专利名称：奶牛性别决定区基因核心序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物养殖中的育种，使用奶牛性别决定区基因核心序列作为检测奶牛胚胎性别的物质。
选择性别确定的动物胚胎进行移植，在动物育种工作中有重要意义。以奶牛场为例，移植雌性奶牛胚胎，尽可能多地获得母牛，可以大大提高牛奶年产量；同样以育种为目的的种牛场，由于母牛的繁殖能力远远小于公牛，通过控制子代性别，可以提高繁育工作效率。而以肉牛供应为目的的农场，则需要尽可能多地获得公牛。
为此，需要某种方法以确定动物胚胎的性别。Welshons等(Welshons WJ.，PNAS，1959，45560-566)首先发现Y染色体是雄鼠的性别决定因素。在其它动物，如人(Jacobs PS.，Nature，1959，183302-303；Ford CE，et al.Lancet，1959，I，711-713)的性别也是由Y染色体决定的。通过对保守区的分析，1966年将性别决定区定位于Y染色体短臂(Jacobs PA.，Nature 1966，210；352-354).1986年Page(Page DC.，Cold spring Harb Symp.quant.Bial，1986，51229-235)分析了46，XX男性的X染色体，通过缺失分析方法，把性别决定因子限定在更小的一个范围内。由于分析技术的发展，以及对一些更特殊的性别畸形病人的分析，1990年，科学家成功地将性别决定因子定位在一个编码80个氨基酸保守基序、不足250bp长的一段DNA序列内，并命名为性别决定区(SRY)，(SinclairAH，et al.Nature 1990，346，279-281，Gubbay J.Nature，1990，346，245-250).Koopman等将含Sry基因的14kb小鼠DNA片段注射到XX的雌性鼠胚内，结果获得了XX性反转的雄性鼠(Koopman P.Nature 1991，351117-121)，确定了Sry基因在性别决定中的作用。通过测序分析表明，人的SRY基因与鼠的Sry基因有80％的同源区。
由于SRY基因核心序列不足250bp，因而有可能通过PCR方法检测动物胚胎SRY基因的有无，以确定胚胎的性别。
本发明的目的是提供奶牛SRY基因核心序列，并使用该序列用作检测奶牛胚胎性别的物质，应用PCR技术检测胚胎。该使用方法灵敏、可靠、快速，可在现场应用。
本发明提供的奶牛SRY基因的核心序列是采用直接测序技术测定。
利用哺乳动物SRY基因进化上十分保守的特点，本发明根据已经发表的人、鼠、兔子的SRY基因序列，设计合成了引物1、2(序列见表1)。以奶牛基因组DNA为模板，加入含有引物1、2的PCR扩增体系中进行PCR扩增(详见实施例1)。扩增产物进行凝胶电泳分析。结果雄性奶牛有长度为208bp的扩增带，而雌性奶牛无扩增产物(图2)。证明该PCR引物对对奶牛性别是特异的。以雄性奶牛基因组DNA为模版，以双链DNA循环测序法，应用引物1或引物2对SRY基因进行直接测序，测出奶牛SRY基因的核心序列190bp，其核心序列见图1。
根据得到的奶牛SRY基因核心序列，本发明设计合成了特异于奶牛SRY基因的引物3、引物4(序列见表1)，用于奶牛胚胎SRY基因的PCR方法检测。引物3和引物4序列的位置见图1。以此引物对奶牛基因组DNA进行扩增，出现127bp扩增条带的样本，即代表为雄性奶牛，由此可以鉴定奶牛胚胎的性别。为了排除PCR假阴性结果，本发明在PCR扩增时设置了内对照，即同时扩增所有奶牛体内都存在的β珠蛋白基因片段。本发明以引物PCO3、PCO4对奶牛β珠蛋白基因进行PCR扩增，扩增产物长110bp。通过对奶牛胚胎基因组DNA进行PCR扩增和扩增产物分析，就能对奶牛胚胎性别进行鉴定(图3)。
本发明提供了奶牛性别决定区基因核心序列，并使用该序列作为检测奶牛胚胎性别的物质，应用PCR技术检测胚胎，该使用方法灵敏、快速，可在现场应用；由于设计了内对照，可排除PCR假阴性错误，保证鉴定结果可靠。应用本发明共对109枚奶牛胚胎进行了性别鉴定，结果显示出生的牛犊性别与胚胎鉴定结果完全一致。
表1引物 序列1 5’-CATTCATCGTGTGGTCTCGCGA-3’2 5’-GCCTTCCGACGAGGTCGATACT-3’3 5’-TCAGCAAGCAGCTGGGATATG-3’4 5’-CGAGGTCGATACTTATAGCCC-3’PCO3 5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’PCO4 5’-GGTGAACGTGGATGAAGTTG-3’下面通过附图和实施例对本发明进行进一步的阐述。
图1是本发明提供的奶牛SRY基因的190bp核心序列。图中有下划线的为引物3和引物4序列的位置。
图2是本发明用引物1和引物2，PCR方法扩增奶牛SRY基因电泳分析图MDNA分子量标准；1，2，3，4，6泳道为雌性母牛，5，7泳道为公牛；208bp为雄性奶牛SRY基因PCR方法扩增特异条带，110bp为内对照基因(奶牛β珠蛋白基因)PCR扩增特异条带。
图3是本发明应用引物3和引物4，PCR方法扩增奶牛SRY基因，以鉴定胚胎性别的电泳分析图。
MDNA分子量标准；1，2，3，4，6泳道为雌性奶牛胚胎；5，7泳道为雄性奶牛胚胎。127bp为雄性奶牛SRY基因PCR扩增特异条带，110bp为内对照基因(奶牛β珠蛋白基因)PCR扩增特异条带。
实施例1 PCR方法扩增奶牛SRY基因抽取雄性及雌性奶牛外周血10ml，抽提全血DNA。根据公开发表的人、鼠、兔子的SRY基因序列，选取进化上十分保守的片段序列，合成下列2个引物。
引物15’-CATTCATCGTGTGGTCTCGCGA-3’引物25’-GCCTTCCGACGAGGTCGATACT-3’各取雄性及雌性奶牛全血DNA 2.5ng为PCR扩增模版，加入到PCR反应管中，再各加入上述引物1和引物2各1ul，以及Taq酶1U、PCR标准缓冲液1ul和dNTP(2.5mM)2.5ul；同时加入引物PCO3和PCO4以扩增内对照基因(即奶牛β珠蛋白基因)。以蒸馏水将反应总体积补充到25ul，置PCR循环仪中，以下述条件进行PCR扩增90℃变性1分钟，55℃退火2分钟，70℃延伸2分钟。共进行35个循环。
反应产物在3％NuSieve琼脂糖凝胶版上电泳，条件为80V，3小时。凝胶经溴化乙锭染色后，在紫外灯下观察，如图2所示雄性奶牛均出现208bp长的特异条带，雌性奶牛均无此条带，但是，所有电泳泳道均出现110bp长的内对照基因扩增条带。
实施例2，奶牛SRY基因双链DNA循环测序(参考文献Murray V，Nucleic Acids Res.，1989，17(21)8889)以末端标记法标记测序引物(即上述引物1和引物2)。取标记引物各1pmol，5×激酶缓冲液1ul，(γ-32P)ATP 1ul，T4多聚激酶1U，在37℃温度下反应30分钟，再置55℃，5分钟终止反应，置冰浴中备用。
取雄性奶牛模板DNA 50 fmol，标记引物1(或引物2)1 pmol，10×Taq测序缓冲液2.5ul，TaqDNA聚合物2.5u，制成预反应液，混匀离心后将预反应液分装为每管8ul，然后分别加到含有4种dNTP和1种dd NTP的标记为G，A，T，C的4个反应管中，置热循环仪进行PCR扩增90℃变性1分钟，55℃退火2分钟，70℃延伸2分钟，30个循环。
G，A，T，C的4个反应管置90℃变性5分钟，立即进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒电流27mA，电泳3小时。凝胶放射自显影后冲片分析。结果读出190bp奶牛核心序列(见图1)。
实施例3，奶牛胚胎性别鉴定用冲胚方法收集的奶牛胚胎，或体外受精方法得到的受精卵，经体外培养，发育成约含64细胞的奶牛胚胎。取奶牛胚胎在显微注射仪下切割，其中5～6个牛胚胎细胞用于性别鉴定，其余放回培养箱继续培养。用于性别鉴定的胚胎细胞先用生理盐水洗涤，然后加入4倍去离子水，并在沸水中加热10分钟，台式高速离心机上离心2分钟，吸出上层的胚胎DNA释出液。
根据奶牛SRY基因核心序列，设计特异于奶牛SRY基因的2个引物引物35’-TCAGCAAGCAGCTGGGATATG-3’引物45’-CGAGGTCGATACTTATAGCCC-3’以胚胎DNA释出液为模板，用引物3、引物4配对进行PCR扩增DNA3～5ul，dNTP(2.5mM)1ul，Taq酶1U，标准缓冲液1ul，引物3及引物4各1ul，反应总体积以水加至25ul。PCR扩增条件为94℃、60秒变性，55℃、45秒退火，72℃、60秒钟延伸，置PCR循环仪中，共进行35个循环扩增。
扩增产物8ul进行2％琼脂糖凝胶电泳，条件为100V，电泳1小时。凝胶经溴化乙锭染色后，紫外灯下观察SRY特异条带，如图3显示，雄性奶牛胚胎显示127bp长特异性扩增条带，而雌性奶牛胚胎无此扩增条带。
胚胎性别鉴定结果与出生的牛犊性别证实是相一致的。
权利要求
1.一种奶牛性别决定区(SRY)基因核心序列，其特征在于该SRY基因的190bp核心序列如下所示148 TGAACGAAGACGAAAGGTGGCTCTAGAGAATCCCAAAATGA189 AAAACTCAGACATCAGCAAGCAGCTGGGATATGAGTGGAAA230 AGGCTTACAGATGCTGAAAAGCGCCCATTCTTTGAGGAGGC271 ACAGAGACTACTAGCCATACACCGAGACAAATACCCGGGCT312 ATAAGTATCGACCTCGTCCCGGAACG
2.按权利要求1所述的奶牛SRY基因核心序列的应用，其特征在于该SRY基因核心序列是用作检测奶牛胚胎性别的物质。
3.根据权利要求2所述的奶牛SRY基因核心序列的应用，其特征在于该序列作为检测奶牛胚胎性别的物质使用时，加入特异于奶牛SRY基因的引物3(5’-TCAGCAAGCAGCTGGGATATG-3’)和引物4(5’-CGAGGTCGATACTTATAGCCC-3’)，用PCR技术检测胚胎。
全文摘要
本发明提供奶牛性别决定区(SYR)基因的190bp核心序列,并使用该序列用作检测奶牛胚胎性别的物质。通过设计合成特异于奶牛SRY基因的引物,采用PCR技术检测奶牛胚胎性别。该使用方法快速、准确、灵敏,可在生产现场应用。
文档编号C07H21/04GK1249339SQ9812190
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月25日 优先权日1998年9月25日
发明者曾溢滔, 黄淑帧 申请人:上海麦克辛生物医学有限公司