专利名称：一种新的乳腺癌相关蛋白及其特异性多克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种未知功能的蛋白及其特异性多克隆抗体，更特别地，本发明涉及一种新的乳腺癌相关蛋白及其特异性多克隆抗体。本发明还涉及所述多克隆抗体的制备方法和用途。
背景技术：
目前我国的乳腺癌总体发病率在30/10万以下，约为美国和北欧国家的1/4-1/3。但我国沿海地区如上海等城市发病率呈明显上升趋势(标化发病率由1974年的18.3/10万上升到1997年的46/10万)。乳腺癌已经成为威胁我国女性健康与生命的最常见的恶性肿瘤之一。
研究表明，肿瘤相关的分子标志对肿瘤的诊断和治疗起着重要的作用。雌激素受体(ER)和BRCA1等分子的表达，是临床上应用比较广泛的乳腺癌分子标志，对乳腺癌早期诊断，治疗和预后有着重要的参考价值。但是，由于肿瘤细胞的异质性和发生机制的复杂性，目前已知的分子标志只能解决部分患者的早期诊断和治疗指标的问题，因此寻找新的肿瘤标志分子，将为临床早发现早诊断和早治疗提供更多更可靠的靶分子，是肿瘤研究的重要内容。
KIAA0649基因于1998年首次被ISHIKAWA等人克隆出(Prediction of thecoding sequences of unidentified human genes.X.The complete sequencesof 100 new cDNA clones from brain which can code for large proteins invitro，DNA Res.5(3)，169-176(1998))，而关于该基因及其表达蛋白的功能至今没有文献报道。生物信息学分析，该基因位于人9号染色体(9q34.3)，cDNA序列全长4932bp，编码1209个氨基酸组成的KIAA0649蛋白，分子量为127352Da，该蛋白功能未知。
抗体技术是研究蛋白质功能和临床检测中重要的一环。抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性球蛋白，所以又称为免疫球蛋白(Ig)。但免疫球蛋白并不都具有抗体活性。人类Ig，根据其重链稳定区的分子结构和抗原性的不同，可分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。抗体存在于血清、粘膜分泌液及其它体液中，由遗传基因决定所产生的抗体称为天然抗体，而由抗原激发免疫细胞产生的抗体称为免疫抗体或称特异性抗体。特异性抗体是免疫应答中的重要产物，因此亦是免疫学实验中常用的试剂，对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学诊断中应用极为广泛。
由人工制备的特异性抗体分为三种类型，即多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。传统的方法是将抗原注入人体(如预防接种注射疫苗)或动物，由人或动物体内B淋巴细胞产生抗体。由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B淋巴细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称之为多克隆抗体。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的乳腺癌相关蛋白。
本发明的一个目的是提供本发明的新的乳腺癌相关蛋白在作为乳腺癌标志分子中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种与本发明的新的乳腺癌相关蛋白第496位至1209位氨基酸残基组成的多肽特异性结合的多克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供一种本发明的多克隆抗体的制备方法。
本发明的另一个目的是提供本发明的多克隆抗体在体外检测待测样品中是否存在本发明新的乳腺癌相关蛋白的用途。
本发明的另一个目的是提供含有本发明的多克隆抗体的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供本发明的多克隆抗体在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
一方面，本发明提供一种新的乳腺癌相关蛋白。GI(基因库索引号)7662223；NCBI Genbank登记号NM-014811；VERSION(版本)NM-014811.1。生物信息学分析，该基因位于人9号染色体(9q34.3)，cDNA序列全长4932bp，编码1209个氨基酸组成的KIAA0649蛋白(从550至4176)，分子量为127352Da，该蛋白功能未知。
本发明人在大量实验的基础上，利用与KIAA0649蛋白3’端(如SEQ ID NO2所述第496至1209位的氨基酸残基组成的多肽特异性结合的多克隆抗体，运用免疫组织化学技术以该抗体检测人乳腺癌病理组织中该蛋白的表达情况，结果表明该KIAA0649蛋白在癌组织表达阳性率非常高；癌旁组织中阳性表达率较高，远端正常乳腺组织表达率则极低。从而，以实验证明了KIAA0649蛋白为一个新的乳腺癌相关蛋白。另外，利用免疫组织化学方法研究了KIAA0649蛋白在30例乳腺癌组织中的表达情况，结果与正常组织的阳性率(11％)相比，在30例乳腺癌组织中的阳性率为96.67％，说明其为乳腺癌相关蛋白，进一步说明其为乳腺癌的新的标志分子。
本发明提供了KIAA0649蛋白在作为乳腺癌相关蛋白，尤其是作为乳腺癌标志分子中的应用。该分子将有可能作为乳腺癌病理诊断及恶性程度判定标准，并有可能成为乳腺癌的一个预后指标，从而为乳腺癌的诊断和临床治疗提供一个可能的分子基础。在本发明的一个实施方式中，采用与如SEQ ID NO2所示的乳腺癌相关蛋白特异性结合的多克隆抗体，体外检测待测样品中是否存在SEQ ID NO2所示的乳腺癌相关蛋白，其中存在SEQ ID NO2所示的乳腺癌相关蛋白的待测样品为与乳腺癌相关，需进一步鉴定。
在本发明的一个实施方式中，其中所述体外检测方法包括1)将待测样品与本发明所述的多克隆抗体孵育，所述的多克隆抗体与待测样品中的KIAA0649蛋白特异性结合，由此形成免疫复合物；并且2)检测是否存在免疫复合物。
另一方面，本发明提供一种多克隆抗体，该多克隆抗体与SEQ ID NO2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。本文所述的“抗体的特异性”是指多克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗原的识别能力就强。“多克隆抗体与抗原特异性结合”是指多克隆抗体特异性识别靶抗原并与靶抗原的不同抗原表位或抗原决定簇结合的特性。多克隆抗体与单克隆抗体不同，单克隆抗体是均质的，所有的单克隆抗体识别相应靶抗原的同一抗原表位，并且所有的单克隆抗体在结合特性方面的结构和功能是相同的；而多克隆抗体为异质的，所有的多克隆抗体不是来源于单一克隆，因此在结合机制及结构方面都有变化。在本发明中多克隆抗体是有好处的，一方面，由于所有的多克隆抗体对靶抗原是高度特异性的，另一方面，由于靶抗原上具有大量的抗原表位，而多克隆抗体与靶抗原的不同抗原表位结合，所以使多克隆抗体与靶抗原的结合产生协同效果，从而更好地识别靶抗原。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明的多克隆抗体对谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO2第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异性。所述多克隆抗体主要为IgG。
本领域普通技术人员已知，可以直接采用如SEQ ID NO2第496至1209氨基酸残基组成的多肽作为抗原，获得本发明的多克隆抗体。也可以将本发明如SEQ ID NO2第496至1209氨基酸残基组成的多肽与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，获得本发明的多克隆抗体。所述的标签选自，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽-S-转移酶标签(GST标签)、HA标签、HSV标签、Myc标签和VSV-G-标签。在本发明的一个实施方式中，采用GST与如SIQ IDNO2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白。
本发明的抗原可以按本领域技术人员已知的常规固相合成方法合成。例如本发明如SEQ ID NO2第496至1209位氨基酸序列可以按Steward and Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成。也可以先合成多个片段，然后连在一起形成更大的片段。优选本发明的抗原通过基因工程的方法获得。利用在原核生物或真核生物中表达含有编码本发明的抗原的多核苷酸序列。
虽然本发明KIAA0649蛋白的序列已经公开，但是发明人在大量实验的基础上，发现如SEQ ID NO2所示496至1209氨基酸残基组成的多肽足以作为抗原，免疫动物获得本发明的多克隆抗体，并且在原核生物中表达如SEQ ID NO2所示496至1209氨基酸残基组成的多肽。
在本发明的一个优选实施方式中，首先将KIAA0649蛋白cDNA的3’末端如SEQ ID NO1所示2035至4191位核苷酸序列克隆到原核表达载体pGEX4T-2(购自Pharmacia)中(pGEX4T-2/K2.1)，使其读码框架一致，利用BL-21菌株(购自Invitrogen)表达GST重组蛋白。
本领域普通技术人员熟知适用于表达本发明的抗原的载体。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)等。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择适当的载体。当然，可以在真核细胞中表达本发明的抗原，这时应使用适用于真核细胞的载体，例如pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)等。
可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的抗原。可提到的适当宿主的例子有原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；低等真核细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；植物细胞；高等真核细胞如哺乳动物细胞如CHO、COS细胞。哺乳动物表达系统的例子包括人细胞系，如Hela、293和U937细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，“诱导物”可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以化学物质或环境刺激，如，暴露于特定波长的光下。在本发明的一个优选实施方式中，采用的诱导物为IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。
抗血清的效价可根据抗体的不同性质，分别采用环状沉淀试验、琼脂双向扩散、单向免疫扩散、溶血实验、凝集反应、酶联免疫吸附实验及放射免疫分析等进行测定。在本发明的一个优选实施方式中，本发明的多克隆抗体分子量约为150kD，用酶联免疫吸附实验检测其抗体效价为10-5至10-6。
本发明提供一种本发明的多克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括将谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO2第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白作为抗原，免疫动物，取血，分出抗血清并纯化制得，制得的多克隆抗体与SEQ ID NO2所示的多肽特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异性。
在本发明的多克隆抗体的制备方法中，供免疫用的动物可为哺乳类和禽类，包括，但不限于，家兔、山羊或绵羊、马、骡和豚鼠等。动物种类的选择主要是根据抗原的特性和所要获得抗体的量和用途。对本发明的蛋白质抗原，大部分动物均适合，优选家兔和山羊，更优选家兔。对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。由于动物个体的免疫应答能力差异较大，每批免疫宜同时使用数只动物。
抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、免疫次数、注射途径以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，但剂量过高，又有可能造成免疫耐受。在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，小鼠首次抗原剂量为5-400μg/次；大鼠为10μg-1mg/次；兔为10μg-5mg/次，优选50-100μg。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。对本发明的包涵体来源的抗原常可加用佐剂，以增强抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，以刺激机体产生较强的免疫应答。如不加佐剂，则抗原剂量应加大约10-20倍。佐剂有弗氏(Freund’s)佐剂、脂质体佐剂及氢氧化铝佐剂等。其中最常用的是弗氏佐剂，根据其组成分为完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)两种。IFA通常由羊毛脂1份、石蜡油5份组成，每毫升IFA中加入1-20mg卡介苗即为CFA。
本发明的包涵体来源的抗原可采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2-6周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以抗原加IFA作2-5次加强免疫，每次间隔2-6周，皮下或腹腔注射加强免疫。完成免疫程序后，先取少量血清测试抗体效价达到要求时，即可从动物心脏穿刺(豚鼠及家兔)，颈静脉或颈动脉放血(家兔、羊及马匹)，待血液凝固后，离心沉淀分离出血清，加入0.1％叠氮钠作为防腐剂。
在本发明的一个优选实施方式中，提供了一种本发明的多克隆抗体的制备方法，其中，所述抗原由原核细胞表达，制备性SDS-PAGE胶纯化，纯度达电泳级；免疫动物时，将抗原与等体积完全弗氏佐剂混匀进行初次免疫，再次免疫时以不完全弗氏佐剂取代弗氏佐剂，两次免疫时间间隔2至4周，之后每隔一个月加强免疫一次并于加强后10天内取耳静脉血，用酶联免疫吸附实验检测其抗体效价，当抗体效价为10-5至10-6时，免疫后8至10天，取血，其中每次免疫量为1μg抗原量/g动物体重至1μg抗原量/10g动物体重；离心收集上清，制得多克隆抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲合色谱层析等方法。
本发明还提供了本发明的多克隆抗体的用途，在本发明的一个实施方式中，本发明提供了本发明的多克隆抗体在体外检测待测样品中是否存在KIAA0649蛋白中的用途，其中所述体外检测包括1)将待测样品与本发明所述的多克隆抗体孵育，所述的多克隆抗体与待测样品中的KIAA0649蛋白特异性结合，由此形成免疫复合物；并且2)检测是否存在免疫复合物。
所述的待测样品可以直接来自病人的病灶组织或周围组织，也可以来自石蜡切片。可以将待测样品预处理，以符合检测的需要。
检测是否存在免疫复合物的方法可以采用本领域普通技术人员已知的方式检测，例如荧光、发光、放射性或化学发光化合物或酶标记。这些标记的精确特性并不是特别关键，但是它应该能够通过其本身或与一种或多种额外物质结合(如酶的底物)，产生外源方法可检测的信号。
在本发明的一个实施方式中，采用Westen Blot方式检测样品中是否存在KIAA0649蛋白(参见实施例3)。本发明的一个实施方式中，利用本发明的多克隆抗体，采用免疫组化方法体外检测待测样品中是否存在KIAA0649蛋白(参见实施例4)。免疫组化方法常用的酶与ELISA检测使用的酶基本上相同，包括，但不限于，辣根过氧化物酶(horserad-ish Peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等，优选辣根过氧化物酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于，邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS和二氨基联苯胺(DAB)等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)。对于酶标IgG二抗及三抗等，现已有商品出售，可以直接商购获得。
本发明另一方面提供一种药物组合物，其含有本发明的多克隆抗体和必要时的药物可接受的载体或赋形剂。本发明的多克隆抗体可以与药物可接受的赋形剂或载体结合形成药物组合物。药物可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。
胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。
表皮给药包括在皮肤、黏膜上、以及在肺和眼的表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。在适于吸入的组合物中，本发明多克隆抗体被压缩或含于压缩气体如氮气或液化气体推进剂中。优选地，本发明多克隆抗体不溶于液化推进介质中。
直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的多克隆抗体与适宜的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或阴道腔内融化并释放出活性化合物。
当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明多克隆抗体可以是本发明多克隆抗体的单独形式，使用或不使用药物可接受的赋形剂。治疗有效量指以适宜的治疗方式对治疗肿瘤有效的本发明多克隆抗体的量。对任何特定患者的具体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和气其严重程度；所用具体多克隆抗体的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途径；多克隆抗体的排泄速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等。
在本发明的大量实验的基础上，本发明进一步提供了本发明的多克隆抗体在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。本发明制备的多克隆抗体可以与本发明的新的乳腺癌相关蛋白KIAA0649特异性结合，而乳腺癌相关蛋白KIAA0649在乳腺癌组织中强表达，并且在30例乳腺癌组织中的阳性率为96.67％，更进一步说明其为乳腺癌相关蛋白，尤其是乳腺癌的新的标志分子。
图1为SDS-PAGE分析用质粒pGEX4T-2/K2.1转化的JM109 & BL21菌株，其中，M为高分子量蛋白质标准；1-3和5为含有pGEX4T-2/K2的菌株JM109的总蛋白，未用IPTG诱导；4和6为含有pGEX4T-2/K2的菌株JM109的总蛋白，用IPTG诱导；7为含有pGEX4T-2/K2的菌株BL21的总蛋白，未用IPTG诱导；8为含有pGEX4T-2/K2的菌株BL21的总蛋白，未用IPTG诱导。
图2为蛋白纯化的SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色图，其中，M为高分子量蛋白质标准；1为含有pGEX4T-2/K2.1的菌株JM109的总蛋白，未用IPTG诱导；2为含有pGEX4T-2/K2.1的菌株JM109的总蛋白，用IPTG诱导；3为上清液中的蛋白质；4为包涵体中的蛋白质；5为来自包涵体的GST/K2.1纯化蛋白。
图3为用Western blot方法检测内源性KIAA0649蛋白在人类乳腺癌细胞系和宫颈癌细胞系的表达情况，其中，1为宫颈癌细胞系(Hela)的核蛋白，2为宫颈癌细胞系(Hela)的浆蛋白，3为乳腺癌细胞系(MCF-7)的总蛋白，4为乳腺癌细胞系(MCF-7)的核蛋白，5为乳腺癌细胞系(MCF-7)的浆蛋白，从图中可见，该蛋白主要分布在细胞核中。
图4A显示运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌组中的癌细胞表达情况，从图中可看出，乳腺癌组中的癌细胞团胞浆胞核均被染成棕色，即KIAA0649表达为阳性；图4B显示运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌旁组织中的癌变细胞团块中的表达情况，从图中可看出，乳腺癌旁组织中的癌变细胞团块中的癌细胞较癌组织中癌细胞体积小，但胞浆仍被染成棕色，即KIAA0649表达为阳性；图4C显示运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌远端正常组织中的癌细胞表达情况，从图中可看出，乳腺癌组织远端的正常乳腺腺泡由单层立方上皮围成，结构基本正常，KIAA0649表达阴性，图中棕色着色的部分为小血管内皮。
具体实施例方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1重组蛋白的诱导、表达及纯化1、表达质粒的构建采用酵母双杂交系统2(购自Clontech公司)并参照其说明书，从Hela细胞cDNA文库中得到与1A6/DRIM(柯杨等，化学致癌作用靶基因的分离与测序，中国科学，1996，2685-91，Schwirzke，M.et al Differential gene expressionin mammary carcinoma cell linesindentification of DRIM，a new genedown-regulated in metastasis.Anticancer Research.1998，181409-1422.)结合的蛋白KIAA0649的cDNA序列，即如SEQ ID NO1所示2035至4191位核苷酸序列。然后将KIAA0649片段克隆到pGEX4T-2原核表达载体，用于原核表达GST融合蛋白。
2、观察目的基因是否在大肠杆菌中表达以及IPTG的诱导浓度2.1在将表达质粒pGEX4T-2/K2.1转化入BL21(DE3)和(购自Invitrogen)菌株的平板上挑取单个克隆，接种于含氨苄青霉素(50ug/ml)的10mlLB中，37℃，225rpm，摇床上摇至OD值1.0左右。
2.2取四个摇菌管，分别加入上述菌液2ml，并编好号码，剩余的2ml存于4℃备用。在1、2、3号管中分别加入IPTG(购自sigma公司)至终浓度为0.1mM、0.5mM、1mM，4号管不加IPTG作为对照。37℃，225rpm，摇床上摇6小时左右。
2.3从1、2、3、4号管中分别取1ml菌液放入标记好的4个1.5mlEP管中，10000rpm，离心3分钟，沉淀细菌，彻底弃去培养液。沉淀加100ul 1×上样缓冲液(分子克隆第2版884页)。加蛋白质分子量标准，各样品上样15ul，另外加无转化质粒的大肠杆菌BL21(DE3)样品作对照，行SDS-PAGE胶电泳，并用考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白是否表达，0.1Mm、0.5mM、1mM IPTG诱导时目的基因目的蛋白的表达量，诱导表达的蛋白分子量是否与预期相同。
结果如图1所示，诱导表达的GST/K2.1重组蛋白分子量与预期相同，蛋白分子量为115KD。
3、观察目的蛋白的表达是否可溶用上述已经确定表达目的蛋白的菌液1ml加入到含氨苄青霉素(50ug/ml)的50ml LB中，20-30℃，225rpm摇床上摇至OD值约为2.0；加100mMIPTG至终浓度为0.1mM，继续按原条件培养2小时；7700g，4℃离心10min，收集细菌，弃上清；用1ml细胞裂解液溶解细菌沉淀，用碱变性法分离细菌中可溶性成分及包涵体成分，(方法见下面碱变性法提取包涵体中的重组蛋白)；用蛋白质分子量标准、IPTG未诱导样品、IPTG诱导样品、细菌超声后上清和初纯化的包涵体提取物成分，行SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色，观察诱导表达的目的蛋白是否可溶(表达的蛋白在上清中即为可溶)。
结果本发明的表达的蛋白为不可溶性蛋白。
4、重组蛋白的大量诱导挑取单克隆阳性表达菌，接种于100ml LB(Amp+)培养液中，37℃震荡培养过夜；次日以LB(Amp+)稀释至1000ml，继续培养至OD＝1左右，加IPTG至终浓度为1mM，继续培养6小时；4℃，5000rpm离心10分钟；沉淀以1×PBS洗涤后，分装(50ml菌液沉淀/管)，-70℃保存备用。
5、包涵体洗涤及碱变性法提取重组蛋白将上述PBS洗涤后沉淀加1ml细菌裂解液(1mM，PMSF；1mg/ml，lysozyme；用PBS配)，冰浴20分钟；加10ul Triton×100至终浓度为1％，冰浴10分钟；冰上间歇超声裂菌，20HZ，超声30秒，至菌液不粘；4℃，15000rpm离心25分钟，上清留做SDS-PAGE分析；沉淀为不溶性包涵体，加5倍体积包涵体洗液(10mM，EDTA)，冰上间歇超声30秒，悬浮沉淀；4℃，15000rpm离心15分钟；重复e)-f)4-5次，沉淀为不溶性包涵体；加5倍体积包含提洗液，冰上间歇超声30秒，悬浮沉淀。4℃，3,000rpm离心10分钟，吸出浑浊液体，弃沉淀；4℃，15000rpm离心15分钟；每1000ml表达菌加2ml变性缓冲液I悬浮(2mM，DTT；2mM，EDTA(pH8))，冰上间歇超声30秒；加等体积变性缓冲液II悬浮(40mM，NaOH)，冰上间歇超声1分钟；加1/4体积变性缓冲液III(40％，甘油；50mM，Tris-HCl(pH8.0)；1mM PMSF)，冰浴5分钟；4℃，15000rpm离心1小时，收集上清，为碱变性法初纯化的外源表达蛋白。
6、SDS-PAGE制备胶及电洗脱纯化重组蛋白SDS-PAGE制备胶的灌制洗净制备胶玻璃板两块，准备好边条3根，边条两面涂少许凡士林，将玻璃板垫好并夹住。用1％琼脂糖封闭已夹好的两块玻璃的底边和周边；配10％分离胶60ml，5％浓缩胶15ml；灌胶分离胶灌至玻璃板的2/3处，浓缩胶占分离胶的1/5，上面留有上样区域≥3cm；初纯化外源蛋白加等量2×SDS-PAGE上样缓冲液(100mM Tris-HCl(pH6.8)，20％甘油，200mMDTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝。(2×SDS上样缓冲液950ul+50ulβ-巯基乙醇))，沸水煮5min后上样，100V电泳6-7小时；电泳毕，用冷0.1MKCl浸泡胶2-3分钟，切下目的条带放入确保不漏的透析袋内；将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次日100V继续洗脱1小时，然后反转电极向相反方向洗脱3-5分钟；吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。
结果如图2所示，得到的纯化蛋白达到电泳级。
实施例2.抗血清、多克隆抗体的制备和鉴定1、抗体检测用试剂ELISA用液①ELISA包被液0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.5)；0.1M NaHCO3，500ml；0.1M Na2CO3，30ml；调pH至9.5。
②ELISA洗液0.05％Tween-20，用PBS(pH7.4)配制。
③ELISA封闭液及抗体稀释液1％BSA，用PBS(pH7.4)配制。
④ELISA底物反应液OPD 3.4mg；PBS(pH7.4)10ml；30％H2O2 5ul。
⑤ELISA反应终止液12.5％H2SO4。
2、抗血清的制备2.1动物雄性，6-8W日本长耳白兔4只，2500g/只。
2.2抗原GST/K2.1重组蛋白由原核表达，制备性SDS-PAGE胶纯化，纯度达电泳级，50ug/只/次。
2.3免疫程序及途径初次免疫KIAA0649抗原与等体积完全佛氏佐剂充混匀，形成油包水，于兔背部皮内多点注射；四周后第一次加强免疫，KIAA0649抗原与不完全佛氏佐剂等体积混匀，背部皮内多点注射；之后每隔一个月加强免疫一次并于加强后第10天取耳静脉血，用ELISA法测抗体效价；当抗体效价达10-5或10-6时，于末次加强免疫后第8-10天放血，收集血清；抗血清的收集将收集的血于4℃静置3-4小时，5,000rpm离心10分钟，收集上清。-70℃冻存备用。
3、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体滴度ELISA包被液稀释纯化GST/K2.1抗原，浓度为5ug/ml，包被96孔软板，50ul/孔，4℃过夜；0.05％Tween20-PBS洗2遍，1％BSA封闭，200ul/孔，室温1-2小时或4℃过夜；0.05％Tween20-PBS洗2遍，加入不同稀释度的抗血清(10-3，10-4，10-5，10-6)和正常兔血清(10-3)，50ul/孔，室温1小时；0.05％Tween20-PBS洗5遍，加羊抗兔HRP(1∶1000)50ul/孔，室温1小时；PBS洗5遍，加OPD显色液100ul/孔，避光显色，显色后加终止液50ul/孔。
结果抗体滴度可达10-5-10-6。
4、Western Blot检测多克隆抗体特异性取30ug核蛋白或浆蛋白行12％SDS-PAGE电泳，电泳结束后，小心取胶，按胶的大小裁剪硝酸纤维素膜或PVDF膜和滤纸，并浸泡于电转缓冲液中15min，(PVDF膜需用甲醇溶液泡1-2min)；安装转移装置先将两层滤纸放在海绵上，依次放置纤维素膜、凝胶及两层滤纸，使每层之间不留气泡，夹紧塑料支架放入电泳槽内，使硝酸纤维素膜一侧对正极、胶对阴极；接通电源，4℃、70V转膜2小时；转移结束后，取出NC膜，用丽春红染色(丽春红S(ponceauS)2g/l、三氯乙酸30g/l、磺基水杨酸30g/l)1-2min，蒸馏水冲洗至条带清晰可见，做好分子量标记；5％脱脂奶粉封闭4℃过夜或室温1小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤后加KIAA0649特异抗体(1∶500或1∶1000)4℃过夜或37℃1小时；用0.5％Tween20-PBS洗3次，时间分别为15min、5min和5min，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(购自北京中山生物公司)，室温作用1小时；用0.5％Tween20-PBS洗3次后按ECLTM(Western blotting detection reagents，购自amersham pharmacia biotech)说明书方法进行化学发光、X光片曝光、洗片。
结果参见图3，该内源性KIAA0649蛋白主要分布在细胞核中。
实施例3运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌的表达情况1、标本来源本实验所用的乳腺癌病例均为临床和病理诊断明确的病例。有癌组织30例，与之相应的癌旁组织标本17例、正常组织标本18例。正常组织均为相应手术癌标本的远端组织。免疫组织化学用石蜡组织切片来自北京大学临床肿瘤学院病理科。
2、免疫组织化学实验步骤石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯，60min，3次；；100％乙醇，3min，2次；95％乙醇，3min；7 5％乙醇，3min；蒸馏水冲洗，1×PBS再洗一次)；1％H2O2阻断内源性过氧化物酶室温，10min；抗原微波修复切片放入修复液(9ml 0.1M枸橼酸溶液和41ml 0.1M枸橼酸钠溶液液加入450ml水中，溶液pH应为6.0)中92℃-98℃至少维持10min后室温冷却20-30min；1×PBS洗3次每次5min，10％正常羊血清37℃封闭1小时或4℃过夜；吸去羊血清(勿洗)，加入本发明的多克隆抗体(一抗)(1∶200)4℃过夜；1×PBS洗3次每次5min，加入生物素标记的羊抗鼠二抗(购自北京中山生物公司)，37℃作用30min至1小时；1×PBS洗3次每次5min，加入辣根过氧化物酶标记的三抗链霉卵白素(HRP-Strepavidin)(购自北京中山生物公司)，37℃作用30min至1小时；1×PBS洗3次每次5min，DAB避光显色5-10min(DAB 5mg；PBS 10ml；30％H2O25ul)，镜下观察有信号时可用自来水冲洗终止反应，10％苏木精复染(自来水冲洗)，1％盐酸-酒精分色(可滴片并直接泡在1×PBS里然后用水冲)；逐级酒精脱水、二甲苯透明(75％乙醇，3min；95％乙醇，3min；100％乙醇，3min，2次；二甲苯，3min，2次)；中性树胶加盖玻片封片。
结果如图4A所示，乳腺癌组中的癌细胞团，胞浆胞核均被染成棕色，即KIAA0649表达为阳性；如图4B所示，乳腺癌旁组织中癌变团块中的癌细胞较癌组织中的癌细胞体积小，但胞浆仍被染成棕色，即KIAA0649表达阳性；如图4C所示，乳腺癌组织远端的正常乳腺腺泡由单层立方上皮围成，结构基本正常，KIAA0649表达阴性，图中棕色着色的部分为小血管内皮。
3、利用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌的表达情况将癌组织30例，与之相应的癌旁组织标本17例、正常组织标本18例，分别按照上述免疫组织化学实验步骤的方法研究KIAA0649在乳腺癌的表达情况。
结果见表1。
表1、KIAA0649在乳腺癌的表达情况
结论如表1所示，KIAA0649蛋白在癌组织表达阳性率非常高；癌旁组织中阳性表达率较高，远端正常乳腺组织表达率则极低。表明KIAA0649在乳腺癌组织中的表达与乳腺癌的发展进程密切相关，强烈提示该蛋白极有可能成为一个新的乳腺癌标志分子，并预示着该蛋白分子有非常好的理论研究价值和临床应用前景。
序列表<110>北京市肿瘤防治研究所<120>一种新的乳腺癌相关蛋白及其特异性多克隆抗体<130>D0311026F<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4932<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(550)..(4179)<223>
<400>1gcgcggcccg ggcgcggggc ggcggcagcg gcggcgcgcg gggaggcggg gaggcggggg 60gcccggccgg acgcccctgc gccccctccc cgcgccccgg ccgagggcgg agcgcgctgg120ccctgcagcc tccggcccgc ccccggcccg ccgcctcccc cgggacgtgg gacgcgggcg180caggcggggt ccgcgcggcg ggcggcgggg gacgggcgga gtcaaaagtc tattgaaaaa240gcagagagag aatgcctcgg tgtgtaagtg gagtgatgag gacctgatct ctgggccgtg300tgggaacact ggctgccatt tcatcacagt caacctggac tcacagaatt tcaagagctt360gtcggttggg tcaagaatga acctacgcat gacggcgtgc tgatcctggg tttctagtca420tcctttttaa gctgcaaaga agcatttgca gacgttgtct catgggtacc gcttgccaac480tttggaggat gtgaagccgg tagagaaata aagcatcgcc cctctgcgcg cccctccccg540tctgctaga atg ttt ctc atg aac gct tct cca gtg gtt gct ctc cag tcc591Met Phe Leu Met Asn Ala Ser Pro Val Val Ala Leu Gln Ser1 5 10aaa tgg gag gcc ttt ggc ccg cca ggg agc tgt agg ttc ccc agg tgc 639Lys Trp Glu Ala Phe Gly Pro Pro Gly Ser Cys Arg Phe Pro Arg Cys15 20 25 30ttc tcg gag gct gac gag ggc gtg gag agc gcg tcg gtg agc gcc cgg 687Phe Ser Glu Ala Asp Glu Gly Val Glu Ser Ala Ser Val Ser Ala Arg35 40 45
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1.一种新的乳腺癌相关蛋白，该蛋白由KIAA0649基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.如权利要求1所述的蛋白在作为乳腺癌标志分子中的应用。
3.如权利要求2所述的蛋白在作为乳腺癌标志分子中的应用，其中采用与如SEQ ID NO2所示的乳腺癌相关蛋白特异性结合的多克隆抗体，体外检测待测样品中是否存在SEQ ID NO2所示的乳腺癌相关蛋白，其中存在SEQ ID NO2所示的乳腺癌相关蛋白的待测样品为与乳腺癌相关，需进一步鉴定。
4.一种多克隆抗体，该多克隆抗体与SEQ ID NO2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。
5.如权利要求4所述的多克隆抗体，该多克隆抗体与谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异性。
6.如权利要求5所述的多克隆抗体，该多克隆抗体分子量约为150kD，用酶联免疫吸附实验检测其抗体效价为10-5至10-6。
7.一种如权利要求4至6任一项所述的多克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括将谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白作为抗原，免疫动物，取血，分出抗血清并纯化制得，制得的多克隆抗体与SEQ ID NO2所示的多肽特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异性。
8.如权利要求4至6任一项所述的多克隆抗体在体外检测待测样品中是否存在KIAA0649蛋白中的用途，其中所述体外检测包括1)将待测样品与如权利要求4至6任一项所述的多克隆抗体孵育，所述的多克隆抗体与待测样品中的KIAA0649蛋白特异性结合，由此形成免疫复合物；并且2)检测是否存在免疫复合物。
9.一种药物组合物，其包含如权利要求4至6任一项的多克隆抗体和必要时药物可接受的载体或赋形剂。
10.如权利要求4至6任一项的多克隆抗体在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的乳腺癌相关蛋白KIAA0649及与KIAA0649蛋白3’端如SEQ ID NO2所示第496至1209位的氨基酸残基组成的多肽特异性结合的多克隆抗体。本发明还涉及所述多克隆抗体的制备方法和用途。
文档编号C07K16/18GK1618810SQ200310115389
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者柯杨, 杜晓娟, 宁涛, 杨琳, 赵军 申请人:北京市肿瘤防治研究所