一种液态脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种液态脯氨酸特异性内切蛋白酶复配酶制剂，属于酶制剂技术领 域。
【背景技术】
[0002] 脯氨酸特异性内切蛋白酶是存在于微生物（包括细菌和真菌）的蛋白酶，其活性 中心含有丝氨酸，组氨酸以及天冬氨酸，广泛用于生物技术、医药、食品以及酿造等行业。
[0003] 脯氨酸特异性内切蛋白酶的最适反应温度主要在30°C -50°C之间，脯氨酸特异性 内切蛋白酶保藏过程中，前期失活比较严重，当脯氨酸特异性内切蛋白酶在30°C时，其半衰 期为lh，另外保存于37°C的脯氨酸特异性内切蛋白酶7天后就几乎完全丧失酶活，严重影 响了脯氨酸特异性内切蛋白酶的贮存时间以及工业化应用。
[0004] 因此，脯氨酸特异性内切蛋白酶酶制剂需要一种有效地复配方法来提高其贮存稳 定性。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白酶复配酶制剂，尤其是一种具有良好 储藏稳定性的脯氨酸特异性内切蛋白酶酶制剂。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述复配酶制剂主要包含脯氨酸特异性内切蛋白 酶、30%-90%的甘油、I-IOmM CaCl2、l-10mM NaClU-IOmM KCl、l-10g/L 山梨醇、0.01-2g/ L山梨酸钾、2% -10%的聚乙二醇以及0. 5-1. 5g/L明胶；所述百分比是体积百分比。不足 部分以水补足。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶还可替换为其他类似 的酸性蛋白酶。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，复配酶制剂中脯氨酸特异性内切蛋白酶的含量为 l-10g/L〇
[0009] 在本发明的另一种实施方式中，所述复配酶制剂含脯氨酸特异性内切蛋白酶 l-10g/L、30%-60%的甘油、4-6%的PEG400 和l·0-l·5g/L的明胶、8-10g/L的山梨醇、 0· 01-2g/L 的山梨酸钾，3-5mM 的 CaCl2、3-5mM 的 NaCl 以及 3-5mM 的 KC1。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于真菌曲霉 (Aspergillus sp.)或产真菌曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶的工程菌。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是由野生脯氨酸特异 性内切蛋白酶生产菌株或者基因工程菌株发酵得到。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于黑曲霉或者米 曲霉。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于产脯氨酸特异 性内切蛋白酶的基因工程菌。如发明名称为"一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其 应用"，【申请号】201310567472. O的发明专利申请中记载的基因工程菌；或发明名称为"一 种高效表达米曲霉脯氨酰内肽酶的基因工程菌及其应用"，【申请号】201310568071. 7的发明 专利申请中记载的基因工程菌。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是通过微生物发酵制 备获得。
[0015] 本发明提供的蛋白酶复配酶制剂具有极其优异的储存稳定性，在4°C保存一年，其 酶活保留率仍达90%以上，在30°C保存15天，其酶活保留率仍达50%以上，保存30天，其 酶活保留率仍高达45%以上，解决了由于产品运送或储存时间较长导致产品应用性能迅速 下降的问题。本发明提供的酶制剂复配方法简单，原料来源丰富并且成本低，特别适合在工 业上推广。
【具体实施方式】
[0016] 脯氨酸特异性内切蛋白酶在复配酶制剂中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。
[0017] 脯氨酸特异性内切蛋白酶活力的测定方法为：脯氨酸特异性内切蛋白酶酶 活测定方法参照 Luppo Edens (Luppo Edens, Peter Dekker, Rob Van Der Hoeven, et al. Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53 (20): 7950-7957)。取适量发酵浓缩上清 液，加入80 μ I柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液（ρΗ5· 0)和10 μ I 2mmol/L的Z-Gly-Pro-pNA溶 液，摇匀，37°C分别反应lOmin。测定反应前后溶液在410nm处的吸光度。在上述条件下，每 分钟分解Z-Gly-Pro-pNA释放1 μ mol pN的酶量，定义为一个酶活单位（U/ml)。通过Λ A41tl 计算脯氨酸特异性内切蛋白酶酶活。U/ml= (AA/min)*(V*/rvb);其中ΛΑ/min为吸光 度变化，V为反应体系体积（ml)，r为摩尔消光系数（cm 2/mol)，V为样品量（ml)，b为比色 杯光程（cm)。上述用量可按比例增加或减少。
[0018] 实施例1脯氨酸特异性内切蛋白酶的制备
[0019] 脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于产脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因工程菌，其构 建方法参见发明名称为"一种高效表达米曲霉脯氨酰内肽酶的基因工程菌及其应用"，申请 号：201310568071. 7的发明专利申请。
[0020] 基因工程菌的发酵培养基（3L):
[0021] 摇瓶种子培养基（YPD):酵母浸提物10. 0g/L，蛋白胨20. 0g/L，葡萄糖20. 0g/L。
[0022] 甘油生长相培养基（基础盐培养基）：CaS04 0 . 93g/L，85% H3PO4 28.70mL/L， MgS04.7H2014.90g/L，K2S04 1 8 . 20g/L，K0H 4.13g/L。用此培养基配制成含 4% (W/V)的甘 油和4mL/L PTMj^发酵培养基。
[0023] 甘油过渡相补料培养基：50% (W/V)甘油，其中PTM1含量为12mL/L。
[0024] 甲醇诱导相培养液：纯甲醇诱导液，其中PTM1含量为24mL/L。
[0025] 微量元素 PTM1 溶液：CuSO 4 · 5H20 6. 0g/L，KI 0· 08g/L，MnSO4 · H2O 3. Og/ L，Na2MoO4 · 2H20 0· 2g/L，H3BO3 0· 02g/L，ZnSO4 · 7H20 42. 2g/L，FeSO4. 7H20 65. 0g/L， CoCl2 · 6H20 0· 5g/L，Biotin 0· 2g/L，H2SO4 5. 0mL/L。
[0026] 基因工程菌的发酵培养条件：
[0027] 7L发酵罐培养，准确配制2. 5L甘油生长相培养基置于7L发酵罐内，安装好挡板、 搅拌桨、补料针等，并插入已离线标定好的D0、pH和消泡电极，封口保护电极头，接上两个 空气过滤器，中间用夹子包扎好，连接好取样器，然后放置于灭菌锅内121°C灭菌20min。取 出室温冷却，连接上发酵调控器，调节空气流量为2. 5L/min，初始搅拌转速为300r/min，菌 体生长温度为30°C，用氨水自动调控pH值为5. 5。将5瓶种子液并种，并加入10. 875mL过 膜除菌的PTM1溶液，火焰接种，接种量为10%，当DO值稳定后较100%，在甘油生长相期间 通过蛇管冷却或加热套加热以及自动流加氨水控制温度与pH在设定值，并通过调节转速 维持溶氧值在50%以上。发酵过20-25h，此时溶氧值会急剧上升，这表明培养基中的底物 甘油已基本耗尽，维持此状态半小时后开始流加50 %的甘油过渡相培养基，进入甘油间歇 补料阶段。同时连接上甲醇控制仪，预热。每4h取样检测菌体浓度，当其值达到需要的诱 导菌浓时，停止补加甘油，维持此状态30min，使得甘油彻底耗尽，目的是避免过剩甘油阻遏 启动子A0X1，重新校正溶氧值为100%，同时调节诱导温度至28°C。开始进入甲醇相，利用 甲醇控制仪变速的向发酵液中流加甲醇诱导液，起初慢慢增加甲醇补料速率，以免菌体无 法适应甲醇而中毒（适应期为8h左右），当菌体逐渐适应了甲醇之后，提高流加速率维持甲 醇浓度在〇.1±〇. 02% (V/V)左右，并通过调节转速，增加流量，混合通纯氧的方式维持溶 氧值在10% -20%之间，诱导脯氨酸特异性内切蛋白酶的高效表达。28°C条件下诱导培养 7此后下罐，将发酵液12000rpm4°C离心20min除去菌体，得到上清液，抽滤过0· 22 μ m的水 相滤膜除菌，即为含脯氨酸特异性内切蛋白酶的水溶液。
[0028] 实施例2
[0029] 复配液体酶制剂各组分的含量如下：
[0030] 脯氨酸特异性内切蛋白酶l-10g/L
[0031] 甘油 20%-30% (v/v)
[0032] PEG400 5-10% (v/v)
[0033] 明胶 1.0-1. 5g/L
[0034] 山梨醇 8-10g/L
[0035] 山梨酸钾 0.05-lg/L
[0036] CaCl2 3_5mM
[0037] NaCl l_3mM
[0038] KCl l-3mM
[0039] 调复配酶制剂pH在3· 0-5. 0。
[0040] 复配后的液体酶制剂放置于4°C保存15天以