专利名称：10－羟基－△2－癸烯酸的提取及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于10-羟基-Δ2-癸烯酸的提取，具体涉及10-羟基-Δ2-癸烯酸的物理提取方法及其应用。
蜂王浆具有免疫调节，抗菌，抗炎，抗癌等作用在国际国内已被公认，科学实验证明蜂王浆中起主要作用的物质是10-羟基-Δ2-癸烯酸，通用代号为10-HDA。以下用10-HDA因此如何获取高纯度的10-HDA和对其的利用，一直是世界各国科学工作者研究探索的问题。通过武汉市医学信息中心的查新检索与10-HDA提取密切相关的文献有3篇，其中有“在XE-60柱上分离及测定蜂王浆中10-羟基-Δ2癸烯酸”、“(E)-10-羟基-2癸烯酸分离鉴定及其抗辐射作用”、“10-羟基-2-癸烯酸含量测定方法评价”。外文未见相同报道；中方所检文献有与提交课题所述的提取蜂王浆中10-HDA的相似报道，但未见蜂王浆保持研究及将10-HAD提纯后加入其它中药配制成复方制剂的相同报道。
在所检与10-HDA提取有关的文献中，其公开了的提取方法的是化学方法。但此方法提取的10-HDA的稳定性尚待探索，它只适用于实验室使用。如何使10-HDA形成产品得以充分利用尚未有文献公开。也未有文献公开10-HDA的物理提出方法。
本发明的目的在于提供一种用物理方法从蜂王浆中提取10-羟基-Δ2-癸烯酸的方法。本发明的另一个目的是应用10-羟基-Δ2-癸烯酸与中药配伍制成复方制剂。
为实现本发明的第一个目的，对蜂王浆进行以下处理(1)蜂王浆的消毒处理，杀死其中的耐酸菌；(2)在保温条件下，使蜂王浆中的10-HDA充分结晶；(3)将蜂王浆中结晶的10-HDA分离出，然后进行纯化，乳化处理；(4)利用冷冻真空干燥设备进行干燥处理，得到10-HDA原粉。
国内外专家学者都认为10-HDA具有多功能锡免疫调节作用，有较强的抗癌抑制细胞生长，扩散的作用。具有抑菌和杀菌作用，具有抗炎作用。以此方法提取的10-HDA不受化学漂剂的污染，保持它的纯天然性。但单独服用后，容易产生便秘的副作用。所以须与其它物质配伍使用。以此方法提取的10-HDA稳定性好，可长期保存。
为实现本发明的另一个目的，提出对10-HDA的应用是与中药配伍制成复方制剂，其中中药的重量比为0.012～0.09∶4。中药由当归、黄芪和天花组成，其重量比为0.6∶2.4∶1。
选用的当归有补血，调经、活血止痛、润肠通便的功效(中药学)。德国研究人员研究指出当归中AR-1具有重要抗肿瘤作用。AR-1用量在1.6-100mg/kg时可有效抗S-180腹水瘤，IMC癌并发现当归热水提取物尚有诱导干抗素产生活性(抗癌中药大辞典)。
黄芪的药理作用在于补气升阳，固表止汗，托疮生肌，利水消肿。黄芪有增加要体免疫功能，促进抗体生成，还能保护肝脏，增加血细胞，提高肿瘤细胞内环磷酸甘的含量能抑制肿瘤细胞产生，甚至使肿瘤细胞逆转，对一些致癌性病毒的入侵和复制亦显示出阻碍作用，亦可能发挥抗肿瘤作用(抗癌中药大辞典)。
天花粉的药理作用在于利小便，消於血、轻身益气等作用。
选用当归、黄芪、天花粉等中药有效地克服了用10-HDA后产生的便秘的副作用，同时强化了10-HDA的作用。
对当归、黄花、天花粉的处理可采用精洗浸泡、在生物发酵设备中进行104℃煮沸保持30分钟，60℃保持90分钟，40℃保持6小时以后来菌软化，用胶体磨进行乳化处理、提取药汁、过滤去渣、浓缩成乳剂、冷冻干燥、粉碎、分装等工艺。
图1 10-HDA的提出工艺图。
图2中药处理工艺图。
图3沙门氏菌试验流程图。
图4霉菌总数测定程序图。
实施例1、10-HDA的提取(1)采用60钴消毒工艺将蜂王浆中的耐酸菌杀死。
(2)在温度25～35℃的条件下、保持48小时，使蜂王浆中的10-HDA充分结晶。
(3)以100目过滤结晶物后，漂洗并高速离心纯化结晶物，再用胶体磨进行乳化处理。
(4)在-40℃条件下对乳化物进行冷冻后升温至35℃干燥处理；冷冻干燥全过程为18小时对干燥物进行粉碎，以每粒70mg含量分装入胶囊中。
2、与中药配伍和复方制剂为克服10-HDA的副作用，以10-HDA70mg与4g中药配伍混合制成复方制剂，中药由当归0.6克，黄芪2.4克，天花粉1克组成。中药按前述如图2工艺处理。
按以上方法得到的10-HDA的复方制剂的技术要求及检测如下卫生指标按国家卫生部规定指标进行生产。
(1)原料要求1、蜂王浆新鲜具有光泽感，无腐败变质。
2、中药部份干货、新鲜、无霉变、虫蛀等。
(2)感官要求1、10-HDA为白色细粉，微酸涩。
2、中药部份为淡棕色细粉，气味纯正、味甘微苦。(3)卫生要求理化指标铅＜0.5 砷＜0.3水份不超过5％菌落总数(Cfu/g)＜1000大肠菌群(cfu/g)＜40致病菌不得检出霉菌(cfu/g)＜25酵母(cfu/g)＜25(4)卫生指标的检测方法1、对含铅的测定采用无火焰原子吸收法。2、对含砷的测定采用氢化物原子吸收法。3、常见致病菌--沙门氏菌检验方法。国家规定标准方法包括五个阶段的系统鉴定。1、前增菌用无选择性的培养基使于濒死亡状态的沙门氏菌复活力；2、选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖，而大多数其他菌受到抑制；3、选择性平板分离沙门氏菌4、生化试验和A-F多价D群血清的凝集试验，鉴定到属；5、血清学分型鉴定。试验过程如图34、对大肠肝菌检验方法一般分为三步法第一步初发酵试验第二步平板分离第三步复发酵试验试验具体方法采用九管法，即选用三个稀释度每个稀释度接种三管。
判定标准1)初发酵试验中若所有乳糖胆盐发酵管都不产生，则可报告为“大肠肝菌群阴性”2)初发酵试验中凡产气者经平板分离后，取可疑菌落染色镜检，同时做复发酵。
试验一(一)凡乳糖复了酵管产气，革兰氏染色为阴性，无芽胞杆菌，即可报告为“大肠菌群阴性”。(二)如乳糖管不产气或革兰氏染色阳性，则报告为“大肠菌群阴性”。
报告根据证实试验(复发酵试验)确认为大肠菌群阳性的管数，查大肠菌群最可能数检索表，即可报告每100克检样内大肠菌群最可能数。
5、霉菌总数测定方法(一)检样处理、(二)样品稀释及培养、(三)菌落计数一、检验程序如图4(5)10-HDA复方制剂的免疫调节测定方法1、样品处理。样品为淡棕色粉未，以无菌蒸馏水按试验所需浓度配制作用。
2、动物。昆明种雄小鼠18-22克，200只湖北省医学实验动物中心提供。
动物批准号为鄂动医字19-0073、分组。剂量分组为低、中、高剂量分别以0.7、1.4、2.8g/kg.bwr 10-HDA复方制剂灌胃；相当于人体的摄入量的5、10、20倍。空白对照组，灌胃蒸馏水；灌胃一月，然后进行各项试验。
4、实验方法
4.1试验前后动物体重记录。
4.2对动物淋巴器官/体重比值的影响。
4.3 CONA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验方法MTT法(步骤同功能实验程度规定)4.4二硝基氟笨(DNFB)诱导迟发型变态反应(DTH)方法耳肿胀法，用DNFB致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻击右耳，24H后处死动物剪下左右耳壳，用打孔器取下下径8mm的耳片称重，以左右耳重量之差来表示DTH的程度。
4.5血清溶血素的测定方法血凝法按照功能实验程序操作，根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数。
4.6腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验方法半体内法。制备20％的鸡红细胞悬胞悬液，每只鼠腹腔注射1ml，该悬液30min后处死动物，将其仰位固定于鼠板上，开腹，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2片载玻片上，37℃温育30min；育毕用生理盐水漂洗，凉干，以1∶1的丙酮甲醇液固定，4％Giemsa--磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗凉干，油镜下计数100个巨噬细胞按下式计算吞噬率和吞噬指数。
4.7小鼠碳廓清试验方法依程序规定的方法，根据注入墨汁2min、10min后血中炭浓度(测吸收光质)计算出各组小鼠的吞噬指数。
10-HDA复方制剂卫生评价是按卫生部对保健品特制的卫生要求进行生产的。本实施例中，所得到的10-HDA的复方制剂的卫生要指标为铅(mg/kg以As计) ＜0.5砷(mg/kg以Pb计) ＜0.3菌落总数(Cfu/100g)＜10致病菌未检出大肠菌群(Cfu/100g)＜30霉菌(Cfu/g)＜10酵母(Cfu/g) ＜10对本实施例的10-HDA复方制剂免疫调功能调节测定结果如下1、见表1各动物间体重无明显差异表1试验前后动物体重记录(克X±S)组别剂量 动物数 体重 增重(g/kg.bw)(只) 试验前 试验后 (克)空白组0 1018.7±2.029.0±2.510.4±1.8低剂量组 0.71019.1±1.330.7±1.911.5±1.5中剂量组 1.41019.6±1.630.6±2.011.0±2.1高剂量组 2.81018.4±1.629.7±2.511.1±1.02、见表2各动物间胸腺/体重比值和脾脏/体重比值无明显差异。表2对动物淋巴器官/体重比值的影响(X±S)组别 剂量 动物数 胸腺/体重比值 脾脏/体重比值(g/kg.bw)(只)(X10-9) (X10-9)空白 0 103.13×0.495.33×0.83低剂量组 0.7103.20×0.385.18×0.68中剂量组 1.4103.22×0.415.24×0.48高剂量组 2.8103.32×0.235.26×0.443、从表3可见与对照组比较10-HDA复方制剂低、中、高剂量组显著性增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力。表3；10-HDA复方制剂对小鼠细胞免疫功能影响组别 剂量 注ConA诱导脾淋巴细胞增殖 DNFA诱导DTH(g/kg.bw) N OD差值 N左右耳重量差(mg)空白组 010 0.033±0.005 1019.6±2.28低剂量组 0.7 10 0.044±0.008#1023.2±2.70中剂量组 1.4 10 0.056±0.011#1027.6±2.87高剂量组 2.8 10 0.042±0.006#1022.1±2.15注取0.1测定OD570值对照组比较*P＜0.05#P＜0.014见表3可以与对照组比较10-HDA复方制剂低、中、高剂量显著性增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应。
5从表4可见与对照组比较10-HDA复方制剂低、中、高剂量组可显著性升高血清溶血素含量。
表4:10-HDA的复方制剂对小鼠体液免疫功能的影响组别剂量 动物数 血清溶血素(g/kg.bw) (只)(抗体积数)对照组0 10 92.6±17.48#低剂量组 0.710150.3±32.69#中剂量组 1.410156.9±35.11#高剂量组 2.810148.7±41.17#与对照组比较*P＜0.05#P＜0.016从表5可见10-HDA复方制剂低、中、高剂量组吞噬百分数。
吞噬指数均明显高于正常对照组。表5:10-HDA复方制剂对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响组别剂量动物数吞噬百分率 吞噬指数(g/kg.bw) (只) (％)对照组0 10 42.9±4.060.449±0.041低剂量组 0.710 51.8±4.210.551±0.04#中剂量组 1.410 56.4±3.440.592±0.04#高剂量组 2.810 49.2±3.89# 0.514±0.04#与对照组比较#P＜0.017从表6可见10-HDA复方制剂低、中、高剂量组可显著性提高小鼠碳廓清吞噬指数。表6:10-HDA复方制剂对小鼠碳廓清功能影响组别剂量(g/kg.bw)动物数(只)吞噬指数对照组 010 6.077±0.58低剂量组0.7 10 7.671±0.54#中剂量组1.4 10 7.902±0.78#高剂量组2.8 10 7.567±0.86#与对照组比较#P＜0.0权利要求
1.10-羟基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征方法是(1)、蜂王浆消毒处理，杀死其中的耐酸菌。(2)、在保温条件下，使蜂浆中的10-羟基-Δ2-癸烯酸充分结晶。(3)、将蜂王浆中结晶的10-羟基-Δ2-癸烯酸分离出，然后进行纯化，乳化处理。(4)、利用冷冻真空干燥设备进行冷冻干燥处理，后再粉碎得到10-羟基-Δ2-癸烯酸原粉。
2.如权利要求1所述10-羟基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是工序(2)中的保温湿度为25～35℃，保持48小时。
3.如权利要求1所述10-羟基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是分离采用100目过滤，纯化采用漂洗后高速离心的方法，乳化则采用胶体磨处理。
4．如权利要求1所述10-羟基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是工序(4)中的冷冻温度-40℃，其后升温至35℃干燥，全过程18小时。
5．一种10-羟基-Δ2-癸烯酸应用，其特征是将10-羟其-Δ2-癸烯酸与中药配伍制成复方制剂，10-HDA与中药的重量比例为0.012～0.09∶4；中药由当归、黄芪、天花粉组成，其重量比为0.6∶2.4∶1。
全文摘要
本发明公开了一种从蜂王浆中以物理方法提取10－羟基－Δ2－癸烯酸以及10－羟基－Δ2－癸烯酸的应用。其物理方法概括为:在保温条件使蜂王浆中10－HDA充分结晶,过滤分离,纯化,乳化,再冷却干燥,并粉碎。为克服10－HDA直接服用后的副作用,将10－HDA与中医配伍制成复方剂,中医由当归,黄芪,天花粉组成。10－HDA的提取及应用克服了现有化学方法提取不能实现的产业化的不足,同时克服10－HDA的副作用的影响。
文档编号C07C51/43GK1221730SQ98121629
公开日1999年7月7日 申请日期1998年10月16日 优先权日1998年10月16日
发明者许祖逖, 吴润洲, 李冬珍 申请人:武汉天润生物制品有限公司