一种能够特异性结合癌细胞中的dkk1蛋白的适配子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检测领域，具体涉及一种能够特异性结合癌细胞中的DKK1蛋白 的适配子。
【背景技术】
[0002] DKK1编码一种分泌蛋白，其在脊椎动物发育至关重要的作用，并且是被称为Wnt 信号通路的结肠癌细胞的负调节。DKK1是Wnt信号通路的抑制因子，最早克隆于1998年， 发现其在非洲爪蟾早期发育中能够抑制fct诱导的轴的复制而参与头部的形成。Wnt通 路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞极性和 运动等过程，其通路中信号分子的突变或异常表达与多种疾病及癌症相关。fct通路受几 种分泌蛋白的调控，包括DKK、WIF(ffnt_lnhibitorfactor)和SFRP(secretedfrizzled relatedprotein)等。DKK家族包含进化上相对保守的4个成员（DKK1-4)。DKK1编码一 个分泌型糖蛋白，含有两个富含半胱氨酸的保守区域（Cysl、Cys2)，能够与低密度脂蛋白 受体相关蛋白 5/6 (low_densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5/6,LRP5/6) 结合，并在膜蛋白Kremenl/2参与下通过引起LRP5/6内吞，抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6 复合体的形成，而抑制经典的fct信号通路。已知在10种不同类型人肿瘤细胞培养上清 中检测出高浓度的DKK1蛋白，提示多种人肿瘤细胞分泌和高表达DKK1，DKK1可用于人类恶 性肿瘤的临床血清诊断。而且，最新的研宄表明DKK1蛋白（Dickkopf- 1)可 作为肿瘤标志物用于肝细胞癌（HCC)的血清诊断，可用于筛检甲胎蛋白（AFP)阴性患 者，对肝脏良、恶性疾病有较好的区分效用。因此，对DKK1蛋白进行特异性的检测具有较好 的应用价值。
[0003] 核酸适配子（aptamer)是一种生物大分子的人工单链寡核苷酸配体，通过 SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技术从随机单 链寡核苷酸文库中筛选获得。SELEX技术（即系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初 研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外 PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特 异性强的核苷酸适配子（aptamers)。该技术己成功运用于许多祀分子的筛选，包括金属离 子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济 等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文 库中筛选出的适配子具许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成 本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标 记。d.重复性好，稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子 /SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非 癌细胞间微小差异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。
[0004] 核酸适配子筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与 靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗 脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始 下一轮筛选；重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将 从文库中筛选出来并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度 及两端序列与文库相符者即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和 力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合癌细胞中的DKK1蛋白，可 以来实现癌的诊断与治疗。
[0006] 本发明采用以下技术方案： 体外合成一个含有38个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链DNA适 配子随机文库；以人DKK1蛋白其为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原 特异性DNA适配子；通过结构预测软件RNAStructureProgram分析预测适配子的二级结 构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到 了多个与表面抗原亲和力高、特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环 结构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合癌DKK1蛋白。所述适配子序列如下： DKK1-ap-2 ：GATAGCTAGATTAATGGTACAACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-4 ：GATAGCTAGATTAATGGTACACAACCTCCTCCATAACCACCACAATTGTAACAACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-5：GATAGCTAGATTAATGGTACTTAACGCACAAAACTGTCATCCAATACTCAACCTTCTT AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-6 ：GATAGCTAGATTAATGGTACCCACTATTATTACCGCTTCAATCACACACACCATTATA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-9：GATAGCTAGATTAATGGTACATCTTCACGCCTCATTACATTCACCTTTATCAGAACAA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-11:GATAGCTAGATTAATGGTACAAACCCTTAGACTCAACTTCTTCCGCCATAAACTTCTA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-12:GATAGCTAGATTAATGGTACCACATCCACCTCACATACGCACTAACTTACATCCTCAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-14：GATAGCTAGATTAATGGTACCATCGCTCATTTACCTCCTATAACTCTCAGATACACCC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-15 ：GATAGCTAGATTAATGGTACATATATTCTACCGCCTCTAAAACAAAGACTCTTCAATC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-17 ：GATAGCTAGATTAATGGTACCATTTATATTCACTTCTTCCTCACGCACTATACTTAAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-18：GATAGCTAGATTAATGGTACTCTAAGATAAACCACCACCAACTCTTATATATTACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-18' ：AACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA。
[0007] 本发明的有益效果：（1)获得了能够特异高效结合癌细胞中DKK1蛋白的适配子。 该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。（2)以核酸适配子为基础可以制备成为 靶向癌细胞的诊断和治疗药物。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1DKK1蛋白特异性结合DNA适配子的SELEX筛选 采用本领域常规的DKK1蛋白表达的方法。根据已知的基因序列，通过常规基因合成或 者基因组调取的方式来获得相应的基因序列，采用酵母表达的方法体外表达DKK1蛋白，获 得了相应的蛋白。也可以通过购买的方式获得，比如ProSpec，货号：PR0-673。
[0009] 化学合成初始寡核苷酸随机文库及引物，序列如下：（5'-GATAGCTAGATTAATGGTAC --N38--AGCATAAGATAGGATCAGTAC-3 ^ )，其中N38为38个随机寡核苷酸； 引物PI:GATAGCTAGATTAATGGTAC; 引物P2 :GTACTGATCCTATCTTATGCT。
[0010] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。70yg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugDKK1蛋白37°C孵育 30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L 尿素，0? 6mol/L醋酸按，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸4min，离心，取上清，无水乙 醇沉淀RNA，并重新溶解于20y1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转 录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA 为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。最后获得了 12个能够具有较好的与 DKK1蛋白特异性结合的适配子，其序列分别如SEQIDN0 :1-12所示。
[0011]实施例2特异性高亲和力的DKK1结合适配子的获得 将RNA适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，纯化回收 去磷酸化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[y-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。 lOnmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（l-200nM)的DKK1蛋白37°C孵育 30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留 的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与DKK1的解离常数。结果如下：
【主权项】
1. 一种特异性识别DKKl蛋白寡核苷酸序列，其特征在于为包括SEQ ID No. 1-12任一 条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。
2. 权利要求1所示的寡核苷酸序列在检测癌症中的应用。
3. 权利要求1所示的寡核苷酸序列在用于制备识别DKKl蛋白的试剂盒应用。
4. 权利要求1所示的寡核苷酸序列在用于制备检测癌症中的试剂盒应用。
5. 如权利要求4所示的应用，其特征在于：所述癌症为结肠癌、胃癌或肝癌。
【专利摘要】本发明公开了一种靶向人DKK1蛋白的核酸适配子及其序列。本发明应用新的组合化学技术SELEX，以DKK1蛋白为靶蛋白，从单链RNA随机文库中筛选出了能与DKK1蛋白特异性结合的DNA适配子。所述适配子在其随机序列区域能形成特殊的茎环结构，能特异性、高亲和力地结合DKK1蛋白或靶向结合至癌细胞。该适配子为癌症诊疗领域提供了一种特异高效的标记分子，并为开发癌症诊断试剂与治疗药物提供了新的选择。
【IPC分类】C12N15-115, G01N33-68
【公开号】CN104830867
【申请号】CN201510303692
【发明人】杨洋
【申请人】杨洋
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年6月7日