一种基于离子调控的酶法定向制备低粘度及超低粘度褐藻胶的方法与流程

本发明涉及一种基于离子调控的酶法定向制备低粘度及超低粘度褐藻胶的方法，具体是指以褐藻为原料，利用离子调控褐藻胶裂解酶的活性，以降解生产低粘度及超低粘度褐藻胶的方法。

背景技术：

褐藻胶是从海带、马尾藻等褐藻中提取出来的一种多糖类生物高分子，是由甘露糖醛酸和古罗糖醛酸组成的一种线型聚合物。与中、高粘度褐藻胶相比，低粘度及超低粘度褐藻胶具有分子量小、稳定性好、渗透性强、水溶性好等特点，而被广泛的应用于印染、医疗卫生与食品行业。低粘度及超低粘度褐藻胶在世界藻胶中占有重要地位，其需求量约占总需求量得30-40%，且在德国、美国、日本、韩国和国内市场都很大，但由于国内以往无法生产，多年来处于空白地位。

当前国内褐藻胶的生产多沿用传统生产工艺，传统工艺耗水量极大，每生产1吨褐藻胶产品约需要1000吨水；其产品规格也仍以中粘度褐藻胶为主，约占总产量的90%，但低粘度、超低粘度和高粘度褐藻胶产品所占比例极少，严重制约了褐藻胶产业结构的优化与发展。目前国内外低粘度及超低粘度的生产方法无外乎、高温消化法、加酸蒸煮海带法、脱钙凝胶加温法及褐藻酸钠干粉加温存放法等，缺点如专利cn104448032b一种从褐藻中提取褐藻酸钠的方法，该工艺为了制备低粘度褐藻胶，采用高温、强酸等方法以此来降低褐藻胶粘度，该方法具有成本高、能耗大、分子量不均一等缺点。

目前，一些研究者将酶解法应用到低粘度及超低粘度生产中，如专利cn105367684a一种低粘度海藻酸钠的制备方法与专利cn103665183a一种超低粘度褐藻胶的生产方法，其工艺均为在碱消化前使用纤维素酶、蛋白酶、果胶酶进行酶解处理后，经过碱消化、稀释、脱色、钙析、脱钙、中和、醇沉后得到低粘度及超低粘度的褐藻胶产品，其中专利cn105367684a主要描述了该技术在低粘度褐藻胶的工业化生产中的应用。该种提取工艺利用纤维素酶、蛋白酶、果胶酶分解褐藻细胞壁，加快褐藻胶的溶出，从而提高出胶率，但纤维素酶、蛋白酶、果胶酶对褐藻胶无分解作用，很难得到低粘度及超低粘度褐藻胶。再如专利cn200610042119a一种生产低粘度褐藻胶的方法，该专利将稀释后的可降解和液化褐藻胶的海洋细菌菌悬液喷洒于海带表面，处理3-60天后，再以常规方法对海带处理，得到低粘度的褐藻胶。该低粘度褐藻胶生产工艺中菌仅作用于海带表面，对藻体内部褐藻酸作用有限，具有酶解效率低，工艺历时时间长等缺点。

论文《褐藻胶裂解酶系的酶化学_产物分析及应用研究》在第五章公开了“褐藻胶裂解酶在低粘度和超低粘度褐藻胶制备中的应用”，该方法利用褐藻胶裂解酶的粗酶液对碱消化后的消化液进行酶解处理，经固色、消化、酶解、过滤、钙析、脱钙、烘干后制得低粘度及超低粘度褐藻胶，但该褐藻胶裂解酶系是由三个单体酶（酶a、酶b与酶c）组成，因该酶系的三个单体酶底物特异性不同，所以利用该粗酶液制备的低粘度及超低粘度褐藻胶分子量规格不均一，易出现小分子寡糖。与当前市场上的多数低粘度褐藻胶产品无异，分子量均一度较差。本专利通过金属离子对褐藻胶裂解酶系的调节作用实现单体酶活性中心的开放和关闭，以控制底物的降解水平，再利用不同截留分子量的膜生物反应器生产制备出分子量规格较为均一的低粘度及超低粘度褐藻胶。

技术实现要素：

为解决传统工艺耗水严重、分子量均一度差等问题，本发明提供一种利用褐藻胶裂解酶生产低粘度及超低粘度褐藻胶的方法。

本发明采用如下技术方案：一种基于离子调控的酶法定向生产低粘度及超低粘度褐藻胶的方法，包括以下具体步骤：

（1）原料预处理:鲜褐藻或加水泡发并洗去表面杂质后的干褐藻切块于0.5%-1%甲醛溶液中固色，清水洗去表面甲醛；

（2）消化:加入料液比为1:10-1:40（m/v）的4%-8%碳酸氢钠溶液、50-70℃、80-400r/min搅拌条件下消化1-4h；

（3）酶活调控：在褐藻胶裂解酶液中用k⁺、na⁺和ba²⁺的溶液按摩尔比1：2-25:0.001-0.5比例调控单体酶酶活。具体操作时以1-200mmol/l的bacl2溶液加至褐藻胶裂解酶液中，30℃恒温孵育5-30min，以此对褐藻胶裂解酶三个单体酶进行酶活调控；

（4）酶解：将经过碱处理的消化液加入0.5-1倍体积水进行初步稀释，冷却至室温后加入10%的盐酸调节ph至5-7，分别置于截留分子量为12-100kda的膜生物反应器中，于30℃预热5-15min后加入20-100u/g（酶活单位/原料重量）经过上述处理褐藻胶裂解酶，30-150r/min搅拌条件下反应20-60min；待反应结束后升温至60-90℃保持20min灭活，过滤分离后得清胶液；

（5）钙析：边缓慢搅拌边向除去滤渣的清胶液中加入适量5%-10%的氯化钙溶液；

（6）脱钙与中和：将褐藻酸钙凝胶加入一定量盐酸中酸化20min，水洗至中性；之后加入一定量10%碳酸钠溶液中和直至完全溶解，注意碳酸钠加入量不易过多；

（7）醇沉：边搅拌边向样品中加入2-3倍体积的95%乙醇，静置一段时间后，离心获得褐藻胶固体，烘干、粉碎后即得样品；

（8）检验:取1g褐藻胶样品加入100ml水中配成1%的褐藻胶溶液，于20℃下测量其粘度。取5mg褐藻胶样品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻胶溶液，hpgpc测其分子量。

本发明所述低粘度褐藻胶粘度范围在71-150mpa·s；超低粘度褐藻胶粘度范围为5-70mpa·s。

本发明所述褐藻胶裂解酶系由三种褐藻胶裂解酶组成的酶系，其降解活性具有离子调性特性。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明通过金属离子对褐藻胶裂解酶系的酶活进行调控，达到了控制底物的降解水平的目的。

2、本发明利用褐藻为原料直接提取低粘度及超低粘度褐藻胶，避免了通过褐藻胶后续加工的成本增加。

3、本发明利用截留分子量12-120kda的膜生物反应器，一方面可使小分子褐藻胶及时分离出去反应的进行；另一方面可以连续操作，极大限度的利用酶，因而可以提高产量节约成本。

4、通过本发明方案制备的低粘度及超低粘度褐藻胶产品具有良好的分子量均一度，主组分含量在80-100%之间。

5、本发明通过酶解作用得到的消化液极易过滤，与传统工艺生产相比，可节省60-80%的用水量，极大节约了水资源的消耗，减少了工业废水的排放量，实现了节能减排。

6、本发明工艺简单、连续性强，酶解过程在30min内即可完成，克服了其他工艺酶处理时间长等问题。

附图说明

图1为实施例1产品的hpgpc液相图谱；

图2为实施例2产品的hpgpc液相图谱;

图3为hpgpc法标准曲线；

图4为工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体事例对本发明进行进一步说明：

实施例1：

（1）原料预处理：取100kg干海带加入1000l水中浸泡除杂，之后于100l的0.5%甲醛溶液固色2h后，清水洗去表面甲醛；

（2）消化：在60℃、搅拌条件下，将原料于2000l的6%碳酸氢钠溶液中消化3.5h；

（3）酶活调控：将kcl、nacl与bacl2溶液加至褐藻胶裂解酶粗酶液中，使其终浓度分别为150mmol/l、500mmol/l与5mmol/l，30℃恒温孵育20min，以此实现对褐藻胶裂解酶三个单体酶的酶活调控。

（4）酶解过滤：将经过碱处理的消化液加入2000l的水进行初步稀释，冷却至室温后加入10%的盐酸调节ph至6，分别置于截留分子量为80kda的膜生物反应器中，于30℃预热10min后加入30u/g经过上述处理褐藻胶裂解酶，100r/min搅拌条件下反应30min；待反应结束后升温至70℃保持20min灭活，过滤分离后得清胶液。

（5）钙析：边缓慢搅拌边向除去滤渣的清胶液中加入200l的10%的氯化钙溶液；

（6）脱钙：将褐藻酸钙凝胶加入500l的3%盐酸中酸化30min，水洗至中性；之后加入适量10%碳酸钠溶液中和直至完全溶解；

（7）醇沉：向样品中加入2倍体积的乙醇进行分级醇沉，烘干、粉碎后得干样品29.5kg；

（8）检验：取1g褐藻胶样品加入100ml水中配成1%的褐藻胶溶液，20℃下测得其粘度为101mpa·s。取5mg褐藻胶样品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻胶溶液，hpgpc法仅测出3个峰，其中主峰分子量为87.6kda，其百分含量为85%，分子量均一度良好。总用水量为7.8吨，换算成生产一吨粘度为101mpa·s的产品的总用水量为264.41吨，与传统工艺的生产每吨产品均用水量1000吨相比，节约了73.56%的用水。

实施例2：

（1）原料预处理：将30kg干巨藻用300l的水中浸泡3h后除杂，于30l的0.5%甲醛溶液固色4h后，清水洗去表面甲醛；

（2）消化：在65℃、搅拌条件下，将原料于450l的6%碳酸氢钠溶液中消化2h；

（3）酶活调控：将kcl、nacl与bacl2溶液加至褐藻胶裂解酶粗酶液中，使其终浓度分别为200mmol/l、450mmol/l与2.5mmol/l，30℃恒温孵育30min，以此实现对褐藻胶裂解酶三个单体酶进行酶活调控。

（4）酶解：将经过碱处理的消化液加入300l的水进行初步稀释，冷却至室温后加入10%的盐酸调节ph至7，分别置于截留分子量为40kda的膜生物反应器中，于30℃预热10min后加入50u/g经过上述处理褐藻胶裂解酶，150r/min搅拌条件下反应30min；待反应结束后将酶解液于沸水中煮沸5min后灭活，过滤分离后得清胶液。

（5）钙析：边缓慢搅拌边向除去滤渣的清胶液中加入60l的10%的氯化钙溶液；

（6）脱钙：将褐藻酸钙凝胶加入200l的3%盐酸中酸化30min，水洗至中性；之后加入适量10%碳酸钠溶液中和；

（7）醇沉：向样品中加入3倍体积的乙醇进行分级醇沉，烘干、粉碎后得干样品10.2kg；

（8）检验：取1g褐藻胶样品加入100ml水中配成1%的褐藻胶溶液，20℃下测得其粘度为46mpa·s。取5mg褐藻胶样品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻胶溶液，hpgpc法仅测出3个峰，其中主峰分子量为41.9kda，其百分含量为89%，分子量均一度良好。总用水量为2.45吨，换算成生产一吨粘度为46mpa·s的产品的总用水量为240.19吨，与传统工艺的生产每吨产品均用水量1000吨相比，节约了75.98%的用水。

表1分子量分布、产量及工艺耗水量

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。