新的人谷胱苷肽过氧化酶、其编码序列及制法和用途的制作方法

专利名称：新的人谷胱苷肽过氧化酶、其编码序列及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。更具体地说，本发明的多肽被推断鉴定为谷胱苷肽过氧化酶家族的一个新成员。
谷胱苷肽过氧化酶家族成员广泛存在于生物体的各个组织、器官中，以谷胱苷肽为还原剂催化有机过氧化物和过氧化氢的还原，保护细胞在正常的氧代谢中不受到损伤(Nutri.Rev.，1980(38)，265-273)。
早在1957年，就在生物体内检测到谷胱苷肽过氧化酶(glutathioneperoxidase，简称为“GPx”，又名“GSHPx”)，并发现它有重要的生理活性(J.Biol.Chem.，1957(229)，189-197)。
1973年由Rotruck小组和Flohe小组同时发现谷胱苷肽过氧化酶的每一个单体都有一个硒(Science，1973(179)，588-590)，后来发现该蛋白的第二十一个氨基酸是硒代半胱氨酸，这是第一个被发现的含硒的蛋白酶。
之后，陆续发现磷脂过氧化物谷胱苷肽过氧化酶(phospholipid hydroperoxideGPx，简称为“PHGPx”)、血浆谷胱苷肽过氧化酶(glycosylated plasma GPx，简称为“pGPx”)、肠胃谷胱苷肽过氧化酶(gastrointestinal GPx，简称为“GI-GPx”)(Biochim Biophys Acta，1982(710)，197-211，J.Biol.Chem，1987(262)，17398-17403，Arch.Biochem.Biophys.，1987(254)，9-17)等含硒的过氧化酶。
目前，谷胱苷肽过氧化酶家族主要由上述四种硒蛋白酶组成，编码GPx、GI-GPx、pGPx和PHGPx的四个基因分别命名为GPx1、GPx2、GPx3和GPx4(Arch.Biochem.Biophys.，1997，Vol340(1)，59-63)。除磷脂过氧化物谷胱苷肽过氧化酶是分子量为19kD的单体外，其余三种酶均为四聚体，每个单体分子量约为22kD。三种四聚体酶之间的同源性较高，而它们与单聚体的磷脂过氧化物谷胱苷肽过氧化酶之间同源性只有30％。但该单聚体酶的7个外显子中的两个与四聚体酶的两个外显子具有极高的同源性，足以证明它们属于同一基因家族(Methods in Enzymol，1995(252)，38-53)。
该家族成员中，(1)谷胱苷肽过氧化酶存在于所有细胞中，(2)磷脂过氧化物谷胱苷肽过氧化酶特异性地还原磷脂的过氧化物衍生物以及膜和低密度脂蛋白(LDL)中的胆甾醇和胆甾醇酯(J.Biol.Chem.，1990(265)，454-461)，(3)肠胃谷胱苷肽过氧化酶则主要存在于胃肠道中(J.Biol.Chem，1993(268)，2571-2576)，上述三种酶均为细胞内酶。而血浆谷胱苷肽过氧化酶为细胞外酶，主要存在于血浆中(Nutri.Rev.，1980(38)，265-273)。作为该家族中唯一的细胞外酶，血浆谷胱苷肽过氧化酶与其它三种酶有着显著的差别它与其它三种酶在蛋白质水平上仅有44％的同一性，因此抗血浆谷胱苷肽过氧化酶的抗体不会与其它三种酶有交叉反应(Blood，1986(68)，640-645)；而且，血浆谷胱苷肽过氧化酶有糖基化修饰，其它三种酶没有(Blood，1989(73)，318-320)。四种酶在一级结构中虽有差异，但它们的活性位点尤其是催化位点的硒代半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺，是非常保守的，这三处残基与酶和底物谷胱苷肽(glutathione，GSH)结合的特异性有关(Biomed.Environ.Sci.，1997(10)，327-332)。该家族的结构特征是，都具有由通常作为终止密码子TGA所编码的硒代半胱氨酸(EMBO J.，1986，Vol5(6)，1221-1227)。
谷胱苷肽过氧化酶家族成员均可将SOD歧化超氧自由基(·O2)而生成的H2O2转变成H2O而清除之，从而防止了羟自由基(·OH)、·O2的产生，进而防止脂质过氧化物的生成(中国地方病学杂志，1991(6)，337)。研究表明，自由基和脂质过氧化物的形成，会导致细胞膜损害，被认为是许多疾病的主要病因，如动脉粥样硬化、冠心病和糖尿病等心血管疾病。由于该家族成员能有效的降低过氧化物的毒性，因此与多种疾病的机制有关，在病理研究和临床应用上都具有重要的意义。其中，血浆谷胱苷肽过氧化酶是血浆中最主要的过氧化酶，由肾脏合成后分泌到血浆中，负责血浆中所有过氧化物的还原反应(J.Biol.Chem，1994，Vol269(43)，27066-27073)。
人体中这四种谷胱苷肽过氧化酶都已发现。其中，人的血浆谷胱苷肽过氧化酶基因(pGPx)已经于1993年被Shinichi Y等人克隆(Gene，1994(145)，293-297)。
然而，在本申请之前，没有公开过本发明所涉及的人谷胱甘肽过氧化酶或其序列。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码谷胱苷肽过氧化酶基因家族的一个新成员，本发明新的人谷胱苷肽过氧化酶基因被命名为pGPxH。
本发明的另一个目的是提供一种新的谷胱苷肽过氧化酶蛋白家族成员，该酶被命名为pGPxH。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人谷胱苷肽过氧化酶的方法。
本发明还涉及这种人谷胱苷肽过氧化酶编码序列和多肽的应用。
本发明中新的蛋白与人的pGPx具有较高的同源性，它们在蛋白水平上有91％同一性。鉴于两者之间存在着一定的差别，因此将其命名为pGPxH。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从16-696位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的pGPxH蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人pGPxH蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人pGPxH蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人pGPxH蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人pGPxH蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人pGPxH蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为707个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于16-696位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、 纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“pGPxH蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中16-696位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框16-696位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中16-696位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，较佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人pGPxH相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“pGPxH蛋白多肽”指具有人pGPxH蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人谷胱苷肽过氧化酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括pGPxH蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与pGPxH DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗pGPxH多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含pGPxH多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了pGPxH多肽的可溶性片段。通常，该片段具有pGPxH多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供pGPxH蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然pGPxH多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人pGPxH保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表 1
本发明还包括pGPxH多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内pGPxH的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有pGPxH核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码pGPxH的核酸分子。
本发明还包括检测pGPxH核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于pGPxH多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对pGPxH DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于pGPxH基因产物或片段。较佳地，指那些能与pGPxH基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制pGPxH蛋白的分子，也包括那些并不影响pGPxH蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的pGPxH基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的pGPxH基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达pGPxH或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断pGPxH功能的抗体以及不影响pGPxH功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用pGPxH基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与pGPxH基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人pGPxH核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为707个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于16-696立核苷酸。该多核苷酸是如此获得的以人肾λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A5′-GCGCCCCAGCCCGCCATGGC-3′和反向引物B5′-ACGGCAATCAGTTACTTCCTC TTC-3′进行PCR，获得707bp的目的片段，测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
根据同源比较的结果，本发明的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列与不同来源的谷胱苷肽过氧化酶显示了显著的同源性，因此，这表明它是谷胱苷肽过氧化酶家族的一个新成员，并且具有谷胱苷肽过氧化酶家族蛋白的一些重要功能。
谷胱苷肽过氧化酶家族成员都以谷胱苷肽为还原剂，催化有机过氧化物和过氧化氢的还原，保护细胞在正常的氧代谢中不受到损伤(Nutri.Rev.，1980(38)，265-273)。具体机制是该家族成员均可将SOD歧化超氧自由基(·O2)而生成的H2O2转变成H2O而清除之，从而防止了羟自由基(·OH)、·O2产生，进而防止脂质过氧化物的生成(中国地方病学杂志，1991(6)，337)。本发明的pGPxH能降低过氧化物的毒性，因而可能与多种疾病的机制有关，在病理研究和临床应用上都具有重要的意义。
在附图中，

图1为本发明的人pGPxH与鼠pGPx(MpGPx)的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人pGPxH与鼠pGPx(MpGPx)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
图3为本发明的人pGPxH与人pGPx(pGPx)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1pGPxH的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人肾λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A5′-GCGCCCCAGCCCGCCATGGC-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B5′-ACGGCAATCAGTTACTTCCTCTTC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断为约700bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共707bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于16-696位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出pGPxH的氨基酸序列，共226个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用本发明的pGPxH的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与谷胱苷肽过氧化酶家族的成员具有很高的同源性。其中与人的血浆谷胱苷肽过氧化酶基因pGPx在蛋白水平上达到91％同一性，95％相似性(图3)，与鼠的血浆谷胱苷肽过氧化酶基因pGPx在核酸水平上达到98.4％同一性(图1)，在蛋白水平上达到97.8％同一性，98.2％相似性(图2)。因此，这表明本发明的新蛋白是一种新的血浆谷胱苷肽过氧化酶。
特别是在本发明的pGPxH的氨基酸序列中存在由通常意义上的终止密码子TGA所编码的硒代半胱氨酸(简称为“SeCys”)(SEQ ID NO.4中第73位氨基酸)。该TGA密码子在翻译时连读，从而使硒代半胱氨酸在蛋白翻译时就进入蛋白多肽链，而非后来的修饰形成的。
为了实现正确的解读TGA(在mRNA中为UGA)终止密码子，将硒代半胱氨酸插入硒蛋白，需要一套复杂的翻译机制。该机制在原核生物中已基本阐明(TIBS，1991(16)，463-467)，但真核生物中的机制还有待继续研究。已知，在原核生物中涉及四个基因，分别为SelA、B、C和D(TIBS，1991(16)，463-467)。由SelC编码一种特殊的tRNASer，这种tRNASer较通常的tRNA大，反密码子为与终止密码子UGA互补的UCA，携带的氨基酸为丝氨酸(Nature，1988(331)，723-725)。在由SelA编码的tRNASeCys(携带硒代半胱氨酸的tRNA)合成酶和硒磷酸酶的催化下，tRNASer转化为tRNASeCys(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990(87)，543-547)。由SelB编码的辅助因子既可以识别特定的UGA，又能与tRNASeCys特异性地结合(Nature，1989(342)，453-456)。在辅助因子的帮助下，tRNASeCys在UGA对应的位置上插入了硒代半胱氨酸。上述过程中，硒磷酸酶是由SelD编码的酶利用ATP和硒合成的(J.Bacteriol，1988(170)，540-546)。SelD被认为是表达硒蛋白的决定因子(Biomed.Environ.Sci.，1997(10)，163-176)。上述四种基因最初均在E.coli中发现，目前，除SelB外，其余三种基因均已在真核生物中找到同源基因，功能与原核生物中相似。
将终止密码子TGA翻译为硒代半胱氨酸是谷胱苷肽过氧化酶家族共同的结构特征(EMBO J，1986，Vol5(6)，1221-1227)，因此，这更确定了本发明的血浆谷胱苷肽过氧化酶属于该家族，并具有该谷胱甘肽过氧化酶家族蛋白的相关功能。
研究发现，本发明的pGPxH的5’端编码了一段信号肽(SEQ ID NO.4第24、25位氨基酸之间为切割位点)，与血浆谷胱苷肽过氧化酶在细胞内合成后分泌到血浆中这一特点符合。
研究表明，脂质过氧化物是不饱和脂肪酸酶解反应和非酶解反应的主要产物。它们是前列腺素、白三烯等生物活性分子合成过程中的中间物。脂质过氧化物可以与过渡金属复合物和金属蛋白质反应产生毒性很高的自由基(Cytochrome，1986，29-76，Plenum Press)。除自由基的毒性外，过氧化物的毒性还表现在它们在花生四烯酸级联反应中有调节酶活性的作用(N.Engl.J.Med.，1979(300)，1142-1147)。自由基和脂质过氧化物的形成，导致细胞膜损害，被认为是许多疾病的主要病因，如动脉粥样硬化、冠心病和糖尿病等心血管疾病。近年来研究已发现，动脉粥样病变伴随有脂质过氧化物水平的升高(微量元素与健康研究，1996，13卷1期，61-63)。在正常的代谢中，主要由过氧化酶将脂质过氧化物还原为相应的醇。谷胱苷肽过氧化酶家族成员均可将SOD歧化超氧自由基(·O2)而生成的H2O2转变成H2O而清除之，从而防止了羟自由基(·OH)、·O2的产生，进而防止脂质过氧化物的生成(中国地方病学杂志，1991(6)，337)。下列多种疾病的发生与该家族成员有关。如(1)在心脏中，该家族成员是消除H2O2的重要酶类。酶活性降低时，未被及时消除的活性氧使得细胞膜上不饱和脂肪酸活性氧化，生成脂质过氧化物，使心脏中脂质过氧化物的浓度增高，损害膜结构和功能，使膜的流动性与通透性异常，心肌对过氧化物的解毒能力明显减少，最终导致心肌细胞不可逆损伤，及主细胞坏死(中国地方病学杂志，1992，11(2)，81)。
(2)动脉粥样硬化以脂质代谢紊乱为特征，是冠心病等心脑血管疾病的病理基础。动脉粥样硬化患者体内脂质过氧化物浓度升高，易形成血栓，以及血管壁损伤区胆固醇沉积和血管平滑肌增生。体内含硒谷胱苷肽过氧化酶的活性增高能大量破坏在血管壁损伤处集聚的胆固醇，调节体内血脂代谢，防止或逆转动脉粥样硬化过程的发生(老年学杂志，1991，11(1)，49)。冠心病患者体内谷胱苷肽过氧化酶活性增加，可以减轻脂质过氧化作用，加速心肌梗塞细胞的修复过程，增加冠状血管的血流量，降低心肌耗氧量，有利于心肌细胞功能的改善。
谷胱甘肽过氧化酶家族成员的活性与微量元素硒有关，因为在所有谷胱苷肽过氧化酶的活性中心，硒以硒代半胱氨酸的形式连接在酶的肽链上。在临床应用上，可以在急需提高抗氧化能力的病患(如慢性肾衰、冠心病患者)体内增加硒的含量，调节过氧化酶活性。但在某些组织中，谷胱苷肽过氧化酶还原脂质过氧化物生成白三烯的前体，该前体参与如哮喘和类风湿性关节炎等炎症反应。因此在设计关节炎的药物中，可以考虑将谷胱苷肽过氧化酶的拮抗物作为减轻炎症的药物(J.Biol.Chem.，1984(259)，1043-1050)。
血浆谷胱苷肽过氧化酶是血浆中最主要的过氧化酶，血浆中几乎所有过氧化物的还原反应均由其负责(J.Biol.Chem.，1987，Vol262(36)，17398-17403)。由于血浆谷胱苷肽过氧化酶在血浆中的特殊位置，因此除上述该家族成员的共同功能外，血浆谷胱苷肽过氧化酶还特异性地与多种疾病的机制有关。如由于血浆谷胱苷肽过氧化酶的主要产生与分泌均在肾脏，因此与动脉硬化和尿毒症在肾衰病中的病理有关。慢性肾衰病人的肾内存在大量活性氧簇，抗氧化能力却下降，因而无法及时清除活性氧簇，使得活性氧簇对肾功能恶化的作用更为突出，具体的毒性表现为脂质过氧化、膜通透性增加、蛋白质生物活性受损、细胞受到广泛的损伤，功能减退或丧失，失去恢复与增殖能力。提高过氧化酶活性，可以改善慢性肾衰或者体内清除活性氧簇的能力延缓慢性肾衰的发展。(J.Lab Clin Med.，1994(124)，468-469)本发明新的血浆谷胱甘肽过氧化酶对于血浆谷胱苷肽过氧化酶的结构和功能的深入了解，以及病理研究和临床应用都具有重要的意义。
本发明的人pGPxH除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人pGPxH还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人pGPxH的C端与鼠的pGPx的C端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人pGPxH的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员，比如鼠pGPx蛋白)。
此外，本发明人pGPxH核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人pGPxH的表达水平或者抑制人pGPxH的过度表达。本发明的人pGPxH蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人pGPxH缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3pGPxH在大肠杆菌中的表达编码pGPxH的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中的PCR扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCGGATCCATGCAAGAGAAGTCTAAGA-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是起始密码子和从SEQ IDNO.3中第88位核苷酸开始的pGPxH编码序列的16个核苷酸(在SEQ ID NO.3中从第16位核苷酸(A)至第87位核苷酸(A)编码的是一段信号肽序列，在大肠杆菌中表达时将这段序列去除)；3’寡核苷酸引物序列为5’-GTTCGTCGACTTACTTCCTCTTGACCCCC-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和pGPxH的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和SalI消化pQE-9载体，随后将同样消化过的插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E-coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用ApaI酶切鉴定插人片段大小及方向，测序验证结果表明pGPxH的cDNA插入片段已正确装入载体。
过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中(在培养基中添加有10％胎牛血清和5ng/ml的亚硒酸钠)，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的pGPxH。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱pGPxH。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为23kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4pGPxH在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码pGPxH的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中的PCR扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCAAGCTTATGGCCCGGATCCTCCGGG-3′(SEQ ID NO.7)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的pGPxH编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’GTTCGGATCCTTACTTCCTCTTGACCCCC-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和pGPxH的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3载体，随后将同样消化过的插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证结果表明pGPxH的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆(并在培养基中添加10％胎牛血清和7.5ng/ml的亚硒酸钠。虽然在真核生物中硒代半胱氨酸掺入蛋白的表达机制尚未完全阐明，但研究表明，在培养基中提高硒的含量，就可显著地促进硒蛋白的表达(Biomed.Environ.Sci.，1997(10)，163-176))。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为25kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将如上获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀pGPxH基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称新的人谷胱苷肽过氧化酶、其编码序列及制法和用途(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GCGCCCCAGC CCGCCATGGC 20(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2ACGGCAATCA GTTACTTCCT CTTC24(2)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)长度707bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3GCGCCCCAGC CCGCCATGGC CCGGATCCTC CGGGATTCCT GCCTTCTGTC CCTGCTCCTG 60GCCGGGTTTG TTCCGCCGGG CCGGGGACAA GAGAAGTCTA AGACAGACTG CCATGGCGGT 120ATGAGTGGTA CCATCTACGA GTATGGAGCC CTCACCATCG ATGGGGAGGA ATACATTCCT 180TTTAAGCAGT ATGCAGGCAA ATATATCCTC TTTGTCAACG TAGCCAGCTA CTGAGGTCTG 240ACAGACCAAT ACCTTGAACT GAATGCACTA CAAGAAGAAC TTGGGCCATT TGGCTTGGTC 300ATTCTGGGCT TCCCTTCCAA CCAATTTGGC AAACAGGAGC CAGGCGAGAA CTCGGAGATA 360CTCCCCAGTC TCAAGTATGT TCGACCAGGT GGGGGCTTTG TGCCTAATTT CCAGCTCTTT 420GAGAAAGGAG ATGTGAACGG GGAGAAAGAG CAGAAATTCT ACACTTTCCT GAAGAACTCC 480TGTCCTCCCA CTGCAGAGCT CCTGGGCTCA CCTGGCCGCC TCTTTTGGGA ACCCATGAAG 540ATCCATGACA TCCGCTGGAA CTTTGAGAAG TTCCTGGTGG GGCCAGATGG TATACCGGTT 600ATGCGCTGGT ACCACCGGAC CACAGTCAGC AACGTCAAGA TGGACATCCT GTCCTACATG 660AGGCGGCAGG CAGCCCTGGG GGTCAAGAGG AAGTAACTGA TTGCCGT 707(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度226个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(A)描述/desc＝＂第73位的Xaa是由TGA编码的硒代半胱氨酸＂(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ala Arg Ile Leu Arg Asp Ser Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu 15Ala Gly Phe Val Pro Pro Gly Arg Gly Gln Glu Lys Ser Lys Thr 30Asp Cys His Gly Gly Met Ser Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala 45Leu Thr Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala 60Gly Lys Tyr Ile Leu Phe Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu 75Thr Asp Gln Tyr Leu Glu Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Gly 90Pro Phe Gly Leu Val Ile Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly 105Lys Gln Glu Pro Gly Glu Asn Ser Glu Ile Leu Pro Ser Leu Lys 120Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe 135Glu Lys Gly Asp Val Asn Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr 150Phe Leu Lys Asn Ser Cys Pro Pro Thr Ala Glu Leu Leu Gly Ser 165Pro Gly Arg Leu Phe Trp Glu Pro Met Lys Ile His Asp Ile Arg 180Trp Asn Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Val 195Met Arg Trp Tyr His Arg Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp 210Ile Leu Ser Tyr Met Arg Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg 225Lys 226(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGGATCC ATGCAAGAGA AGTCTAAGA 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TTACTTCCTC TTGACCCCC29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGGCCCGGA TCCTCCGGG29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TTACTTCCTC TTGACCCCC29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列。
4.一种分离的pGPxH蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有pGPxH蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成pGPxH蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成pGPxH蛋白的重组细胞；(c)在适合表达pGPxH蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有pGPxH蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸16-696位。
12.一种能与权利要求4所述的pGPxH蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及了一种新的谷胱苷肽过氧化酶基因家族的成员pGPxH。本发明提供了该新谷胱苷肽过氧化酶的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的新的人谷胱苷肽过氧化酶的方法。本发明还提供了这种新的人谷胱苷肽过氧化酶的应用。
文档编号C07H21/04GK1256312SQ9812197
公开日2000年6月14日 申请日期1998年10月29日 优先权日1998年10月29日
发明者余龙, 屠强, 傅强, 赵勇, 赵寿元 申请人:复旦大学