本发明涉及一种基于聚多巴胺纳米微球的电致化学发光传感器的制备方法，具体涉及到将三联吡啶钌固定在氨基化多壁碳纳米管/Nafion复合膜修饰的电极上，采用简单的方法制得的聚多巴胺纳米微球作为二抗标记物，对三联吡啶钌有良好的猝灭效果，从而达到检测前列腺特异性抗原的目的，属于新型功能材料与生物传感技术领域。
背景技术：
前列腺癌是男性常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位居全球男性全部恶性肿瘤的第2 位和第6 位。与欧美发达国家和地区相比，中国前列腺癌的发病率和死亡率处于相对较低水平，但近年来随着中国人口老龄化步伐的加快、前列腺癌诊疗水平的提高和生活方式的转变等多种原因，前列腺癌对中国男性的危害有不断加剧的趋势，因此，对前列腺癌的早期诊断和早期治疗是很重要的。通过近年的研究发现，前列腺特异性抗原PSA可以作为前列腺癌标志物，它们在前列腺癌的早期预防和治疗中发挥着重要的作用。对血清中前列腺特异性抗原的浓度进行快速、灵敏检测具有非常重要的临床价值和意义，能够在最大程度上降低前列腺癌的死亡率，延长前列腺癌患者的生存期限，为患者争取更多的治疗机会。
目前用于检测前列腺特异性抗原的方法主要是放射性免疫法、酶联免疫分析法和荧光免疫分析法等，但这些方法存在不能即时快速检测、具有放射性污染以及操作复杂等弊端，而电致化学发光方法能够很好地克服这些弊端，它是一种基于抗原与抗体特异性识别而构建的免疫传感器，其制备过程简单、灵敏度高、检测限低、响应速度快，能够对抗原进行快速灵敏的检测。
技术实现要素：
本发明目的之一是将氨基化多壁碳纳米管掺杂到Nafion膜中，使三联吡啶钌快速扩散，稳定的固定在电极表面。
发明目的之二是利用简单的合成方法合成聚多巴胺纳米微球，微球大小均一，含有丰富的活性官能团，可以连接大量的二抗，从而形成夹心型结构，猝灭三联吡啶钌的发光，实现对前列腺特异性抗原的快速、灵敏、特异、高效检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于聚多巴胺纳米微球的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、0.3~0.7 mg/mL的氨基化多壁碳纳米管/Nafion溶液至电极表面，将电极浸入1 mM的三联吡啶钌溶液30 min，用超纯水冲洗电极表面；
（3）滴加6 µL、5~10 µg/mL的抗体溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（4）滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（5）滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（6）将电极浸入聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液2~6 h，置于4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面，制得聚多巴胺纳米微球构建的免疫传感器。
2. 聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液的制备
80~120 mg盐酸多巴胺加入到80~120 mL pH = 8.8的Tris缓冲溶液与30~70 mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24 h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5 mL超纯水中；在990 μL、100 μg/mL的抗体溶液中加入新鲜配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室温下震荡15 min，之后加入1 mL聚多巴胺纳米微球，在4℃下震荡12 h，用超纯水离心洗涤三次，得到聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液。
3. 前列腺特异性抗原的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0 ~ 1.2 V，扫描速率为0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 7.4的含浓度为15 mmol/L三丙胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的前列腺特异性抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）将氨基化多壁碳纳米管掺杂到Nafion膜中来固定三联吡啶钌，此复合膜具有更开放的结构和更大的表面积，可以使三联吡啶钌在膜中更快扩散。
（2）采用简单的合成方法制备的仿生聚多巴胺微球具有良好的生物相容性和生物可降解性，对三联吡啶钌有明显的猝灭效果，同时聚多巴胺纳米微球有丰富的氨基官能团，能够连接抗体作为二抗标记物。
（3）本发明制备的电致化学发光传感器用于前列腺特异性抗原标志物的检测，操作简单，反应快速，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、灵敏、特异性检测。
实施例1一种基于聚多巴胺纳米微球的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、0.3 mg/mL的氨基化多壁碳纳米管/Nafion溶液至电极表面，将电极浸入1 mM的三联吡啶钌溶液30 min，用超纯水冲洗电极表面；
（3）滴加6 µL、5 µg/mL的抗体溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（4）滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（5）滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（6）将电极浸入聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液2 h，置于4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面，制得聚多巴胺纳米微球构建的免疫传感器。
实施例2 一种基于聚多巴胺纳米微球的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、0.5 mg/mL的氨基化多壁碳纳米管/Nafion溶液至电极表面，将电极浸入1 mM的三联吡啶钌溶液30 min，用超纯水冲洗电极表面；
（3）滴加6 µL、7 µg/mL的抗体溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（4）滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（5）滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（6）将电极浸入聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液4 h，置于4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面，制得聚多巴胺纳米微球构建的免疫传感器。
实施例3一种基于聚多巴胺纳米微球的电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）滴涂6 μL、0.7 mg/mL的氨基化多壁碳纳米管/Nafion溶液至电极表面，将电极浸入1 mM的三联吡啶钌溶液30 min，用超纯水冲洗电极表面；
（3）滴加6 µL、10 µg/mL的抗体溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（4）滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（5）滴加6 µL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；
（6）将电极浸入聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液6 h，置于4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面，制得聚多巴胺纳米微球构建的免疫传感器。
实施例4 聚多巴胺纳米微球的制备
80 mg盐酸多巴胺加入到80 mL pH = 8.8的Tris缓冲溶液与30 mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24 h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5 mL超纯水中；在990 μL、100 μg/mL的抗体溶液中加入新鲜配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室温下震荡15 min，之后加入1 mL聚多巴胺纳米微球，在4℃下震荡12 h，用超纯水离心洗涤三次，得到聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液。
实施例5 聚多巴胺纳米微球的制备
100 mg盐酸多巴胺加入到100 mL pH = 8.8的Tris缓冲溶液与50 mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24 h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5 mL超纯水中；在990 μL、100 μg/mL的抗体溶液中加入新鲜配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室温下震荡15 min，之后加入1 mL聚多巴胺纳米微球，在4℃下震荡12 h，用超纯水离心洗涤三次，得到聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液。
实施例6 聚多巴胺纳米微球的制备
120 mg盐酸多巴胺加入到120 mL pH = 8.8的Tris缓冲溶液与70 mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24 h，将产品离心分离并用超纯水洗涤三次，之后将产物分散到5 mL超纯水中；在990 μL、100 μg/mL的抗体溶液中加入新鲜配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室温下震荡15 min，之后加入1 mL聚多巴胺纳米微球，在4℃下震荡12 h，用超纯水离心洗涤三次，得到聚多巴胺纳米微球二抗标记物溶液。