本发明属于生物工程领域，特别涉及一种生物合成的纳米尺度吡咯结构红色素的粒径调控方法。
技术背景
近年来，随着环境问题、能源问题的出现，以及一部分合成色素对人体的致癌性和其他毒害作用的日益显现，人们对色素的绿色环保、安全性以及可持续性的要求越来越高。天然色素以安全性高，具有良好的环境相容性、生物降解性和可持续性而受到广泛关注，成为研究热点。其中微生物色素的生产具有不受季节、气候和地域限制，生产周期短，条件易于控制，产量大，种类丰富等优点，被开发利用的潜力巨大，同时保护了环境和生态平衡，解决了资源短缺的矛盾，具有可持续开发利用的优势。
吡咯结构色素是生物合成色素中的重要种类，是微生物的次生代谢产物，可由细菌、放线菌和霉菌获得。其中，具有3吡咯环的红色色素研究较多，该色素易溶于甲醇、乙醇、丙酮、dmf、乙酸乙酯、氯仿和苯，几乎不溶于水。该色素主要分布在细胞内，色素的提取需要进行细胞破碎。由于此色素水溶性很低，色素提取要使用有机溶剂。
许多种类的微生物色素都有水溶性低的问题，而且许多色素都存在于菌体内部。如何在不使用有机溶剂的情况下制备具有良好加工性能的色素分散液，是微生物胞内色素在应用时亟待解决的问题。同时，色素分散液的稳定性也至关重要，这决定了其可以存放的时间和使用期限。而色素颗粒的粒径大小是决定色素分散液稳定性的最主要影响因素。如何实现对分散液中色素颗粒大小的调控，从而增加其分散稳定性，同样值得研究。
本研究通过对微生物菌株的改造和培养过程的改进，实现了生物合成吡咯结构红色色素的粒径调控，获得了纳米粒径的吡咯结构红色色素，并实现了由细胞分泌进入发酵液中纳米色素在发酵液中的均匀分散，由此获得由纳米色素颗粒形成的稳定分散液。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种通过改变发酵条件实现对纳米尺度吡咯结构红色素的粒径调控方法。
本发明所述的一种生物合成的纳米尺度吡咯结构红色素的粒径调控方法，包括：
(1)将粘质沙雷氏菌在平板培养基上划线，选择颜色最红的单菌落挑出，接入发酵培养基中培养至对数生长期，移取5ml菌液至直径为9cm的培养皿中，功率为15w的紫外线灯管距离30cm照射5～20min，避光保存8-24h后，转移至发酵培养基中培养至对数生长期。然后再转接到选择培养基中培养24h后测λ＝540nm的吸光度值，然后以10％的接种量转接到新的选择培养基中培养24h后测λ＝540nm的吸光度值，再转接至新的选择培养基中，直至吸光度不再增加。分别取菌液0.1ml涂布10个平板，选择颜色最红的单菌落挑出，接入发酵培养基中培养至对数生长期，加入氯化锂使其浓度为0.1～1.5％，保温0.5～10min，取菌液5ml转移至发酵培养基中培养至对数生长期，然后再转接到选择培养基中培养24h后测λ＝540nm的吸光度值，然后以10％的接种量转接到新的选择培养基中培养24h后测λ＝540nm的吸光度值，再转接至新的选择培养基中，直至吸光度不再增加。分别取菌液0.1ml涂布10个平板，选择颜色最红的单菌落挑出，作为改造完成的高产工程菌株。
(2)将高产菌株接入种子培养液中培养，温度30℃，摇床转速120～200rpm，培养时间6～24h。
(3)将种子培养液接入含有非离子表面活性剂体系a的改良的发酵培养基中进行发酵培养，培养48～144h后将发酵液在10000rpm，10℃下离心10min，去除菌体，得纳米尺度吡咯结构红色素悬浮液。
步骤(2)所述的种子培养液中，1l培养基中含有如下成分：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠3g，氯化钾2g，ph5.0～7.0。
步骤(3)所述的改良的发酵培养基中，1l培养基中含有如下成分：蛋白胨15g，丙三醇3g，硫酸镁2g，氯化钠3g，氯化钾2g，ph5.0～8.0。
步骤(3)所述的培养条件为：培养温度25～28℃，摇床转速150～250rpm，时间48～144h，避光培养。
步骤(3)所述的表面活性剂体系a的组成为0～40g/l的吐温-80，0～40g/l的蔗糖脂肪酸酯和0～40g/l的脂肪醇聚氧乙烯醚。
经本发明制得的纳米尺度吡咯结构红色素悬浮液，具有良好的稳定性，经高速离心色素不沉降，放置一个月底部几乎无色素沉降。吡咯结构红色素的平均粒径可在150～800nm之间进行控制。且该发明可应用于其他非水溶性微生物色素，通过微生物发酵的方法直接生产纳米色素悬浮液。
本发明的优点及有益效果是：
(1)本发明的纳米尺度吡咯结构红色素悬浮液的生物制备方法简单，直接由微生物发酵制得，无需使用有机溶剂从菌体内部提取色素，更不需要一般分散液的复杂制备过程，对设备的要求低，绿色环保。
(2)本发明对色素粒径的调控方法简单，只需改变发酵液成分和发酵条件即可实现对纳米色素粒径的调控。
具体实施方式
针对本发明一种生物合成的纳米尺度吡咯结构红色素的粒径调控方法，采用下列方式具体实施。但本发明所述的实施方式不限于此。
实施例1
平均粒径为253.8nm的吡咯结构红色素悬浮液的制备。
将高产粘质沙雷氏菌菌株接入种子培养液中培养，温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间15h。然后将种子液按照2.0％接种至改良的发酵培养基(蛋白胨15g/l，甘油3g/l，吐温-8018g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠3g/l，氯化钾2g/l)中进行发酵培养84h，温度28℃，摇床转速200rpm。然后将发酵液在10000rpm，10℃下离心10min，去除菌体，得平均粒径为253.8nm的纳米吡咯结构红色素悬浮液。
实施例2
平均粒径为402.6nm的吡咯结构红色素悬浮液的制备。
将高产粘质沙雷氏菌菌株接入种子培养液中培养，温度30℃，摇床转速160rpm，培养时问20h。然后将种子液按照2.0％接种至改良的发酵培养基(蛋白胨15g/l，甘油3g/l，吐温-8010g/l，硫酸镁2g/l，氯化钠3g/l，氯化钾2g/l)中进行发酵培养72h，温度28℃，摇床转速200rpm。然后将发酵液在10000rpm，10℃下离心10min，去除菌体，得平均粒径为402.6nm的纳米吡咯结构红色素悬浮液。