一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，包括以下步骤：(1)根据BVDV-E2基因序列，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，连接至pMD18T，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果分析；(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化；(3)抗E2-IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000沉淀法提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析，ELISA效价监测，Western blotting特异性分析。本发明提取的抗E2-IgY抗体可较好地结合E2蛋白，而与降解片段无交叉反应。
【专利说明】一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种特异性IgY的制备和应用，具体涉及一种抗 牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法。
【背景技术】
[0002] 牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea, BVD)，又称牛病毒性腹泻.粘膜病 (Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起牛的多种临床症状如高热、白细胞减少、沉郁、下痢、大 量流涎、减奶以至停奶、反刍停止、结膜炎、口腔粘膜出血并出现溃疡症状等的一种疾病。孕 牛可能流产、产死胎和畸形胎等。还可引起牛的免疫耐受与持续性感染，免疫抑制。
[0003] 该病在世界范围内广泛流行，给世界各国畜牧业造成了严重的经济损失，每年死 于此感染的牛不少于500万头，同时由于其持续感染等造成的间接损失也严重阻碍了畜牧 业的发展。
[0004] 目前国内外主要的检测方法有：
[0005] PCR技术具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点，已广泛用于多个领域。近几年 来，又有新的发展。RT-PCR可以敏感快速地从组织、排泄物、血清、细胞培养物等检出BVDV 而且可以区分猪瘟和羊边界病毒，利用该方法还可以进行BVDV核酸序列的研究。
[0006] 病毒分离技术是一种最基本、最准确的检测方法。常用来分离BVDV用的细胞是牛 鼻气管细胞（BT)和牛肾细胞传代细胞株（MDBK)。
[0007] 电镜技术成为病毒学研究、快速诊断不可或缺的手段。这种方法快捷、方便、直观。 然而电镜观察需要高含量的病毒粒子，需要对病毒进行浓缩。
[0008] 抗体的检测可以为免疫接种程序的制定和临床诊断提供依据。相比其它抗体检测 方法，胶体金试纸条和ELISA试剂盒操作简便，价格低廉，在临床上被广泛应用，胶体金试 纸条和传统的HI相比，其敏感性和特异性达到97. 1 %，76. 6%，而ELISA试剂盒阳性检出率 达到85 %，和HI符合率达到80 %。
[0009] IgY技术，即通过对禽类（鸡）免疫注射特定抗原，从卵黄中获得特异性多克隆抗 体。相对于哺乳动物抗体，IgY技术避免了常规的动物采血，满足动物福利要求，且抗体产量 大，制备相对简单，经济优势明显，更为重要的是，IgY还具有一系列生物学与抗体特性与优 势。近年来，IgY抗体在医药、生物【技术领域】都呈现出良好的发展势头。IgY已广泛应用于 细菌、病毒等病原体检测，特异性、敏感性较好，同时能够降低BVDV治疗成本和基于IgY检 测试剂盒的研制奠定基础。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2 特异性IgY的制备方法，以便用于BVDV病毒的检测与治疗。
[0011] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：
[0012] -种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其特征在于，所述方法 包括以下步骤：
[0013] (1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV-E2基因序列，利用 primer prime 5.0 软件，设计一对引物，PCR 扩增 BVDV-E2 基因（1040bp)，连接至 pMD18-T 载体，转化DH5 a感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。
[0014] (2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化。pMD18-T-E2和pET-32a载体使用BamH I 和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21(DE3)pLysS感受 态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达。表达产物经 SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明，构 建成功pET-32a-E2表达载体，重组E2蛋白在0. 75mmol/L的IPTG诱导5h，主要以包涵体形 式存在，43ku附近出现片段，表达产物经Ni+柱纯化后。Western blot表明重组蛋白具有 良好的反应原性。
[0015] (3)抗E2-IgY抗体的制备。纯化的E2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000提取特异 性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。间接ELISA测定免疫后抗E2-IgY抗体效价，Western blot鉴定所获抗E2-IgY的特异性。结果表明，IgY抗体经SDS-PAGE分析包含两条链，重链 (65ku)和轻链（19ku);四免后，抗E2-IgY效价达到I : 128000，Western blot表明，所制 备IgY抗体可特异性结合E2蛋白。
[0016] 所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为 300 ii g/只,初次免疫21天之后,进行4次加强免疫,间隔时间为21天,免疫剂量为250 ii g/ 只，所属禽类为鸡。
[0017] 所述提取IgY的方法如下；
[0018] (1)将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS (pH 7. 4)按 照体积比1:2进行稀释；
[0019] (2)向稀释液加入质量体积比为3. 5%的PEG-6000,充分搅拌，摇床上室温作用30 分钟；
[0020] (3)将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8. 5%的PEG-6000,充 分搅拌，摇床上室温作用30分钟；
[0021] (4)将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入 质量体积比为12%的PEG-6000,充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀 物；
[0022] (5)将所述沉淀物使用1. 2毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透析 过夜，获得IgY，并保存在_20°C备用。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024] (1)本发明的方法提取的重组蛋白具有良好的反应原性；
[0025] (2)本发明提取的抗E2_IgY抗体可较好地结合E2蛋白，而与降解片段无交叉反 应；
[0026] (3)提取方法相对简单，抗体产量大，制备成本低。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明。
[0028] -种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白IgY的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0029] (1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析。根据GenBank报道的有关 BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5. 0软件，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因 (KMObp)，连接至pMD18-T载体，转化DH5 a感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切 分析，阳性质粒测序。
[0030] (2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化。pMD18-T-E2和pET-32a载体使用BamHI 和XhoI双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21 (DE3)pLysS感受 态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达。表达产物经 SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明，构 建成功pET-32a-E2表达载体，重组E2蛋白在0. 75mmol/L的IPTG诱导5h，主要以包涵体形 式存在，在43ku附近出现片段。表达产物经Ni+柱纯化后，Western blot表明重组蛋白具 有良好的反应原性。
[0031] (3)抗E2-IgY抗体的制备。纯化的E2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000提取特异 性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。间接ELISA测定免疫后抗E2-IgY抗体效价，Western blot鉴定所获抗E2-IgY的特异性。结果表明，IgY抗体经SDS-PAGE分析包含两条链，重链 (65ku)和轻链（19ku);四免后，抗E2-IgY效价达到I : 128000，Western blot表明，所制 备IgY抗体可特异性结合E2蛋白。
[0032] 实施例
[0033] 本实施例拟对BVDV-E2结构蛋白进行克隆，构建原核表达载体pET-32a_E2,表达 和纯化E2蛋白，并将其作为免疫原，免疫产蛋鸡，生产抗E2重组蛋白特异性IgY抗体。 [0034] 1、引物设计与合成
[0035] 根据GenBank登记的牛病毒性腹泻病毒参考株（FJ011098)序列，使用软件 Primer Prime 5.0设计一对引物，用于扩增E2基因全长DNA序列（11040bp)。上游引 物P : 5，-ATGGATCCAATATAGACTCGGCG-3，（下划线处为BamH I酶切位点），下游引物R : 5, -CCGCTCGAGACCATGGTATGTCTA-3,(下划线处为Xho I酶切位点）。引物由上海生工公司 合成，双蒸水稀释为lOpmol/y L，-20°C保存。
[0036] 2、E2基因的PCR扩增
[0037] 模板制备：取病毒上清50ii L，沸水煮IOmin后，12000rpm离心lOmin，取上清。
[0038] PCR反应体系如下：
[0039]
【权利要求】
1. 一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特征在于：包括以下步 骤： (1) 牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV-E2基因序列，利用软件 设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，连接至pMD18T载体，转化DH5a感受态细胞，经蓝 白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果进行比较分析； (2) E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化：pMD18T和pET-32a载体使用BamH I和Xho I 双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21 (DE3)pLysS感受态细菌，酶 切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达，使用Ni+亲和层析柱对重 组蛋白进行纯化； (3) 抗E2-IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫白色来杭产蛋鸡，使用PEG6000提取特 异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。
2. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其 特征在于：步骤（1)中根据GenBank报道的有关BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5. 0 软件，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，为1040bp，连接至pMD18T载体，转化DH5 a感 受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。
3. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其 特征在于：步骤（2)中表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后使用Ni+亲和层析柱 对重组蛋白进行纯化。
4. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其 特征在于：步骤（3)中，对提取特异性IgY抗体进行SDS-PAGE分析，间接ELISA测定免疫后 抗E2-IgY抗体效价，Western blotting鉴定所获抗E2-IgY的特异性。
5. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法， 其特征在于：所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为 200?800 ii g/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为 200 ?800 ii g/ 只。
6. 根据权利要求5所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其 特征在于：所述禽类为鸡。
7. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其 特征在于：所述步骤（3)中提取IgY的方法如下； (1) 将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照体积比 1 : 1. 5?2. 5进行稀释； (2) 向稀释液加入质量体积比为2. 5?5%的PEG-6000,充分搅拌，摇床上室温作用 20?30分钟； (3) 将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为6?9%的PEG-6000,充分 搅拌，摇床上室温作用20?30分钟； (4) 将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量 体积比为10?13%的PEG-6000,充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟，再进行离心，获 得沉淀物； (5) 将所述沉淀物使用1. 2?1. 5毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透 析过夜，获得IgY，并保存在-20°C备用。
8.根据权利要求7所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其 特征在于：所述PBS的pH值为7. 2?7. 5。
【文档编号】C07K16/02GK104356232SQ201410603881
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】张小莺, 王媛, 任昊, 江雪梅 申请人:西北农林科技大学