一种制备具有体外抗氧化活性的铁皮石斛低聚糖的方法与流程

本发明属于铁皮石斛加工领域，具体涉及一种制备具有体外抗氧化活性的铁皮石斛低聚糖的方法。

背景技术：

铁皮石斛是兰科石斛属气生兰科的名贵药用草本植物，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳、延年益寿等功效及增强免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂、防癌抗癌等神奇的功效。铁皮石斛的传统加工仍以石斛鲜条、铁皮枫斗、石斛超微粉等粗放型为主。我国铁皮石斛精深加工业的发展速度相当缓慢，且缺乏技术的深度创新，已难以适应现代铁皮石斛种植业的发展。因此，如何推动铁皮石斛精深加工业发展是目前亟待解决的关键问题之一。石斛茎中含有多种生物碱、多糖、氨基酸及淀粉等。石斛多糖属于活性多糖的一种，具有抗炎、抗病毒、修复自身提高免疫力的功效，一直被选作铁皮石斛深加工研究的主要对象，包括多糖的提取、结构分离及活性功能评价等，而将铁皮石斛多糖降解成为小分子低聚糖的研究较少。众所周知，低聚糖也具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖及提高免疫力等功效，且有研究证实某些特殊结构的低聚糖功能性强于活性多糖，而且专一性更高、可吸收性更好等特点。因此，借助铁皮石斛中重要的活性多糖成分制备小分子低聚糖，是提升铁皮石斛多糖应用层次的新思路，有望推动铁皮石斛精深加工业发展，具有现实意义。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种制备具有体外抗氧化活性的铁皮石斛低聚糖的方法。本发明通过酶解法制备了铁皮石斛低聚糖，提高了铁皮石斛的抗氧化活性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种制备具有体外抗氧化活性的铁皮石斛低聚糖的方法，所述方法利用酶直接酶解铁皮石斛制备铁皮石斛低聚糖。

所述方法包括以下步骤：

磨粉：将铁皮石斛鲜条放置于烘箱中烘干后用万能粉碎机破碎，并过60目分离筛得铁皮石斛干粉备用；

溶解：将铁皮石斛干粉溶解在磷酸盐缓冲液中得铁皮石斛干粉液，浓度为g/ml；

限制性酶解：向铁皮石斛干粉液中加入一定量酶制剂酶解一段时间后得酶解液；

灭酶：将酶解液100～150℃灭菌时间4～10min，使剩余酶制剂失去活性；

过滤：将灭酶后的酶解液5000～10000rpm离心5～10min取上清液；

浓缩：将上清液浓缩10-100倍得铁皮石斛低聚糖。

所述酶解中，酶为β-甘露聚糖酶与纤维素酶复配的复合酶，β-甘露聚糖酶与纤维素酶的配比为2:1，复合酶添加量为12u/ml，酶解温度为40℃，酶解ph值为6.0，酶解时间为8h。

所述方法制备得到的铁皮石斛低聚糖的dpph清除率可达23.7％，总抗氧化活性可达0.65u/ml。

所述方法制备得到的铁皮石斛低聚糖是以低聚甘露糖为主的低聚糖混合物。

所述酶选自甘露聚糖酶、纤维素酶、纤维二糖酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的至少一种。

所述酶解中，酶的添加量为1u/ml-20u/ml。

所述酶解中，酶解ph值为5.0-8.0。

所述酶解中，酶解温度控制为30℃-50℃。

所述酶解中，酶解时间控制为1h-24h。

本发明的有益技术效果：本发明方法制备了铁皮石斛低聚糖，该方法简单，可实施行强，制备得到的铁皮石斛低聚糖的dpph清除率可达23.7％，总抗氧化活性可达0.65u/ml。

附图说明

图1、不同加酶量对铁皮石斛水解产物抗氧化活性的影响；

图2、不同初始ph对铁皮石斛水解产物抗氧化活性的影响；

图3、酶解温度对铁皮石斛水解产物抗氧化活性的影响；

图4、不同培养时间对铁皮石斛水解产物抗氧化活性的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

实施例1

将铁皮石斛鲜条放置于烘箱中烘干后用万能粉碎机将其破碎并过60目分离筛备用。

取1g铁皮石斛干粉置100ml锥形瓶中，加入50ml的磷酸盐缓冲液中混匀，添加12u/ml的酶制剂进行酶解，酶解温度为40℃，酶解时间为8h，酶解后将样品放置于沸水中蒸煮5min以灭酶活，离心酶解产物留取上清液，将上清液浓缩至1ml，最后测定各样品的体外抗氧化活性。

其中，磷酸盐缓冲液的ph为6.0；酶制剂为β-甘露聚糖酶与纤维素酶的复合物，配比为2:1。

在上述条件下酶解之后，所得结果如下：

在上述酶解条件下所得的酶解铁皮石斛产物的dpph清除率可达23.7％，总抗氧化活性为0.65u/ml。

铁皮石斛水解物多糖主要测定体外抗氧化活性，包括dpph自由基清除率和总抗氧化活力等。具体方法如下：

dpph自由基清除率的测定：取500μl的低聚糖混合液加入500μldpph无水乙醇溶液(0.2mg/ml)后，混合振荡，黑暗中放置30min后以蒸馏水为空白溶液，517nm处测定吸光度值b1；以无水乙醇代替dpph乙醇溶液进行实验，测定样品溶液本底的吸光度值b2；以蒸馏水代替样品溶液进行实验，测定空白对照溶液的吸光度值b0。计算公式为：dpph自由基清除率(％)＝(b1-b2)/b0*100。

参照总抗氧化能力(t-aoc)测定试剂盒中的操作方法：向离心管中依次加入试剂一0.5ml，低聚糖混合液0.5ml，试剂二应用液1ml，试剂三应用液0.25ml后，用涡旋振荡器充分混匀，37℃水浴30min，取出加入0.05ml的试剂四混匀，放置10min，用双蒸水调零，于波长520nm处测定各管吸光度值。对照组中，不同浓度的低聚糖混合液在水浴后加入，加入量不变，其它溶液的加入顺序不变。计算公式如下：总抗氧化能力(单位/毫升)＝(od测定值-od对照值)/0.01/30*反应液总量/取样量/样本测试前稀释倍数。

实施例2

将铁皮石斛鲜条放置于烘箱中烘干后用万能粉碎机将其破碎并过60目分离筛备用。

取1g铁皮石斛干粉置100ml锥形瓶中，加入50ml的磷酸盐缓冲液中混匀，添加5u/ml的酶制剂进行酶解，酶解温度为30℃，酶解时间为12h，酶解后将样品放置于沸水中蒸煮5min以灭酶活，离心酶解产物留取上清液，将上清液浓缩至1ml，最后测定各样品的体外抗氧化活性。

其中，磷酸盐缓冲液的ph为7.0；酶制剂为单一β-甘露聚糖酶。

在上述条件下酶解之后，所得结果如下：

在上述酶解条件下所得的酶解铁皮石斛产物的dpph清除率可达15.6％，总抗氧化活性为0.32u/ml。

实施例3

将铁皮石斛鲜条放置于烘箱中烘干后用万能粉碎机将其破碎并过60目分离筛备用。取1g铁皮石斛干粉置100ml锥形瓶中，加入50ml的磷酸盐缓冲液中混匀，添加一定量的酶制剂进行酶解，酶解温度为30℃，酶解时间为12h，酶解后将样品放置于沸水中蒸煮5min以灭酶活，离心酶解产物留取上清液，将上清液浓缩置1ml左右即可。

分别选取不同酶水解铁皮石斛并测定了其酶解产物体外抗氧化活性，结果如表1所示。

表1、不同种类酶对铁皮石斛水解产物抗氧化活性的影响

结果表明，选用的几种酶均能直接水解铁皮石斛，水解产物均具备体外抗氧化活性，其中以甘露聚糖酶的作用最为显著，其次为纤维素酶的水解产物。自由基的清除率分别为15.6％和11.2％，总抗氧化活力分别为0.32u/ml和0.28u/ml。甘露聚糖酶及纤维素酶主要被用来水解以甘露糖及葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的聚糖类物质。多糖是铁皮石斛中最为主要的功能活性成分之一，很多铁皮石斛品种中的多糖是由甘露糖及葡萄糖为主的单糖连接而成，以此当选择甘露聚糖酶和纤维素酶为水解酶时铁皮石斛水解产物最多。

实施例4

分别选取不同酶水解铁皮石斛并测定了其酶解产物体外抗氧化活性，结果如表2所示。酶选用不同比例的甘露聚糖酶和纤维素酶。酶解过程中酶解温度为30℃，酶解ph值为7.0，酶解时间为12h。

表2、酶的不同比例对铁皮石斛水解产物抗氧化活性的影响

实施例5

不同酶的添加量的体外抗氧化活性如图1所示。选用的酶为甘露聚糖酶与纤维素酶的复合酶(配比为2:1)，酶解温度为30℃，酶解ph值为7.0，酶解时间为12h。

当加酶量增加时水解产物的自由基清除率及总抗氧化活力均不断提高，添加至12u/ml时效果最好，此时自由基清除率为20.5％，总抗氧化活力为0.54u/ml。

实施例6

不同酶解过程ph对体外抗氧化活性如图2所示。选用的酶为甘露聚糖酶与纤维素酶的复合酶(配比为2:1)，酶解温度为30℃，酶添加量为12u/ml，酶解时间为12h。

结果显示不同ph值对酶解反应的影响不同，随着ph的增高，铁皮石斛酶解产物的抗氧化活性呈现先增高再降低的趋势。当ph升高至6.0时活性最高，自由基清除率为21.5％，总抗氧化活力为0.56u/ml。当ph过低或过高时都会直接影响水解产物的生成，制约其抗氧化活性的高低，在不合适的ph条件下水解酶的活性不稳定，出现失活情况，影响了酶解反应的正常作用。

实施例7

不同酶解温度对体外抗氧化活性如图3所示。选用的酶为甘露聚糖酶与纤维素酶的复合酶(配比为2:1)，酶解ph为6.0，酶添加量为12u/ml，酶解时间为12h。

温度对铁皮石斛酶解反应的影响很大，过低的温度限制了酶的反应速率，降低了水解的效率，而过高的反应温度又导致作用酶出现失活现象，使酶促反应停止。

实施例8

不同酶解时间对体外抗氧化活性如图4所示。选用的酶为甘露聚糖酶与纤维素酶的复合酶(配比为2:1)，酶解ph为6.0，酶添加量为12u/ml，酶解温度为40℃。

随着反应时间的延长，铁皮石斛水解产物的抗氧化活性逐渐提高，反应至8h后趋于稳定，再进一步延长水解时间也不能显著提高抗氧化活性。当水解至8h时自由基清除率为23.7％，总抗氧化活力为0.65u/ml。说明铁皮石斛能够在以上条件下被直接水解，且水解产物具备明显的体外抗氧化功能。