切位点之间，构建表达载体；
[0022] 3)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达宿主；
[0023] 4)对所述表达宿主进行补料分批式发酵；
[0024] 5)收集发酵所得的菌体；
[0025] 6)将所述菌体破碎，收集上清；
[0026] 7)通过亲和层析，从所述上清中纯化所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶；
[0027] 8)获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
[0028] 将外源核酸转入宿主细胞的方式有多种，如转化、转导或转染。转化在基因工程中 是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要的手段，常见的有氯化钙法化学转化、优选 电击转化和高压电击转化。在一些实施方式中，根据实验条件，利用氯化钙法化学转化将所 述表达载体引入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，构建了能够稳定表达S-腺苷甲硫氨酸合 成酶的表达宿主。
[0029] 大肠杆菌的培养基中通常含有其生长所需的碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐 和水，即微生物生长所需的六大营养要素。常见的培养基有LB液体培养基、LB固体培养基 (每升培养基中含1 〇g胰化蛋白胨，5g酵母提取物、10g NaCl和15g琼脂糖，pH 7.0)、肉汤培 养基(每升培养基中含l〇g胰化蛋白胨，3g牛肉膏和5g NaCl，pH 7.4)、TB培养基(每升培养 基中含12g胰化蛋白胨，24g酵母提取物，4ml甘油，17mmol KH2P〇4和72mmolK2HP〇4)、M9培养 基(每升培养基含〇·5g NH4CI、3·0g Na2HP〇4、1 ·5g KH2P〇4、lmmol MgS04、0· 1 %w/v葡萄糖和 50mmol CaCl2，pH7.4)等。在一些实施方式中，在表达载体的构建和转化