专利名称：一种新的人神经蛋白、其编码序列及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人NP17.3的cDNA序列，该核酸序列所编码的蛋白是小鼠神经蛋白NP15.6的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
神经蛋白是一类与神经功能密切相关、分子量中等以下的遍在蛋白，有内源性和外源性蛋白之分。前者由神经元的尼氏体内的小核糖核蛋白体合成，在神经元内物质运输及信号传导中发挥重要作用；后者由非神经细胞的核糖体合成，经修饰加工，运输到神经元，锚定于突触前膜或后膜，成为膜内在蛋白或游离于突触间隙，发挥神经元之间物质运输与信号传导的中转站作用，促进神经元的生长发育、成熟分化等代谢活动的进行及神经功能的发挥。近四年来，十几种神经递质转运蛋白和各种递质受体的cDNA已被克隆。
脑发育异常可以导致多种疾病，如脑过小、脑回缺乏等。75％胎儿致死和40％一周岁以内婴儿死亡的病例与脑发育异常有关。约3％新生儿有严重的脑或全身系统性缺陷；约5-15％儿科神经病例与颅脊柱畸形有关。在至少6％的病例中，染色体因子是致病原因。因此，研究脑发育过程中分子水平上的调控机制，以便在医学上有所应用便显得十分重要。
新生儿的脑仅重500g，神经元细胞的急剧增殖和迁移是哺乳动物胚胎发育后期的一个特点。在大鼠中，虽然神经元的增殖开始于胚胎发育的第12-13天，但在胚胎发育后期以及新生期该过程大大加快了，脑的大部分重量是在此阶段形成的。在人中，神经元细胞的快速增殖、迁移开始于受精后的8-10周，但脑的大部分体积和重量是在第14至38周间形成的。
在早期阶段监控脑发育过程是十分有用的。例如，这样就可以了解流产或新生儿神经系统缺陷是否是由异常的脑发育和/或神经元迁移所引起的；也可以了解孕妇子宫中的胎儿是否会受到异常的脑发育和/或神经元迁移的威胁，从而提出合理的建议。
胎脑细胞移植的方法已经在帕金森氏综合症(Parkinson′s Disease，PD)和早老性痴呆(Alzheimer′s Desease，AD)的治疗中显示了作用。此外，在Huntington氏舞蹈病、肌细胞萎缩侧向硬化症(amyltrophic lateral sclerosis，ALS)、遗传性共济失调(hereditary ataxia)的病例中，组织移植的方法也显示了相似的结果。在早老性痴呆(AD)的治疗中，转入基因工程细胞可以使人们对脑微观环境进行改造。在移植胎儿神经组织的过程中，监视组织是否正常发育是很有用的。
绝大多数生理功能会随着年龄而衰退，衰退的速度因组织的不同而不同。年龄也同样严重地影响着神经系统，尤其是神经元，这使得老年人有时看上去象是无助的孩子。从30岁到100岁，人的大脑质量平均下降233克。下降的原因可能是神经元的退化以及置换性神经胶质增生症(replacement gliosis)。位于额中部、上颞、下顶骨(parietal)区域的新大脑皮质区的大型神经元(＞90μM)的质量随年龄增长而下降，而小神经元(40-90μM)和神经胶质细胞则将随年龄增长而上升。
神经元的丧失在70岁后尤为显著。大于25％的海马神经元是在45-95岁间丧失的。有研究表明，衰老同样会导致神经元树突的减少，尽管这尚有争议，。这些形态上的改变可能是与随年龄增长的记忆力下降，学习能力丧失及神经元功能最终丧失的基本原因。
因此，无论对于衰老还是对于神经元退化性疾病，能再生神经元是十分有用的。在某些的神经元病症条件下，(如Huntington舞蹈病、早老性痴呆症和帕金森氏综合症)中，这种退化过程在某些神经病学人群中更为显著。尽管成人神经元生长退化的具体分子机制还不清楚，但很明显将大脑发育相关基因转入成人神经元从而使之再生(即重建胎儿期)已有较好基础。
衰老在细胞功能和分裂能力完全丧失时达到顶点。然而只有少部分人死于正常衰老。大多数人死于随着衰老而易感性不断提高的疾病。但是，即使引起老年人死亡的主要疾病如冠状动脉疾病、癌症被消除，人类期望寿命也只能相应地增加3年和2.5年。
Hayflick和Moorhead发现成纤维细胞的分裂次数是固定的。婴儿成纤维细胞约分裂50次，二十岁成人成纤维细胞分裂约30次，八十岁老人的成纤维细胞只分裂20次。大量的研究已经培养的衰老成纤维细胞作为研究衰老分子机制的模型。随着年纪的增加，细胞内大分子不断累积各种错误，如突变、端粒缩短、DNA甲基化不足、DNA修复损伤、蛋白交连和蛋白降解能力降低等。然而这些变化影响衰老的具体机制还不清楚。不可避免的衰老过程很可能与基因表达的改变有关，这种改变表现为基因的正调控，或负调控，或者两者兼有。
虽然在衰老过程中RNA总量发生了减少，但与年轻脑组织相比，衰老脑组织中mRNA的合成速度和稳定性并未降低。在年轻成纤维细胞和衰老成纤维细胞所构建的杂交细胞中，衰老表型是显性的。造成这种衰老显性表型的因子可能与衰老细胞中过度表达或表达不足的基因有关。衰老细胞中DNA合成起始过程所必需的c-fos基因的转录有缺陷。另外，c-fos的翻译后修饰的异常损害了其与c-jun结合形成AP-1转录因子复合物的功能。细胞周期控制基因cdc2和周期蛋白A和B在衰老细胞中表现为低水平或功能损伤。在衰老细胞中，鸟氨酸脱氢酶mRNA水平降低，翻译受阻，蛋白迅速降解。衰老细胞还表达抑制素和terminin，这两种蛋白在衰老细胞中被特异地诱导，这有可能是溶酶体蛋白水解作用的损伤引起的。
酵母是另一研究衰老的模型。Jazwinski等鉴定了几个在年轻和年老酵母细胞中呈差异表达的基因。衰老酵母细胞不表达在信号传导和细胞生长中起作用的ras-2基因，同时也不表达lag-1基因。有意义的是，lag-1基因的过度表达可延长生命期30％左右。在果蝇中也观察到了类似结果。最近，已表明果蝇种群中衰老速度存在遗传差异中可遗传的衰老率变异种群已被鉴定。
虽然已经发现和分离出了许多种与神经发育、衰老有关的基因，但是在申请之前，没有人公开或发表过本发明的NP17.3基因和蛋白。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码人神经蛋白，其分子量为17300Da，本发明的基因被命名为NP17.3(GenBank AccessionNo.AF064257)(注因申请保密一段时间，故在本申请之前该序列不对公众公开)。
本发明的另一个目的是提供一种新的蛋白，该蛋白被命名为NP17.3蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人NP17.3蛋白的方法。
本发明还提供了这种人NP17.3基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的NP17.3蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有NP17.3蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成NP17.3蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成NP17.3蛋白的重组细胞；(c)在适合表达NP17.3蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有NP17.3蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为595个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.5，其中开放读框位于19-480位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“NP17.3蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中19-480位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的编码框19-480位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.5中19-480位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.6所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下能与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人NP17.3相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.5中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“NP17.3蛋白多肽”指具有NP17.3蛋白活性的SEQ ID NO.6序列的多肽。该术语还包括具有与人NP17.3相同功能的、SEQ ID NO.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括NP17.3蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与NP17.3DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗NP17.3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含NP17.3多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了NP17.3多肽的可溶性片段。通常，该片段具有NP17.3多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供NP17.3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然NP17.3多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括NP17.3多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内NP17.3的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有NP17.3多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码NP17.3的核酸分子。
本发明还包括检测NP17.3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于NP17.3多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对NP17.3DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于NP17.3基因产物或片段。较佳地，指那些能与NP17.3基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制NP17.3蛋白的分子，也包括那些并不影响NP17.3蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的NP17.3基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的NP17.3基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达NP17.3或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断NP17.3功能的抗体以及不影响NP17.3功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用NP17.3基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与NP17.3基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人NP17.3核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。
在本发明中，人NP17.3的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物C5′-CTAGCTTCTCCAGGACTGTGGTC-3′和反向引物B5′-AATCCACGAGACTCTTCTCCAGTC-3′，进行PCR，获得450bp的目的片段。用α32P-dATP标记此片断，并对睾丸λgt11cDNA文库进行筛选。挑选向两端延伸最长的克隆进行测序，得到SEQ ID NO.5的全长cDNA序列。
在附图中，
图1为本发明的人NP17.3蛋白(NP17.3P)与NP15.6蛋白(NP15.6P)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“｜”标出，相似的氨基酸用“.”标出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1NP17.3的cDNA的克隆和测序1.引物扩增以人睾丸λgt10cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸C5′-CTAGCTTCTCCAGGACTGTGGTC-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B5′-AATCCACGAGACTCTTCTCCAGTC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR，PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1.5分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的450bp目的片段。
2.探针及其标记以如上获得的PCR目的片段为探针，用α-32P-dATP(DuPont公司)对其进行PCR引物标记，条件如上。
3.cDNA文库扩增及印迹标记(筛选文库)将人睾丸λgt10cDNA文库进行扩增，克隆数达50万个，然后将扩增好的cDNA文库印迹到Hybond TM-N+尼龙膜上(Amersham)，再将标记好的探针变性后与印迹膜杂交，洗膜，放入带增感屏的片夹，与FUJI MEDIAIX光胶片于-80℃下进行放射自显影，72小时后冲片。
4.挑取克隆及初筛克隆的复筛通过上述杂交筛选获得89个初筛阳性克隆，用上述相同的探针杂交和筛选过程对这89个阳性克隆进行复筛，最终得到19个阳性单克隆。
5.单克隆的鉴定和测序以上述步骤4中得到的单克隆噬菌体为模板，用上述步骤1的两个正反引物分别与λgt10左右臂上的引物λgt10EF及λgt10ER(EF5′-AGCAGCCAGTCAACACTTACG-3′SEQ ID NO.3；ER5′-GAGTTTGCATATCGCCTCCATC-3′SEQ ID NO.4)进行搭配扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，以判断每个克隆从探针出发向5′或3′步移(延伸)的长度，从中选出向5′延伸最长和向3′延伸最长的克隆。将这两个克隆EF，ER扩增产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM109，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共595bp，详细序列见SEQ ID NO5，其中开放读框位于19-480核苷酸根据得到的cDNA序列推导出NP17.3的氨基酸序列，共153个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO6。
实施例2NP17.3的表达谱分析和染色体定位多种组织Northern(MNTTM)印迹膜(16种组织)购自Clontech公司，以上实施例1步骤中的450bp克隆片段为探针，探针的标记方法同实施例1步骤2，Northern杂交按用户手册操作。
16种组织的Northern杂交结果显示NP17.3基因为广谱表达基因，在心、脑、胎盘、睾丸、卵巢、结肠、脾、胸腺、小肠、外周血白细胞、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、前列腺16种组织中均有表达，表达量稍有差异，在骨骼肌最高，心脏中次之，胰腺中居第三，肺最低。
通过人/鼠体细胞杂种系DNA Southern印迹膜杂交，将该基因定位于人第3号染色体，进一步用荧光原位杂交法(FISH法)将之精细定位于3q32。
实施例3同源比较和结构研究用NP17.3基因的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们与小鼠神经蛋白NP15.6显示了极高同源性。用PCGENE软件进行分析，它与NP15.6在蛋白水平上的同一性和相似性分别达到了81.2％和88.0％。根据结构决定功能，结构相似功能相似的原理，有理由相信本发明的蛋白质也是一个神经蛋白，并在神经系统的发育中起作用。
根据对本发明的蛋白质结构分析推测，本发明的NP17.3蛋白为一跨膜蛋白，极可能定位于突触前膜或后膜，在神经元间物质运输和神经信号传导中发挥重要的中转站作用。有鉴于此，除了能利用本发明的蛋白制备的抗体进行免疫机能的基础研究外，还可以将之制成药物用于神经系统机能障碍及病变的临床治疗，因而将具有广阔的市场前景。
本发明的人NP17.3除了可作为神经蛋白家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人NP17.3还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人NP17.3的N端与人NP15.6的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人NP17.3的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人NP17.3核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人NP17.3的表达水平或者抑制人NP17.3的过度表达。本发明的人NP17.3蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人NP17.3缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例4NP17.3在大肠杆菌中的表达编码NP17.3的DNA序列(GenBank Accession No.AF069054)用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，进行扩增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-GCATGGATCCATGG CGGCTGGGCT GTTTG-3′(SEQ ID NO.7)，其含有BamH1限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的NP17.3编码序列的19个核苷酸；3′寡核苷酸引物序列为5’-TTCCGTCGACTCAC TCATCCTCTG GCAGC-3′(SEQ ID NO.8)，其含有SalI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和NP17.3的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。用BamHI和SalI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽体质粒，测序验证NP17.3的cDNA片段已正确插入载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物阳性转化子的克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞至600光密度(OD600)为0.4-0.6，随后加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的NP17.3。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱NP17.3。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pHS.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定出表达蛋白的分子量约为17kDa.
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO6的序列一致。
实施例5NP17.3在真核细胞(CHO细胞株)中的表达参照实施例3，编码NP17.3的DNA序列(GenBank Accession No.AF069054)用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-GCATGGATCCATGG CGGCTGGGCT GTTTG-3′(SEQIDNO.7)，其含有BamH1限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的NP17.3编码序列的19个核苷酸；3′端寡核苷酸引物序列为5’-AGTCCTCGAGTCACTCATCCTCTGGCAGC-3′(SEQ ID NO.9)，其含有XhoI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和NP17.3的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(flori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序、。用BamHI和XhoI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证NP17.3的cDNA片段已正确插入载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存备用。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定出表达蛋白的分子量约为17kDa.
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO6的序列一致。
实施例6制备抗体将实施例4和5中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人NP17.3基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称一种新的人神经蛋白、其编码序列及制备方法(iii)序列数目9(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度23核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CTAGCTTCTC CAGGACTGTG GTC 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度24核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AATCCACGAG ACTCTTCTCC AGTC 24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征
(A)长度21核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3AGCAGCCAGT CAACACTTACG 21(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度22核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GAGTTTGCAT ATCGCCTCCA TC 22(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度595bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO51 CCTGCAGCAC CATCTGTCAT GGCGGCTGGG CTGTTTGGTT TGAGCGCTCG CCGTCCTTTG61 GCGGCAGCGG CGACGCGAGG CCTCCCGGCC GCCCGCGTCC GCTGGGAATC TAGCTTCTCC121 AGGACTGTGG TCGCCCCGTC CGCTGTGGCG GGAAAGCGGC CCCCAGAACC GACCACACCG181 TGGCAAGAGG ACCCAGAACC CGAGGACGAA AACTTGTATG AGAAGAACCC AGACTCCCAT241 GGTTATGACA AGGACCCCGT TTTGGACGTC TGGAACATGC GACTTGTCTT CTTCTTTGGC301 GTCTCCATCA TCCTGGTCCT TGGCAGCACC TTTGTGGCCT ATCTGCCTGA CTACAGGATG361 AAAGAGTGGT CCCGCCGCGA AGCTGAGAGG CTTGTGAAAT ACCGAGAGGC CAATGGCCTT421 CCCATCATGG AATCCAACTG CTTCGACCCC AGCAAGATCC AGCTGCCAGA GGATGAGTGA481 CCAGTTGCTA AGTGGGGCTC AAGAAGCACC GCCTTCCCCA CCCCCTGCCT GCCATTCTGA541 CCTCTTCTCA GAGCACCTAA TTAAAGGGGC TGAAAGTCTG AAAAAAAAAA AAAAA(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度153氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO61 Met Ala Ala Gly Leu Phe Gly Leu Ser Ala Arg Arg Pro Leu Ala16 Ala Ala Ala Thr Arg Gly Leu Pro Ala Ala Arg Val Arg Trp Glu31 Ser Ser Phe Ser Arg Thr Val Val Ala Pro Ser Ala Val Ala Gly46 Lys Arg Pro Pro Glu Pro Thr Thr Pro Trp Gln Glu Asp Pro Glu61 Pro Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Lys Asn Pro Asp Ser His Gly76 Tyr Asp Lys Asp Pro Val Leu Asp Val Trp Asn Met Arg Leu Val91 Phe Phe Phe Gly Val Ser Ile Ile Leu Val Leu Gly Ser Thr Phe106 Val Ala Tyr Leu Pro Asp Tyr Arg Met Lys Glu Trp Ser Arg Arg121 Glu Ala Glu Arg Leu Val Lys Tyr Arg Glu Ala Asn Gly Leu Pro136 Ile Met Glu Ser Asn Cys Phe Asp Pro Ser Lys Ile Gln Leu Pro151 Glu Asp Glu(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度29核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GCATGGATCC ATGGCGGCTG GGCTGTTTG29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度29核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8TTCCGTCGAC TCACTCATCC TCTGGCAGC29(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度29核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9AGTCCTCGAG TCACTCATCC JTCTGGCAGC 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.6所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列是SEQ ID NO.5中核苷酸19-480位的序列。
4.一种分离的NP17.3蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有NP17.3蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成NP17.3蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成NP17.3蛋白的重组细胞；(c)在适合表达NP17.3蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有NP17.3蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.5中从核苷酸19-480位。
12.一种能与权利要求4所述的NP17.3蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说,本发明提供了人NP17.3的cDNA序列, 该核酸序列所编码的蛋白是小鼠神经蛋白NP15.6的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C07K16/18GK1249343SQ98121909
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月28日 优先权日1998年9月28日
发明者余龙, 龚若沐, 高洁, 崔映宇, 赵寿元 申请人:复旦大学