一种新型重组高稳定性超氧化物歧化酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药、化妆品和功能食品等领域，具体涉及一种耐消化道酶酶解、 耐酸碱、耐高温的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，S0D)、其编码基因和应用，以及 包含该耐高温超氧化物歧化酶的化妆品、保健食品和药物组合物及应用。
【背景技术】
[0002] 自由基是生命科学的研究热点，1956年美国的Harman将辐射化学中的自由基概念 引入生物领域，提出了著名的自由基学说(Free radial theory)。活性氧(R0S)是机体内最 常见的自由基。人体的自由基以氧自由基为主。机体内过多的活性氧会引起脂质过氧化，改 变生物膜结构和功能，使蛋白质变性、交联，酶失活等。活性氧与心肌休克、辐射损伤、动脉 粥样硬化、免疫系统缺陷等疾病的发生、发展密切相关。过量的自由基诱发机体氧化反应， 可损害机体的组织和细胞，进而导致衰老，于是Harman提出了著名的自由基衰老学说。氧化 应激导致生物分子的氧化损伤，引起机体内源性损伤相关分子模式(DAMPs)产生和释放细 胞因子。细胞因子能激活模式识别受体(PRRs)下游的信号通路，如核因子kB(NF-kB)、JAK、 STAT和MAPK等，导致细胞因子和趋化因子释放增加，招募和激活更多的炎性细胞，引起机体 系统性慢性炎症反应。基于氧化应激与炎症、衰老的密切关系，De la Fuente等提出了氧 化-炎症衰老学说，并认为氧化应激导致炎性衰老。
[0003] 超氧化物歧化酶广泛存在于各种生物体内，是机体不可缺少的一种重要的氧自由 基清除剂，在生物体防御氧化损伤方面具有重要的作用。根据结合的金属离子辅基的不同， S0D可分为四大类:Cu/Zn-SOD、Fe-S0D、Mn-S0D和Ni-SOD。研究表明，S0D能有效地清除氧自 由基，可治疗多种炎症、对于辐射损伤的预防和治疗也有重要作用。其中性质最为稳定，毒 性最小的是Mn-S0D。
[0004] 在线粒体的氧化磷酸化电子传递体系中，分子02是最后一个受体，正常情况下02接 受四个电子变为H 20,如果部分传递电子，则会形成高活性的氧自由基(R0S)，氧自由基会攻 击脂膜、蛋白质、DNA，引起神经退化、衰老、癌症、肺纤维化、血管疾病，R0S还是重要的诱发 炎症反应的因素。炎症是机体对感染源、外伤或组织缺血产生的一种防御性的反应。不正常 的炎症反应导致多种疾病。炎症最重要的共性病理特征是白细胞（中性粒细胞和巨噬细胞） 的迀移、聚集和浸润，研究中性粒细胞的聚集部位和数量是研究炎症最常见的方法。很多实 验证明过抗氧化酶是炎症反应的主要调节因子。位于线粒体中的Μη-SOD是去除氧自由基的 第一个酶，它的活性关系着自由基的清除速率和炎症的修复效率。
[0005] 哺乳动物Μη-SOD位于线粒体内，它的功能是控制线粒体中(V的水平，避免氧自由 基对线粒体的损伤。对于生物体内Μη-SOD的功能的研究证明，Μη-SOD与炎症反应、细胞衰老 密切相关。缺乏该基因的小鼠多数器官的线粒体都有严重的损伤，该基因敲除后，小鼠往往 在胎儿期死亡，而补充Μη-SOD则能够使其存活期延长。Μη-SOD可能成为一种新型抗炎症药 物。
[0006] 环境污染、心理压力大、嗜烟嗜酒等不良的生活习惯都会导致体内代谢的异常，大 量积累氧自由基，导致情绪低落、疲惫、免疫力降低，使人长期处于亚健康状态。如果能够适 量补充SOD，将会改善这些亚健康症状，因而SOD可以用于保健品或作为食品添加剂使用。另 外，Mn-SOD还具有抗衰老、防止皮肤色素沉着等作用，因而也可以在化妆品中添加使用。
[0007] 虽然目前的基础研究已经证明了S0D的作用方式及其功效，但是，S0D还很难有实 际的应用，也不能达到预期的治疗效果，这主要是由以下因素造成的：首先，由于在药物制 备、化妆品和食品加工的过程中多涉及到灭菌、加热提取等步骤，而普通S0D稳定性差、不耐 高温、不耐长时间存储的特点严重制约了其产业化应用;其次，S0D是生物大分子，透皮吸收 的量有限，可能限制其疗效;最后，口服药物和食品均由消化道消化吸收，S0D作为一种蛋白 质，往往被胃液和肠液中的蛋白酶消化降解，不能起到应有的作用。欧洲食品安全评价机构 (European Food Safety Authority，EFSA)认为S0D对于健康的促进的作用还需要更多的 证据（EFSA Journal 2010;8(10): 1753)〇
[0008] 尽管，许多研究者也进行了很多的探索，比如通过基因工程方法生产耐高温的SOD 以期克服上述缺陷，但到目前为止，现有技术中仍存在如下技术难题尚未克服:1)重组表达 的S0D存在耐酸碱性不足;2)所产S0D易被消化道中的胃蛋白酶、胰蛋白酶降解而失去活性。
[0009] 因此，现有技术中的S0D由于在耐高温、耐酸碱性、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶降解等 方面存在的缺陷，极大地限制了 S0D在化妆品、食品和医学领域中的应用。现急需开发一种 新的同时耐高温、耐酸碱性、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶等降解的超氧化物歧化酶。
【发明内容】
[0010] 本发明通过基因工程手段解决了上述现有技术的问题，因此本发明的目的之一是 提供一种新的耐高温、耐酸碱、耐消化道酶降解的超氧化物歧化酶及其编码基因和应用。
[0011] 本发明提供一种耐高温、耐酸碱、耐消化道酶降解的超氧化物歧化酶，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.4所示。
[0012] 本发明还提供了编码上述耐高温、耐酸碱、耐消化道酶降解的超氧化物歧化酶的 基因，优选地所述基因序列为序列表中SEQ ID N0.3所示的DNA序列。
[0013] 根据本发明的另一方面，本发明还提供含有上述基因的表达载体、转基因细胞系、 宿主囷。
[0014] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，该组合物含有有效治 疗量的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示的超氧化物歧化酶。其中，"有效治疗量"的意思是指 "本发明公开的药物组合物在实现所需结果或治疗结果需要的剂量和时间周期下有效的 量"。有效治疗量可随本领域中已知的因素而变化，例如待治疗的人或动物的疾病状况、年 龄、性别和重量。本领域技术人员应了解，所述剂量方案可改变以提供最佳的治疗响应。例 如，可每日给予数个分开的剂量或可就治疗情形紧迫所表示的成比例减少剂量。此外，本公 开的组合物可按所需的频率给予，以实现有效治疗量。
[0015] 根据本发明的另一方面，本发明提供的上述药物组合物还含有抗菌剂和/或可药 用载体和/或赋形剂。所述药物组合物的剂型为内服剂型或外用剂型，其中，所述内服剂型 优选口服液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服散剂等;所述外用剂型优选外用散剂、软膏 剂、贴剂、外用液体剂、栓剂、喷剂、气雾剂、吸入剂。另外，为了延长蛋白质药物在血液中保 留时间，本发明还可以采用脂肪酸、多糖类物质、月桂酰氯、右旋糖酐、聚乙二醇(PEG)等制 药领域常用修饰剂对耐高温SOD进行化学修饰。
[0016] 根据本发明的另一方面，本发明还提供一种化妆品组合物，其特征在于，所述化妆 品组合物包含有效量的本发明所述的超氧化物歧化酶。
[0017] 根据本发明的另一方面，本发明还提供一种食品添加剂，所述食品添加剂包含本 发明所述的超氧化物歧化酶。
[0018] 根据本发明的另一方面，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示的耐高温 超氧化物歧化酶的制备方法，所述制备方法具体为通过表达编码所述耐高温超氧化物歧化 酶的基因，如序列表中SEQ ID N0.3所示的DNA序列或者通过化学合成方法获得所述耐高温 超氧化物歧化酶。
[0019] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了本发明所述的超氧化物歧化酶或所述的 基因或所述的表达载体、转基因细胞系、宿主菌或所述的药物组合物在制备抗炎药物中的 应用。其中，所述炎症包括粘膜炎症、外源性致炎因子（inf lammatory agent)引起的炎症或 皮肤炎症。其中，所述粘膜炎症包括:呼吸道、消化道、生殖器官、听觉器官、视觉器官粘膜炎 症，优选口腔溃疡、牙龈炎、肠炎、胃炎、阴道炎、盆腔炎、膀胱炎、宫颈炎、鼻炎、咽炎、中耳 炎、外耳道炎、眼结膜炎、眼角膜炎;所述外源性致炎因子引起的炎症包括由生物性因子、物 理性因子、外源性化学性因子、或前述几种致炎因子组合引起的炎症，优选地，生物性因子 引起的炎症包括细菌、病毒、立克次体、原虫、真菌、螺旋体和寄生虫作用于机体引起的炎 症;优选地，物理性因子引起的炎症包括机械力、高温、低温、电离辐射、紫外线作用于机体 引起的炎症，更优选烧伤、烫伤、冻伤、晒伤、割伤、辐射损伤引起的炎症或外科手术或放疗 后形成的炎症;优选地，外源性化学性因子引起的炎症包括放射性物质、强酸、强碱、强氧化 剂、酒精、化学药物作用于机体引起炎症，更优选酒精或药源性肝炎、化疗后形成的炎症;所 述皮肤炎症包括手足癣、毛囊炎、接触性皮炎、湿疹、荨麻疹、神经性皮炎、脂溢性皮炎，优选 婴幼儿湿疹。
[0020] 具体地，生物性因子是引起炎症最常见的原因，由其引起的炎症又称为感染。例 如:细菌可释放内毒素和外毒素激发炎症;病毒可通过在细胞内复制，致感染细胞坏死;某 些病原体通过其抗原性诱发超敏反应性炎症，如结核病等。其中，物理性因子包括机械力 (如割伤）、高温(如烧伤、烫伤）、低温(如冻伤）、电离辐射(如核辐射损伤）、紫外线(如紫外 线损伤)等各种物理性因子，其作用于人体，只要达到一定的强度或一定的作用时间，均可 引起炎症。其中，外源性化学性因子包括放射性物质、强酸、强碱、强氧化剂或其他化学物 质，其在体内达到一定浓度或剂量时会引起炎症。
[0021] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了本发明所述的超氧化物歧化酶或所述的 基因或所述的表达载体、转基因细胞系、宿主菌在制备化妆品和保健食品中的用途。其中， 化妆品优选抗衰老、防止皮肤色素沉着的化妆品。
【附图说明】
[0022] 图1是野生型耐高温S0D、突变型耐高温S0D以及普通S0D的耐热稳定性对比图；
[0023] 图2是野生型耐高温S0D、突变型耐高温S0D以及普通S0D的酸碱耐受性比较图； [0024]图3是普通S0D、突变型耐高温S0D抗胃蛋白酶降解能力比较图；
[0025]图4是普通S0D、突变型耐高温S0D抗胰蛋白酶降解能力比较图；
[0026]图5是突变型耐高温SOD对结肠炎的治疗作用表型图；
[0027]图6是突变型耐高温S0D对结肠炎的治疗作用(肠腔面积)比较图；
[0028]图7是突变型耐高温S0D对结肠炎的治疗作用（相对肠腔面积)比较图；
[0029]图8是突变型耐高温S0D对结肠炎的治疗效率比较图；
[0030]图9是突变型耐高温S0D对结肠炎炎症消退的促进作用表型图；
[0031]图10是突变型耐高温S0D对结肠炎炎症消退的促进作用（中性粒细胞数目）比较 图；
[0032]图11是突变型耐高温S0D对结肠炎炎症消退的促进率比较图；
[0033]图12是突变型耐高温S0D对结肠炎治疗作用的组织病理学分析图；
[0034]图13是突变型耐高温S0D对斑马鱼炎症的抗炎作用表型图（注:箭头所指为炎症部 位中性粒细胞）；
[0035]图14是突变型耐高温S0D对斑马鱼炎症的抗炎作用（中性粒细胞个数）比较图（与 模型对照组相比，**ρ〈〇·〇1，***ρ〈〇·〇〇1);
[0036] 图15是突变型耐高温SOD对斑马鱼炎症的炎症消退率比较图（与模型对照组相 比，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001);