专利名称：新的人神经内分泌特异性蛋白和编码序列、及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。更具体地说，本发明的多肽被推断鉴定为神经内分泌特异性蛋白(Neuroendocrine-specific protein，简称NSP)家族中的一个新成员。
神经内分泌特异性蛋白是人体中发现的一种蛋白，它特异性地在神经及内分泌组织中表达。近几年有报道表明，其在老鼠的脑组织与鸡体内也有表达。
神经内分泌特异性蛋白基因最早是由Roebroek A.J.M等人从人中发现并克隆得到的。同时，他们还分离得到了由该基因表达所产生的三个具有相同C末端，而由不同起始转录位点所产生的不同大小的蛋白(分别命名为NSPA、NSPB和NSPC)及其克隆(J.Biol.Chem.1993，268；13439-13447)。1994年，Kools等人将其正确地定位于人染色体14q21-q22上(Cytogenet.Cell Genet.1994，66；48-50)。1996年，人们从大鼠的脑中也克隆得到了大鼠的神经内分泌特异性蛋白的基因(MolCell.Neuro.Sci1996，7(4)；289-303)。1997年，Ninkina N.N.等人，从鸡体内分离并克隆得到了鸡的NSP基因，并将鸡的NSP、大鼠的NSP与人的NSP作了同源分析，发现三者有较高的同源性，同属于神经内分泌特异性蛋白家族中的成员(Gene1997，184(2)；205-210)。
但在本申请之前，没有公开或发表过其他的人神经内分泌特异性蛋白或基因。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码神经内分泌蛋白基因家族的一个新成员，本发明新的人神经内分泌特异性蛋白基因，被命名为NSPH基因。
本发明的另一个目的是提供一种新的神经内分泌蛋白家族成员，该蛋白被命名为NSPH蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人神经内分泌特异性蛋白NSPH的方法。
本发明还涉及这种人神经内分泌特异性蛋白NSPH核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人NSPH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人NSPH蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人NSPH蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人NSPH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人NSPH蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人NSPH蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人NSPH蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人NSPH蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为770个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于81-680位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“NSPH蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人NSPH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中81-680位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框81-680位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中81-680位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，较佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人NSPH相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人NSPH蛋白多肽”指具有人NSPH蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人神经内分泌特异性蛋白相同功能的、SEQ IDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人NSPH蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与NSPH DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗NSPH多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含NSPH多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了NSPH多肽的可溶性片段。通常，该片段具有NSPH多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供NSPH蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然NSPH多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人NSPH保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还包括NSPH多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内NSPH的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有NSPH核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码NSPH的核酸分子。
本发明还包括检测NSPH核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于NSPH多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人NSPH DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于NSPH基因产物或片段。较佳地，指那些能与NSPH基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制NSPH蛋白的分子，也包括那些并不影响NSPH蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的NSPH基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的NSPH基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达NSPH或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断NSPH功能的抗体以及不影响NSPH功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用NSPH基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与NSPH基因产物的未修饰形式结合的抗体，可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人NSPH核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为770个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于81-680位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15′-GAGTAGGTTTGTGCAGTTACAGC-3′和反向引物B15′-GTCAAGGTTCGTTCTTCCCT GAC-3′进行PCR，获得770bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
根据同源比较的结果，本发明的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列与不同来源的神经内分泌特异性蛋白显示了显著的同源性，因此，这表明它是神经内分泌特异性蛋白家族的一个新成员，并且具有神经内分泌特异性蛋白家族蛋白的一些重要功能。
研究表明，神经内分泌特异性蛋白在细胞内被定位于内质网膜上，其在细胞内作为物质转运通道复合物，负责将神经内分泌组织所分泌的分泌物运输到所需的部位，以发挥其正常功能。神经内分泌蛋白基因的分化在人体内被证实与小细胞肺癌的发生有很大的关系，其仅在具有神经内分泌特异性表型的细胞中才表达。因此，其在免疫诊断学中是一种非常有价值的标记物，可有效地诊断出各种肺癌疾病的发生。正是因为神经内分泌蛋白具有上述功能，所以它在医学上有着很重要的应用价值。
在附图中，
图1为本发明的人NSPH与人的神经内分泌特异性蛋白A、B和C(NSPA、NSPB、和NSPC)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在四个序列下方用“*”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人NSPH的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15′-GAGTAGGTTTGTGCAGTTACAGC-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B15′-GTCAAGGTTCGTTCTTCCCTGAC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、66℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断为770bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共770bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于81-680位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出NSPH的氨基酸序列，共199个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用本发明的NSPH的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non edundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，本发明的人NSPH与神经内分泌特异性蛋白家族成员显示了较高的同源性，如用PCGENE软件分析，它与人的神经内分泌特异性蛋白A(NSPA)在蛋白水平上显示了67.3％的同一性和80.9％的相似性；与人的神经内分泌特异性蛋白B(NSPB)在蛋白水平上显示了65.8％的同一性和80.4％的相似性；与人的神经内分泌特异性蛋白C(NSPC)在蛋白水平上显示了66.3％的同一性和79.9％的相似性(参见图1)。
研究表明，人神经内分泌蛋白NSPA、NSPB及NSPC三者在蛋白水平上由很高的同源性，尤其是它们的C末端高度同源，均具有两个很大的疏水性区域(图1中粗体部分)，并具有与内质网膜结合的高度保守性序列(即基序1Lys-Ala-Lys-Ala-Glu(即K-A-K-A-E)，其中两个Lys是高度保守的，一个位于C末端-3位，另一个在-4或-5位；基序2Lys-Arg-His(即K-R-H)在C末端-3至-5位；)，这一区域可能是神经内分泌特异性蛋白作用的功能区(Genomics 1996，32；191-199)。本发明的NSPH蛋白的C末端，与这三个人神经内分泌蛋白的C末端均有很高的同源性，而且还发现，NSPH还有四个疏水性区域；并且具有与两个基序十分相似的序列Lys-Arg-Lys-Ala-Glu(即K-R-K-A-E)(参见图1中带下划线部分)，因此，这更确定了本发明的NSPH也属于神经内分泌特异性蛋白家族，并且具有神经内分泌特异性蛋白家族的相关功能。
免疫荧光显微检测结果表明，神经内分泌特异性蛋白在细胞内定位于内质网膜上。其与内质网膜一起构成物质转运通道的复合物，将神经内分泌组织所分泌的分泌物转运到所需的部位。
神经内分泌特异性蛋白除了在细胞内起到转运物质的作用外，其在医学上也有很重要的用途。
早在1991年，就有报道表明肺癌主要分为小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)。小细胞肺癌与肺类肿瘤都属于神经内分泌类肿瘤中的一个成员(CancerRes.54；4769-4776)。在小细胞肺癌基因中，有一神经内分泌特异性表达的区域，所以其特异性地在神经及内分泌组织中表达。而在少数非小细胞肺癌基因中也表达神经内分泌特异性蛋白(J.Biol.Chem.1993，268；13439-13447)。因而，神经内分泌特异性蛋白基因的分化，直接影响着肺癌的引发。而在这些蛋白所引发的肺癌中，神经内分泌特异性蛋白往往是高表达的。因此，神经内分泌特异性蛋白可作为免疫诊断学中有效的标记物，其不仅可正确地诊断出因神经内分泌特异性蛋白基因分化而引起的肺癌，还可诊断出其他原因所引发的肺癌。
据本发明的NSPH与NSPA、NSPB及NSPC同属神经内分泌特异性蛋白家族，故其也具有与上述相同或相似的功能。即在细胞内负责转运神经内分泌物。此外，本发明的新蛋白可在免疫诊断学中做为极有价值的标记物，诊断各种肺癌的引发。
本发明的人NSPH除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人NSPH还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人NSPH的N端与人NSPB和NSPC的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人NSPH的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员如NSPB)。
此外，本发明人NSPH核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人NSPH的表达水平或者抑制人NSPH的过度表达。本发明的人NSPH蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人NSPH缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3NSPH在大肠杆菌中的表达编码NSPH的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1的扩增片段产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCGGATCCATGGACGGTCAGAAGAAAAAT-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的NSPH编码序列的21个核苷酸；3’寡核苷酸引物序列为5’-GTTCGTCGACTCATTCAGCTTTGCGCTTC-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和NSPH的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和SalI消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，测序验证结果表明NSPH的cDNA插入片段已正确装入载体。
过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的NSPH。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱NSPH。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为23KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4NSPH在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码NSPH的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中的扩增片段产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-TTGCAAGCTTATGGACGGTCAGAAGAAAAAT-3′(SEQ ID NO.7)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的NSPH编码序列的21个核苷酸；3′端引物序列为5’-GTTCGGATCCTCATTCAGCTTTGCGCTTC-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和NSPH的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证结果表明NSPH的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为23KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀NSPH基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称新的人神经内分泌特异性蛋白和编码序列、及制法和用途(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GAGTAGGTTT GTGCAGTTAC AGC 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GTCAAGGTTC GTTCTTCCCT GAC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)长度770bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3GAGTAGGTTT GTGCAGTTAC AGCTTTTCTG TTGGTATGCA TAATTAATAA TTGGAGCTGC 60AAAGCAGATC GTGACAAGAG ATGGACGGTC AGAAGAAAAA TTGGAAGGAC AAGGTTGTTG 120ACCTCCTGTA CTGGAGAGAC ATTAAGAAGA CTGGAGTGGT GTTTGGTGCC AGCCTATTCC 180TGCTGCTTTC ATTGACAGTA TTCAGCATTG TGAGCGTAAC AGCCTACATT GCCTTGGCCC 240TGCTCTCTGT GACCATCAGC TTTAGGATAT ACAAGGGTGT GATCCAAGCT ATCCAGAAAT 300CAGATGAAGG CCACCCATTC AGGGCATATC TGGAATCTGA AGTTGCTATA TCTGAGGAGT 360TGGTTCAGAA GTACAGTAAT TCTGCTCTTG GTCATGTGAA CTGCACGATA AAGGAACTCA 420GGCGCCTCTT CTTAGTTGAT GATTTAGTTG ATTCTCTGAA GTTTGCAGTG TTGATGTGGG 480TATTTACCTA TGTTGGTGCC TTGTTTAATG GTCTGACACT ACTGATTTTG GCTCTCATTT 540CACTCTTCAG TGTTCCTGTT ATTTATGAAC GGCATCAGGC ACAGATAGAT CATTATCTAG 600GACTTGCAAA TAAGAATGTT AAAGATGCTA TGGCTAAAAT CCAAGCAAAA ATCCCTGGAT 660TGAAGCGCAA AGCTGAATGA AAACGCCCAA AATAATTAGT AGGAGTTCAT CTTTAAAGGG 720GATATTCATT TGATTATACG GGGGAGGGTC AGGGAAGAAC GAACCTTGAC770(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度199个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Asp Gly Gln Lys Lys Asn Trp Lys Asp Lys Val Val Asp Leu 15Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala 30Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser 45Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser 60Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp 75Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile 90Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His 105Val Ash Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp 120Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe 135Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Ash Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu 150Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His 165Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val 180Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys 195Arg Lys Ala Glu 199(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度31碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGGATCC ATGGACGGTC AGAAGAAAAA T31(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TCATTCAGCT TTGCGCTTC 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征
(A)长度31碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGGACGGTC AGAAGAAAAA T31(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TCATTCAGCT TTGCGCTTC 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人NSPH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列。
4.一种分离的人NSPH蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人NSPH蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人NSPH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人NSPH蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人NSPH蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人NSPH蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人NSPH蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸81-680位。
12.一种能与权利要求4所述的人NSPH蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及了神经内分泌特异性蛋白家族的一个新成员NSPH。本发明提供了该新神经内分泌特异性蛋白的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的新的人神经内分泌特异性蛋白的方法。本发明还提供了这种新人神经内分泌特异性蛋白多肽和核酸序列的应用。
文档编号C07H21/04GK1253180SQ9812147
公开日2000年5月17日 申请日期1998年10月30日 优先权日1998年10月30日
发明者余龙, 赵勇, 张宏来, 屠强, 傅强 申请人:复旦大学