抗原特异性结合蛋白或配体特异性结合蛋白的鉴定的制作方法

专利名称：抗原特异性结合蛋白或配体特异性结合蛋白的鉴定的制作方法
技术领域：
本发明披露了用于在体外在脊椎动物细胞中产生、表达并且筛选多样的结合蛋白 集合的新颖方法，允许鉴定并且分离配体反应性或抗原反应性的结合蛋白。具体地，本发明 涉及用于逆转录病毒的表达、分离并且鉴定至少一种核苷酸序列的方法，该核苷酸序列编 码了一种结合蛋白，例如对于一种令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段。背景展示技术在分离特异性的高亲和力结合蛋白、用于在多种紊乱和疾病中进行诊断 性和治疗性应用方面发挥一种重要的作用。这些技术延伸到抗体工程化处理、合成酶类、蛋 白质组学、以及无细胞的蛋白质合成的广阔领域内。生物分子展示技术(这些技术允许模 块化地编码生物分子的大库的构建、它们针对特性选择的展示、以及它们结构的快速表征 (解码))对于大规模地评估并且分析蛋白的多样性是特别有用的。近来，体外展示技术已 经变得引人注目，这是由于通过噬菌体展示、核糖体展示以及微生物展示来分离抗体的缘 故，它们现在已经变成主流的抗体和蛋白质工程平台。然而，微生物表达和展示系统受到多 种限制，特别是对于表达大的二聚体脊椎动物蛋白质而言，例如抗体。这是由于在此类表达 系统中一般没有表达全长抗体的能力(这要求展示工程化处理的抗体片段)，而且还由于 缺少糖基化作用、缺乏伴侣蛋白、缺少亚细胞区室以及真核细胞特异性蛋白质运输，这些单 独地并且共同地在微生物表达的哺乳动物蛋白中导致蛋白质折叠的假象(artefact)。近 来，采用真核宿主细胞(包括酵母、植物、以及哺乳动物细胞)还已经开发了多种体外展示 方法。酵母和植物细胞的表达系统也受到缺少糖基化作用、以及特异性脊椎动物和哺乳动 物细胞特异性分子伴侣的困扰，这样使得对于蛋白质折叠的同样限制施用于脊椎动物蛋白 在此类系统中的表达。大的重组蛋白(像抗体)的表达、适当的蛋白质折叠以及翻译后修 饰仅能够预期在脊椎动物表达系统中以合理的效率和质量发生，在种系发育方面最接近相 关细胞的系统中理想地表达多种蛋白。因此，在治疗方面感兴趣的蛋白(像来自啮齿动物或人类的抗体)理想地表达于 啮齿动物细胞或人类细胞中，并且并非出乎意料的是监管机构仅批准来自此类物种的表达 系统用于临床级全长治疗性抗体的生产。然而，基于脊椎动物以及哺乳动物细胞的表达系 统是费力的，要求长时间期限来建立稳定生产的细胞系和克隆，并且此类细胞的一种有效 的并且可控的遗传修饰通常并非是微不足道的并且因此使这些系统对于多种筛选和展示 方法吸引性欠佳。例如，DNA转染方法不能用来控制被瞬间地或稳定地结合到经转染的细 胞中的DNA构建体的数目，这排除了蛋白质文库的克隆表达并且因此将一种干净的基因 (clean gene)用于表型筛选。这些替代性病毒系统缺少对于克隆表达的适当控制、对于这 些遗传构建体的稳定维持，和/或经受以下事实此类系统经常在这些靶细胞中引起细胞 致病作用(例如，痘苗病毒表达)，这样使得蛋白质克隆不能得到展示和/或被顺序地富集 用于一种特定的表型，像例如特异性结合到一种抗原上。因此，本发明的一个目的是提供一种方法，该方法明显地克服了现有技术中原核 和真核基因表达以及选择系统的所有以上提到的限制和缺点。根据本发明的方法利用了结合蛋白的稳定的逆转录病毒表达，例如(特别是)哺乳动物细胞中、特别是B淋巴细胞系中 的抗体，这样使得当存在适当的糖基化作用、侣伴蛋白质以及蛋白质运输时实现了抗体蛋 白的稳定的并且优选的克隆表达，确保适当的蛋白质折叠并且允许有效地并且重复地筛选 (若希望的话)结合抗原的抗体克隆。因为根据本发明的方法的优选实施方案是基于在前 体淋巴细胞中抗体或其片段的逆转录病毒表达的，在此披露的技术被称为‘逆转录细胞展 示，(‘Retrocyte Display’ )(全称为逆转录病毒前体B淋巴细胞展示)。发明概述本发明总体上涉及治疗性或诊断性抗体或其片段的规定。具体地，它涉及具有完 全人类氨基酸序列的抗原反应性抗体的鉴定以及选择，这些序列对于治疗性应用是令人感 兴趣的。本发明的这些实施方案涉及能够在脊椎动物(优选哺乳动物)细胞中表达多样的 结合蛋白(包括抗体或其片段)集合的逆转录病毒表达载体、以及用于将配体反应性或抗 原反应性分子有效分离的多种方法。本发明提供了用于产生多样的结合蛋白(例如抗体或 其片段)集合的新颖方法，这是通过三种替代性方法来进行的。首先，通过至少一种重链或 轻链分子对一个多样的轻链或重链集合(文库)进行链改组，(链改组方法)，或其次，通 过由逆转录病毒转导的表达构建体的体细胞突变(体细胞突变方法)在原位逆转录病毒转 导进入脊椎动物细胞之后进行的一种抗体重链与轻链的至少一种组合的多样化，或第三， 通过逆转录病毒转导的表达构建体(这些构建体含有针对抗体的可变结合域的编码区)的 V(D)J重组称为“准胚系”(“quasi-germline”)构型的，例如仍然分成V、可任选地D以及 J基因片段(V(D)J的重组方法。应当理解，多样的结合蛋白(包括抗体或其片段)集合还 可以通过以上提及的方法中的任何组合而产生。优选地，所述结合蛋白或抗体或其片段在 前体淋巴细胞的表面上展示。与本领域已知的可替代的、基于质粒或基于非整合性病毒的脊椎动物表达系统相 比，本发明特别地提供了允许使用逆转录病毒转导在脊椎动物细胞中稳定地(并且可任选 地克隆地)表达的多样的结合蛋白(优选抗体)集合的方法，这种逆转录病毒转导显著地 促进了编码结合蛋白的基因的扩增、分离、以及克隆。作为一种代表性的但不并非限制性的 实例，在此披露了不能表达内源性抗体的鼠前体淋巴细胞的逆转录病毒的转导，这样使得 在这些宿主细胞中只有异源性的重组抗体被表达为膜结合型抗体。而且，本发明说明了怎 样可以分离表达配体反应性或抗原反应性结合蛋白(例如，抗体或其片段)的细胞、并且将 其任选地在体外进行扩展，以便反复地富集一个抗原反应性结合物细胞群，随后可以将来 自这些细胞的、编码了抗原反应性或配体反应性结合蛋白的基因进行克隆并且通过本领域 中已知的标准的分子生物学操作进行测序(

图1)。尽管根据本发明的方法的一个优选实施方案是针对结合蛋白(优选人类全长抗 体)的逆转录病毒表达的，它同样可以用于表达它们的任何片段(例如，抗体的单链&或 Fab片段)。在此披露了逆转录病毒转导的科学试验方案，该方案可任选地允许(i)将编码 单一结合蛋白的构建体递送到单一的靶细胞中，以便确保结合蛋白在这些宿主细胞中的克 隆表达；(ii)将编码一种第一多肽链的至少一种表达构建体与编码一种第二多肽链的至 少一种表达构建体进行改组，由此产生一种功能性的多聚体结合蛋白(例如，一种抗体分 子)；(iii)当在原位对脊椎动物细胞进行转导时对编码至少一种结合蛋白的至少一种表 达构建体的体细胞进行突变；以及(iv)当原位逆转录病毒转导进入脊椎动物细胞时通过V(D)J重组的机理从至少一种表达构建体中产生结合蛋白表达。为了原位实现编码构建体的结合蛋白的体细胞突变，在此披露了逆转录病毒表达 载体以及它们的应用，其中所述载体含有将体细胞超突变(hypermutation)靶向到编码蛋 白的序列上的顺式调控基因元件，这是优选地经由一种活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)途径 (Papavasiliou & SchatZ，2002)、或使用将体细胞突变靶向到编码结合蛋白的序列上的其 他酶类来进行的。为了通过V(D)J原位重组来产生多样的结合蛋白(优选抗体或其片段) 集合，在此披露了多种逆转录病毒载体构建体以及它们的应用，其中所述构建体包含以“准 胚系”构型安排的可变区(V)、可任选地多变区(D)以及连接区(J)的基因片段，允许通过 被称作V(D)J重组的过程、经由这些基因片段的重组活化基因(RAG)-介导的重排、将针对 免疫球蛋白或免疫球蛋白样结合蛋白的编码区进行装配(Grammder et al.，1998)。根据另一个方面，本发明进一步说明了稳定地表达多样的重组结合蛋白集合的 逆转录病毒转导细胞是如何随后通过与感兴趣的至少一种配体或抗原相结合来得到标 记的，以及与以上提及的感兴趣的配体或抗原相结合的细胞是如何通过适当的二级试剂 (secondary reagent)检测到的。在此说明了用于特异性地标记配体反应性细胞或抗原反 应性细胞、以及它们的富集或分离的方法，优选通过高速荧光激活细胞分选(FACS)。由于 逆转录病毒转导细胞的稳定表达表型，说明的是如何可以任选地将抗原反应性细胞分离、 并且通过组织培养(in tissueculture)再次进行扩展，这样可以进行任选反复循环的抗原 标记、抗原定向的富集、以及配体反应性或抗原反应性细胞的扩增，直到进行这些细胞的亚 克隆，允许通过多种标准的PCR克隆方法来鉴定针对抗原反应性抗体的核苷酸编码区(图 1)。在此披露的这些方法允许从至少一种载体构建体中表达多样的抗体链或其片段 的集合，该载体构建体当转移并且原位表达到脊椎动物的细胞中时可任选地能够产生多样 结合蛋白集合。抗体链在脊椎动物细胞中的表达是优选地由逆转录病毒转导所介导的。这样，本发明的第一个方面涉及用于分离并且鉴定至少一种核苷酸序列的方法， 该核苷酸序列编码了对一种令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段，包括以下步骤(a)将至少一种编码了抗体或其片段的逆转录病毒表达构建体转导到脊椎动物宿 主细胞中；(b)将所述抗体或其片段表达于所述脊椎动物宿主细胞中；(c)基于它们结合到所述令人希望的抗原或配体的能力将表达所述抗体或其片段 的脊椎动物宿主细胞富集；并且(d)将所述至少一种编码了所述抗体或其片段的核苷酸序列从这些逆转录病毒转 导的并且富集的脊椎动物宿主细胞中进行分离并且鉴定。除了以上提及的步骤之外，步骤(d)之前可以是将这些富集的脊椎动物宿主细胞 通过组织培养进行扩展的一个步骤。而且，步骤(C)之后可以跟随将这些富集的脊椎动物 宿主细胞通过组织培养进行扩展的一个步骤，在这之后在执行步骤(d)之前将步骤(C)重 复至少一次。为了实现至少一种抗体的克隆表达，优选的是控制这种逆转录病毒转导，这样逆 转录病毒转导的细胞中大多数细胞是通过每条整合到宿主细胞基因组内的抗体链中仅有 的一个重组逆转录病毒构建体进行遗传修饰的。因此，在本发明的一个实施方案中，逆转录
6病毒转导是以等于或小于0. 1的感染复数(MOI)进行的。根据本发明的一种方法的一种抗体优选地是一种全长抗体。一种抗体的片段可以 选自下组，其组成为一条重链、一条轻链、一种Vh单域、一种\单域、一种scFv片段、一种 Fab片段、以及一种F(ab’)2片段。该抗体或它的一个或多个片段可以具有一种自然发生 的氨基酸序列、一种人工工程化处理的氨基酸序列或它们的组合。尽管本发明的方法优选地用于分离并且鉴定对一种抗体链进行编码的至少一种 核苷酸序列，对于本领域内的普通技术人员而言清楚的是本发明的方法还可以用于分离并 且识别至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码了属于Ig-超级家族的任何一种单体或多 聚体的细胞表面受体以及其任何功能片段、或属于TNF α -受体超家族的一种单体或多聚 体的细胞表面受体或其任何片段。而且，其中这种结合蛋白是一种全长抗体，该全长抗体选自下组，其组成为一种 完全人类抗体、一种人源化抗体(其中一种或多种非人类抗体的CDR区已经被移植到一种 人类抗体的框架上)、以及一种嵌合抗体(其中来自一种脊椎动物物种的可变区结构域与 另一种脊椎动物物种的恒定区结构域相结合，其中该嵌合体抗体的恒定区结构域优选地衍 生自一种或多种人类抗体)。在此处披露的这些方法的一个实施方案中，这些脊椎动物宿主细胞可以衍生自一 组物种，这些物种包括软骨鱼类、硬骨鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、以及哺乳动物类。这组 哺乳动物物种可以包括猪、羊、牛、马以及啮齿动物。这组啮齿动物可以进一步包括小鼠、 大鼠、兔、以及豚鼠。在本发明的一个优选实施方案中，这些脊椎动物宿主细胞物种是小鼠 (Mus musculus)。在本发明的一种方法中所使用的脊椎动物宿主细胞可以衍生自任何脊椎动物器 官，但优选地衍生自淋巴细胞系细胞。用于本发明的优选的淋巴细胞是B细胞系，因为这 些细胞表达了抗体特异性伴侣蛋白质，并且因为介导抗体的细胞表面锚定所要求的辅助分 子(像Iga和IgP)表达于这些细胞中。更优选地，这些B细胞是前体B淋巴细胞，因为 可以发现不表达任何内源性抗体链的前B细胞。实际上，如在本发明中所使用的这些优选 的淋巴细胞不能表达内源性抗体多肽，这些多肽包括所谓的替代轻链(surrogate light chain)成分，该替代轻链是由基因X-5、VpreBl以及VpreB2编码的。因此，这些优选的淋 巴细胞表达了促进抗体分子的膜沉积的辅助膜蛋白，例如B细胞特异性Iga和Igi3分子， 但是它们缺少任何内源性抗体多肽或替代轻链成分的表达。然而应当注意，有可能的是通 过本领域中已知的方法(例如，使用针对这些蛋白的表达载体进行稳定地转染)异位地表 达Iga和Igi3分子。在本发明的一个优选实施方案中，抗体分子是经由内源性地表达的 Iga和Igi3蛋白而被锚定到淋巴细胞的细胞膜上的，这些Iga和Igi3蛋白是自然地表达 于鼠前B淋巴细胞中的。在此披露的这些方法包括以下操作，这些操作允许分离出展示针对感兴趣的一种 配体或抗原的所希望的结合特征的细胞、以及分离对感兴趣的一种所希望的结合蛋白进行 编码的基因。与本领域内已知的可替代的、基于质粒的或基于非整合性病毒的脊椎动物表 达系统相比较，在此披露的在脊椎动物细胞中逆转录病毒表达一种抗体的优选方法允许对 抗体进行稳定地并且优选地克隆表达，这些抗体显著地促进了编码抗体的基因的扩增、分 离、以及克隆。所披露的方法允许通过以下两者之一在体外有效地产生多样的结合蛋白集合(i)将对一种多聚体结合蛋白的至少一种多肽链(像例如，一个抗体的重链)进 行编码的至少一种表达构建体与对至少一种匹配的多肽链(像例如，一个抗体的轻链)进 行编码的至少一种表达构建体进行改组，产生一种功能性多聚体结合蛋白(像例如一种抗 体)；(ii)当原位转移到脊椎动物细胞中时将对至少一种结合蛋白进行编码的至少一 种表达载体进行体细胞突变；(iii)当通过被称为V(D) J重组的操作原位转移到脊椎动物细胞中时将编码了包 含在至少一种表达载体中的免疫球蛋白以及免疫球蛋白样分子的可变区结合域的V(可变 区)、可任选地D (多变区)，以及J (连接区)的基因片段进行体细胞重组；或(iv)通过操作(i)、(ii)、以及(iii)的任何组合。根据一种优选的实施方案，该至少一种核苷酸序列是多种核苷酸序列，这些核苷 酸序列包括一种抗体重链序列以及多种抗体轻链序列，或在替代方案中包括一种抗体轻链 序列以及多种抗体重链序列。
根据另一种优选的实施方案，该抗体或其片段包括由能够进行V(D)J重组 的至少一种逆转录病毒表达构建体编码的一种可变结合域，以便当逆转录病毒转导时产生 针对一种可变结合域的编码序列，或者在另一个优选的实施方案中，在诱变处理的条件下进行以上方法中的步骤(b)，优 选地经由活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的表达，这种酶是内源性表达的或异位地表达的， 其中AID的异位表达是在可诱导的条件下进行的。在以上方法的一个方面，对所述抗体或其片段进行编码的至少一种逆转录病毒表 达构建体包含了顺式调控启动子与多个增强子元件的组合，该组合允许将AID介导的体细 胞突变靶向到由该表达构建体编码的一种可变结合域上，其中该启动子以及多个增强子元 件是选自下组，其构成为(a)免疫球蛋白重链启动子、内含子增强子(ΕμΗ)以及3’ α增强子元件，(b)免疫球蛋白κ轻链启动子、κ内含子增强子(κ iE)以及3’ κ增强子(3’ κ Ε) 元件，(c)免疫球蛋白λ轻链启动子、λ 2-4以及λ 3-1增强子元件，以及(d)它们的任何功能性组合。附图描述图1 该图展示了“逆转录细胞展示”的原理，允许鉴定并且分离对于一种令人希 望的抗原或配体特异的结合蛋白，例如抗体。第一步，将可以产生多样的结合蛋白集合的 表达的至少一种逆转录病毒表达构建体稳定地转导到适合的脊椎动物宿主细胞(“选择细 胞”("selector cells”))中。这是通过将编码了至少一种结合蛋白的至少一种逆转录病 毒载体转染到逆转录病毒包装细胞中来实现的(步骤1)，该逆转录病毒包装细胞可以组成 型地或瞬时地表达逆转录病毒蛋白Gag、Pol以及Env。然后，转染了该至少一种逆转录病 毒结合蛋白构建体的包装细胞将会在转染后24-72小时内产生重组逆转录病毒颗粒，这些 颗粒含有该至少一种逆转录病毒表达构建体。所得到的逆转录病毒颗粒累积在这些逆转录 病毒包装细胞的细胞培养上清液中，并且可以用于转导适合的脊椎动物宿主细胞(“选择细胞”)(表2)，这些选择细胞接着表达这种结合蛋白。在这种优选的方法中，这些结合蛋白 (例如，抗体或其片段)表达于这些“选择细胞”的细胞表面上，并接着将这些细胞用一种令 人希望的抗原或配体进行标记(步骤3)。然后，优选地通过荧光激活细胞分选(FACS)来分 析结合抗原的细胞或结合配体的细胞，并且优选地通过制备型、高速FACS将展示特异性抗 原结合的细胞从未结合的细胞群中分离出来(步骤4)。可以任选地通过组织培养再次将抗 原反应性或配体反应性细胞进行扩展，并且由于逆转录病毒转导的细胞的稳定表达表型， 可以重复抗原定向的细胞分选以及组织培养扩展的循环，直到获得一种可检出的抗原反应 性或配体反应性细胞群时。这个抗原反应性或配体反应性细胞群可以经受一个最终的、优 选的、单细胞分选步骤，或可以在群落的基础上直接用于对编码结合蛋白的基因进行克隆。 在下一个步骤中(步骤5)，从这些抗原选择的或配体选择的细胞库或细胞克隆中对相关结 合区域的编码区进行克隆，这是通过RT-PCR或基因组PCR、使用与一些序列相结合的引物 对(这些序列是对于这个结合蛋白文库特异的和/或对于其他载体序列特异的)、通过本领 域内已知的标准方法来进行的。然后，可以将针对结合蛋白的经克隆并且测序的编码区任 选地作为重组蛋白表达于被选为进行进一步功能性表征的任何表达系统中、并且从而证实 抗原结合或配体结合的特异性(步骤6)。图2 :(a)该图展示了抗体或免疫球蛋白、以及它们的片段的示意性结构，根据所 披露的发明这些抗体或免疫球蛋白、以及它们的片段是优选的结合蛋白。图2a)显示了一 种IgG抗体的示意性结构(左侧)，它的特征为一个特征性Y型结构、并且是由两个完全相 同的免疫球蛋白(Ig)重链和轻链组成的，这些免疫球蛋白重链和轻链对应地包括4个免疫 球蛋白结构域(Vh-Ch1-Ch2-Ch3)以及2个免疫球蛋白结构域(八-Q)。V结构域是IgH和IgL 链的高度可变的抗原结合区域，其中Ch和Q结构域代表恒定区结构域。IgH链的可变区结 构域是由V、D以及J基因片段编码的，而IgL链的可变区结构域仅仅是由V和J基因片段 编码的，这些结构需要通过被称为V (D) J重组的过程、在早期B淋巴组织产生过程中从胚系 免疫球蛋白基因座(图.2b和2c)进行装配。.抗体IgH和IgL链是由二硫桥(disulphide bridge)共价结合在一起的，这些二 硫桥在靠近柔性铰链区的一个位置上(例如，在CH1*CH2结构域之间)将这些完全相同的 IgH链连接在一起，然而在(^1和Q结构域之间额外的二硫桥(如所描绘)与IgH和IgL链 进行共价连接(图.2a左侧)。Fab片段是仅含有由一个天然二硫桥连接的Vh-CH1/\-Q结构域的全长抗体的单 价片段，它可以是通过酶促木瓜蛋白酶酶切从全长抗体得到的、或者它可以通过将CH2-CH3 缺失的IgH链与IgL链一起表达而被表达为重组蛋白。额外的完全人类抗体片段是单链可 变结构域片段(scFv片段)，这些片段仅包括IgH和IgL链的可变区结构域，这些可变区结 构域是通过一种合成接头或一种人工二硫桥连接的。全长抗体或抗体片段的表达(如所描 述的Fab和scFv片段)还可以被表达为结合蛋白以便实现本发明。图2b)示意性地描述了在一种胚系IgH链等位基因上发生的V(D) J重组过程，这 导致了抗体Vh结构域的编码区的装配。在脊椎动物物种中IgH链的可变结构域是由多个 V、D和J基因片段进行编码的，这些基因片段以胚系构型而被分开。在早期B淋巴组织产 生期间发生的V(D) J重组过程中，将V、D和J基因片段选出的一个进行位点特异性地重排 以产生针对一个抗体Vh结构域的独特的编码区。IgH链基因座中的V(D) J重组是一个有序
9过程、并且起始是将一种所选的D重排到一种所选的J基因片段上，通常在这两个IgH链等 位基因上。只有在D至J的基因重排之后，将一个所选的V区位点特异性地连接到这个已 经装配好的DJ区上，从而产生编码该Vh结构域的一个V-D-J 0RF。V (D) J重组过程是依赖 于前体淋巴细胞特异性的重组活化基因(RAG) 1和2的表达的。图2c)示意性地描述了在一种胚系IgL链等位基因上发生的V(D) J重组过程，这 导致了抗体\结构域的编码区的装配。脊椎动物物种中的IgL链的可变域仅仅是由V和 J基因片段进行编码的，这些基因片段以胚系构型而分开，这与在IgH链基因座中的基因片 段相类似。一种抗体\结构域的产生仅要求一个位点特异性V(D) J重排事件，如所描绘。图3 该图示意性地展示了对靶细胞进行稳定的基因修饰、用于通过逆转录病毒 转导来表达一种感兴趣的结合蛋白(BPOI)(例如，一种抗体)(可替代地标记为“X”)的原 理。图3a)描绘了一种野生型逆转录病毒基因组的示意性组织结构(上左)，其中对于 结构性和功能性蛋白Gag、Pol和Env的基因位于在该逆转录病毒基因组侧翼的、在所谓的 5’和3’长末端重复(LTR)序列之间。5’ LTR对于这些逆转录病毒基因的表达是重要的，并 且对于在所感染的宿主细胞中复制该逆转录病毒基因组也是重要的。在该逆转录病毒基因 组中另一个重要的区域是V(Psi)包装信号，该包装信号是在复制和/或生产逆转录病毒 颗粒的过程中对该逆转录病毒RNA进行包装所要求的。为了产生重组逆转录病毒颗粒，可以将gag、pol和env基因从一个野生型逆转录 病毒基因组中去除，这样仅留下5’和3’LTR、以及V(Psi)包装信号。为了构建重组逆转录 病毒载体，接着方便的是引入一个多克隆位点(MCS)，该位点含有几种独特的并且方便的限 制性酶切位点。这种设计(如以上/右侧所描绘)代表了最简单的逆转录病毒转移载体。为了表达重组逆转录病毒(这些重组逆转录病毒允许表达一种重组蛋白(例如， 感兴趣的一种结合蛋白(BPOI) “X”)，例如一种抗体)，最低程度是需要将一种BPOI的一个 开放阅读框(ORF)插入到一种“空”逆转录病毒转移载体中，因为该5’ LTR区具有能够驱动 定位于下游的任何基因的表达的一种启动子活性。然而，为了改进表达水平，一种感兴趣的 基因(例如，一种ΒΡ0Ι-“Χ”)的表达可以是任选地由一种额外的异源启动子(Prom.)驱动 的，并且任选地加入一种标记基因(例如，5’LTR启动子以及Ψ包装信号的下游)(如在此 所描绘)可以允许对逆转录病毒转导的构建体进行选择和/或跟踪。图3b)示意性地展示了对靶细胞进行逆转录病毒转导的操作，导致了 ΒΡ0Ι-“Χ”的 稳定表达，例如抗体。为此，首先将含有针对一种BPOI- “X”的表达盒的重组逆转录病毒构 建体瞬时地转染到一种逆转录病毒包装细胞系(PCL)中，该细胞系表达了一种野生型逆转 录病毒的结构性和功能性逆转录病毒蛋白Gag、Pol和Env (左侧)。可以通过将针对Gag、 Pol和Env蛋白的表达构建体稳定地或瞬时地转染到一种适当的并且易于转染的细胞系中 (例如，标准的人类293HEK细胞、或小鼠NIH 3T3成纤维细胞)来产生逆转录病毒PCL。转 染后2至3天，将含有BPOI- “X”基因的重组逆转录病毒基因组包装到无复制能力的逆转 录病毒颗粒中，它们在PCL的细胞培养上清液中累积。这些逆转录病毒颗粒是无能力复制 的，因为它们缺少针对功能性逆转录病毒Gag、Pol和Env蛋白的基因，并且因此它们仅能将 它们的遗传有效载荷递送到一种靶细胞中一次，一个被称作逆转录病毒转导或单轮感染的 过程。在逆转录病毒转导过程中，将一种重组逆转录病毒的包装RNA引入到这些靶细胞中，其中它被反转录成cDNA，该cDNA然后被稳定地整合到靶细胞基因组中。在逆转录病毒转导 之后2至3天，接着由这些靶细胞永久地表达一种感兴趣的基因(例如，BPOI- “X”)，这是 由于将cDNA逆转录病毒构建体整合到该宿主细胞基因组中的缘故。图4 该图显示了可以用于实现本发明的优选类型的逆转录病毒表达构建体的示 意性设计。该图描述了逆转录病毒载体的示意性设计，这些逆转录病毒载体包含在一个标 准的DNA克隆质粒的主链中(封闭的黑线)；突出显示了针对该逆转录病毒基因组的相关 基因和区域。在图片(panel) (a)中所描绘的一种优选的载体生成(其详细克隆描述于图 5和6中，并且在实例1中提供)包含了针对人类Ig Y iH链和Ig κ L链的cDNA编码区，这 些区域是由强组成型CMV启动子(Prom)驱动的、并且上游和下游的侧翼为Ig κ内含子增 强子(KiE)以及3’ κ增强子(3’ κΕ)元件，促进了对于IgH和IgL链的V编码区的体细 胞超突变。这些逆转录病毒IgH和IgL链表达构建体额外地含有对应地针对抗生素抗性标 志物潮霉素B(hygr0K)和嘌呤霉素(pure/)的开放阅读框，允许对IgH和IgL链构建体的稳 定整合进行选择(这些IgH和IgL链构建体将对应的抗生素药物选择施用至逆转录病毒转 导的脊椎动物细胞培养物中。)此外，突出显示了方便的、独特的限制性内切酶位点，允许 用HindIII和Eco47III直接替换V编码区、或通过使用限制性内切酶HindIII和NotI来 替换整个IgH和IgL链编码区。这样，从一个现有的IgH或IgL链表达构建体中可以容易 地将不同的V区和甚至全部的V区集合克隆到所披露的表达载体中。(b)在该图片中，描述了另一类优选的载体，它们带有由一个DNA片段进行的可变 编码区的替换，其中该可变编码区仍然被分成处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段(对 于IgH构建体)以及V禾Π J基因片段(对于IgL链构建体)。尽管与在(a)中所提供的逆 转录病毒表达载体在其他方面是相同的，这些能够进行V (D) J重组的逆转录病毒载体首先 需要经历V、可任选地D以及J基因片段的位点特异性重排，从而产生针对一条IgH或IgL 链的可变结合域的一个编码区。这种在V(D) J重组之后允许表达IgH链的详细克隆描述于 图11中。这些构建体的一个独特的特征是它们在原位在V(D) J重组活性细胞中(例如，在 表达内源性RAGl和RAG2蛋白的前体淋巴细胞中)产生多样的V结构域编码区的能力。因 为V(D) J重组的过程并不精确，一个多样的可变编码区序列集合可以在一组给定的V、D和 J基因片段之内(对于IgH)或在一组给定的V、D和J基因片段之内(对于IgL)由一个单 独的逆转录病毒载体产生。接合V、可任选地D以及J基因片段的多样性是由于外切核酸酶 的活性、TdT介导的N-区加成、以及P核苷酸产生相组合的缘故，这些都可以逐个地或共同 地贡献编码连接的多样性。因为这些V、D和J基因片段已经按照一种方式得到克隆(这种 方式是不同的V、D和J基因片段家族成员可以容易地被独特的限制性内切酶位点替换)， 所产生的并且引入到能够进行V(D) J重组的宿主细胞中的有限数目的构建体可能导致巨 大多样的原位产生的结合蛋白多样性。因为这些载体含有额外的KiE和3’ κΕ元件，将体 细胞超突变赋予一个V(D) J重排的V域编码区，一种主要的原位产生的多样结合蛋白集合 可以任选地进一步通过一种AID依赖的体细胞超突变方法进行诱变。这样，在体内产生抗 体多样性的整个过程可以被概括为原位地并且在体外使用所披露的逆转录病毒构建体、以 及展示出V(D) J重组活性的宿主细胞(例如，前体淋巴细胞)，并且其中AID介导的体细胞 超突变是活性的、或可以被活化的。
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(c)然而，该图片示意性地描绘了可以用于实现本发明的逆转录病毒构建体的另 一种设计。在此，这些IgH和IgL编码区的表达是由该逆转录病毒主链的5’ LTR启动子所 驱动的，并且IgH和IgL的表达对应地与GFP和YFP自身荧光标志物的表达相偶联，允许仅 通过对所转导的细胞分析绿色和黄色荧光来对表达IgH和IgL的细胞进行示踪和分离。这 些构建体对于无需另外标记操作来控制“选择细胞”的多重感染是非常有用的。在此提供了在图4a)至c)中使用的、针对包含在该构建体中的重要DNA序列的符 号图例。为了更好地理解这些图，在此提供了将IgH和IgL编码区再分成多个可变结构域 (Vh和Vl)，它们都含有内源性引导序列(L)、铰链区(H)、恒定区(CHU CH2、CH3、Cl)，以及跨 膜编码区(M1/2，因为该区是由两个外显子编码的)。图5a_e展示了用于构建一种逆转录病毒IgH(人类Ig Y i同种型)表达载体的克 隆策略，这是在实例1中详细披露的，并且在图4(a)中以基础性设计来提供。在此描绘了 针对膜结合型IgG以及分泌型IgG的表达构建体的克隆，正如在实例1中所详述_出于通 常参比目的，在此提供了在这些质粒图谱中独特的限制性内切酶位点。基于这种最终的逆 转录病毒Ig Y1H链表达构建体，如在此在图5e中所披露的，可以将任何其他的乂11结构域编 码区、或一个多样Vh结构域编码区的集合(文库)引入到使用独特的HindIII和EC047III 限制性内切酶位点的这些载体中，这是通过将现有的Vh区替换为所述任何其他的Vh结构域 编码区来进行的。图5a描述了第一个制备型克隆步骤，其中通过定点突变将一个EC047III 限制性内切酶位点(画圈)从可商购的PLHCX载体主链上去除，如在实例1中所说明。这 就产生了逆转录病毒载体主链pLHCXml，其中可以随后将EC047III限制性内切酶位点再次 引入用于克隆、以及Vh结构域编码区的替换。出于这一目的使用EC047III的优点是基于 以下事实EC047III是可以直接引入到人类Vh与C γ工编码区之间的边缘上、而不改变所表 达的人类IgY1H链的氨基酸组成的仅有的限制性内切酶位点。图5a基因进一步展示了使 用存在于pLHCXml的MCS中的独特的HindIII和ClaI限制性内切酶位点、怎样将人类Y工 恒定区基因的片段(具有或没有跨膜外显子M1/M2)克隆到pLHCXml主链中。出于以后克 隆的目的，将这些片段设计为含有额外的位于侧翼的EC047III和NotI限制性内切酶位点， 如在实例1中所详述。图5b)显示了无Vh结构域编码区的克隆中间体的质粒图谱，并且显 示的是侧翼为HindIII和EC047III位点的一种特定的Vh编码区是如何被克隆到这些构建 体中的。由此所产生的这些构建体描绘于图5c中，并且在原则上足以在任何受体细胞系中 提供提供人类Ig Y 链的表达。然而，以一种AID依赖的方式对Vh编码区进行额外地突 变的概率是本发明的一个方面，并且在此披露了额外的两个克隆步骤，其中将带有额外的 侧翼序列的核心κ iE元件克隆到一个独特的BglII位点内、这种表达盒的CMV启动子的上 游(图5c底部和图5d)，并且其中将带有一些侧翼DNA序列的3’ κ E元件克隆到针对人类 Ig Y1H链的表达盒下游的独特的ClaI位点中。这就产生了最终的、用于膜结合型或分泌型 人类Ig Y ^链的表达载体，为此在图5e中提供了这些质粒图谱。这些构建体对应于已经 在图4a中披露的示意性质粒图谱，但是在此采用了精确的限制性内切酶图谱、并且按比例 作图。图6a_d展示了在实例1中提供的详细的克隆策略，用于构建逆转录病毒IgL(人 类IgK L同种型)表达构建体，它的基本设计已经提供于图4(b)中。如在此在图6d中所披 露的，基于最终的逆转录病毒Ig κ L链表达构建体，可以将任何其他\结构域编码区、或多样八结构域编码区的集合(文库)引入到使用独特的HindIII和EC047III限制性内切酶 位点的载体中，这是通过将用现有的\区替换为所述的任何一个或多个其他的\结构域编 码区来进行的。用于这些逆转录病毒IgL链表达载体的克隆策略要求制备型克隆步骤，从 而产生一种经修饰的逆转录病毒载体主链，可以如所描绘的使用便利的限制性内切酶位点 将这些所希望的元件克隆到其中。第一步，如在实例2中所说明的，从可商购的质粒pLPCX 中通过定点突变将一个不希望的EC047III位点从Ψ (Psi)包装信号中去除，产生了经修饰 的质粒pLPCXml (图6a)。第二步，通过将来自可商购的质粒pLHCX的一个大的AscI-BlpI 酶解的片段与来自pLPCXml的一个Ascl-Ncol片段相连接，产生了一种新颖的pLPCXm2主 链(图6b)。对于这两个片段，不相容的BlpI和NcoI DNA末端需要使用Klenow片段用核 苷酸填满，如实例1中所说明。向所得的pLPCXm2主链、经由HindIII和ClaI插入一个人 类κ L链(Ck)的恒定区，如所示(图6b)。与针对人类IgH链的克隆策略相类似，这些人 类Ck片段进一步位于EC047III和NotI位点的侧翼以促进额外的克隆操作。在插入人类 Ck片段之后，经由独特的HindIII和EC047III位点将一种所选的人类V κ元件克隆到该 构建体中(图6c)。该构建体原则上在任何受体细胞系中可以足以提供人类IgK L链的表 达。然而，与对于IgH链表达构建体的情况(图5a_e) —样，将额外的KiE和3’ κ E元件 克隆到该构建体中、进入该IgK L链表达盒的上游和下游的独特的BglII和ClaI位点中， 这与这些IgH链构建体的克隆策略相同(图6c和6d)。在最终的构建体中，该Vk结构域 编码区接着还能成为用于AID介导的体细胞超突变的靶标。最终的构建体对应于示意性质 粒图谱(该图谱在图4(b)中详述)，但是在此包括并且按比例绘出精细的限制性内切酶图
■i並 曰O图7 该图展示了针对用于活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的逆转录病毒表达构建 体的克隆策略。如所描绘，使用了可商购的PLPCX逆转录病毒载体主链，并且将来自小鼠脾 cDNA的含有AID编码区的一个特异性RT-PCR片段克隆到pLPCX载体的独特的XhoI限制性 内切酶位点中，这是使用插入到这些PCR扩增引物中的相容的XhoI限制性内切酶位点来进 行的，如在实例2中所说明。图8 该图(8a并且连续至8b)展示了详细的克隆策略(还提供于实例2中)，这 是针对具有和没有IgK L链增强子元件的逆转录病毒报告基因构建体的，允许通过将一种 限定的EGFP终止突变进行回复突变来鉴定并且定量体细胞突变。图9 该图提供了一种实验性的概念性证据(proof-of-conc印t)，即所披露的逆 转录病毒载体允许对序列进行的AID介导的体细胞突变，这些序列像优选的抗体V编码区、 所克隆的这些V启动子元件的下游。图片(a)显示了通过对5种所选的FA-12A-MuLV转化 的细胞克隆进行蛋白印迹来进行的AID表达分析，这些细胞克隆已经稳定地转染了一种逆 转录病毒AID表达构建体，其克隆描绘于图7中。这种蛋白印迹分析显示了在FA-12转染 子克隆1至4中的一种能够区分的AID特异性信号(大约25kD)，但在转染子5中没有，并 且在非转染的阴性对照物(NC)中也没有。转染子3用于对逆转录病毒报告基因载体进一 步测试AID-介导的体细胞超突变(SHM)，这种体细胞超突变描绘于图片(b)中在此，将图 8的逆转录病毒报告基因构建体(一次使用了并且一次未使用IgK增强子元件)逆转录 病毒地、对应地转导到表达AID以及不表达AID的FA-12转染子3和5中。如所预期，只有 当含有这些增强子元件的报告基因构建体转导到表达AID的FA-12转染子克隆3中时，才
13有可能在转导之后10天检测到0. 2%频率的绿色逆转株转导子。在这些0. 2%的绿色细胞 中，通过单细胞分选将100个单独的细胞克隆分离，并且在扩展后之通过FACS对这些克隆 再次分析绿色荧光。这些单细胞分选的克隆中大多数(95%)都展示出均勻的绿色荧光表 达，这种绿色荧光表达具有与最初分选的0.2%绿色细胞的中等绿色荧光信号相同的荧光 强度、并且与在图9b的左下方图片中提供的代表性GFP表达模式相类似，这证实了最初的 绿色细胞群是由于对这种EGFP终止突变进行回复突变的缘故。4个克隆显示了一种双模态 的绿色荧光模式，正如在中间的FACS直方图代表性地描绘，并且在100个分选的、经克隆的 单细胞中只有1个几乎没有展示任何绿色荧光(右手FACS直方图)。图10 该图展示了具有一种工程化处理的终止突变的EGFP编码区序列，该序列用 于克隆一种EGFP报告基因构建体用于对体细胞超突变进行定量。在图片(a)中已知的是， 在EGFP开放阅读框的密码子107和108中这四种核苷酸究竟是哪一种已经发生突变，从而 在密码子107中产生一种终止密码子、并且在密码子108中产生赖氨酸到苏氨酸氨基酸的 改变。这四种核苷酸的改变额外地导致了独特的SpeI限制性内切酶位点的引入，正如所指 示它可以在体细胞超突变时作为一种诊断型标志物用于终止密码子回复突变。将TAG终止 密码子的G核苷酸植入到所谓的RGYW序列基序中，该基序已知是用于体细胞超突变的一个 热点。在24个通过SpeI限制性内切酶酶解所分析的逆转株克隆中，能够证实的是该位点 成为对SpeI酶解具有抗性的(并且因此被突变)。在这些克隆的10个克隆中，序列分析揭 示出在初始TAG终止密码子中的G核苷酸已经被突变为一个C核苷酸，产生了一个TAC密 码子，从而证实了限制性内切酶分析、并且证明AID介导的体细胞突变已经被靶向到RGYW 基序中的G上。(b)这个图片显示了所突变的EGFP的全部ORF (这种EGFP已经被克隆到逆转录病 毒IgYlH链构建体中(已经在图5(e)中披露))，而不是乂11结构域编码区。图11(a)和(b)—种能够进行V(D)J重组的逆转录病毒IgH链表达载体的详细 的克隆策略的展示，如在实例4中详细披露。图12 概念性证据，要求处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段进行V(D)J重组 的逆转录病毒构建体当转导引入RAG1/RAG2阳性前体淋巴细胞时可以产生显著的、重排的 重链表达构建体和Ig+细胞。图片(a)包含以下数据，这些数据显示了表面免疫球蛋白阳 性细胞的产生(0. 04%，左FACS图的上右四分之一图)，这是在将一种能够进行V(D)J重 组的逆转录病毒表达载体(克隆的详细说明，参见图11)转导进入A-MuLV转化的前B细 胞系230-238之后进行的。使用如在图4c中示意性展示的构建体将该免疫球蛋白的表达 是与EGFP表达相偶联。因此，可以仅在这群绿色(即稳定转导的)细胞中产生表达免疫 球蛋白的细胞。右侧染色图片显示了对表面免疫球蛋白表达的再次分析，这是在一次单轮 FACS富集以及稀少(0.04%)的表面免疫球蛋白通过组织培养扩展8天之后进行的。在这 轮富集之后，免疫球蛋白阳性细胞的结合频率已经增加到17.8% (正如在这些绿色细胞群 (即稳定转导的细胞群)中预期可检测到的)，已经从中获得了 PCR扩增子并且进行测序。 (b)作为一个代表性的实例，该图片显示了在一轮富集(该富集已经转导了能够进行“准胚 系” V(D) J重组的逆转录病毒载体)之后从衍生自表面免疫球蛋白细胞的一个PCR扩增子 获得的DNA序列(克隆225，在上方具有氨基酸翻译)。作为一种参比，在(b)中的上方提 供了 V、D和J基因片段的编码区序列，在这些V和J基因片段的上方还具有氨基酸翻译，因为这种D片段序列可以按照三种不同的阅读框进行读取，这取决于V(D) J重组之后连接的 多样性。在处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段之间的插入序列用虚线描绘。所回收 的克隆225的序列清楚地代表了一种真正的V (D) J重排，具有以下典型的特征在所装配的 V、D和J基因片段之间在编码连接处可以清楚地检出的核苷酸缺失和TdT催化的N-序列 加入(所有插入序列已经从克隆225缺失)。克隆225的序列展示出一个开放阅读框，并且 除了在这些编码结点的以上所提及的变化之外，在V、D和J序列中不含有额外的体细胞突 变。图13 显示了对一组不同的A-MuLV转化的鼠前B细胞系测定对于嗜亲性MLV衍 生的载体基因转移的敏感性的数据。以0. 5的Μ0Ι、使用已经包被报告基因EGFP(包含转 移载体LEGFP-N1)的一种载体制备物转导了 IX IO5个细胞。如实例5中所详述进行转导。 转导之后2天，使用FACS、通过表达EGFP来检测基因转移。除了前B细胞系18/81之外，所 有其他所测试的A-MuLV转化的前B细胞系在所采用的条件下、在40%至60%的频率范围 内对转导是敏感的，并且原则上可以用于本发明。未经处理的幼稚靶细胞充当阴性对照物， 并且没有显示出绿色荧光(未显示)。图14 一组鼠前B细胞系的针对内源性IgM重链(cy-μ H)的细胞内表达的特征， 从而鉴定缺乏内源性鼠抗体表达的细胞，这些细胞可作为选择细胞用于逆转录细胞展示。 细胞是可渗透的，并且使用与FITC相偶联的抗鼠IgM重链抗体对其进行染色(FLl)。未经 处理的细胞充当阴性对照物。该实验显示细胞系FA-12、1624-5、1624-6、18/81-C18-11和 40E1实际上具有不能检出的内源性抗体表达，并且因此可以用于本发明的方法中。图15 展示了遵循着在图4(c)中所披露的设计的逆转录病毒表达载体的复杂性、 以及对于产生一种IgH和IgL链改组的抗体文库的实验性原理。(a)逆转录病毒载体文库 IgH(650)-LIB-IRES-GFP和IgL (245)-LIB-IRES-YFP涵盖了所限定的、针对全人类抗体的 重链(HC)和轻链(LC)的编码区集合，这些全人类抗体对应地具有复杂度为650和245的、 不同的全测序的克隆。这两种载体均具有包装序列Psi (Ψ)、位于侧翼的长末端重复(LTR) 以及一种内部核糖体进入序列(IRES)。与由5’ LTR中的病毒启动子所介导的抗体多肽链 的表达相平行，这种IRES能够对应地使得报告基因gfp的yfp的表达相偶联。当病毒基因 转移进入选择细胞中时，这就允许使用FACS方便地检测并且富集了成功转导的、并且表达 免疫球蛋白链的细胞。(b)在转化前B细胞中产生一个全人类抗体集合。为了产生瞬时包装细胞，将对人 类抗体(IgH(650)-LIB-IRES-GFP)的重链进行编码的逆转录病毒转移载体文库的文库使 用与一种包装构建体(pVPack-GP)以及一种包膜构建体(pVPack-Eco)共转染到适当的受 体细胞中。转染之后2天，收集了所产生的已经包装对应的转移载体文库的载体颗粒文库， 并且将其用于转导选择前B细胞。使用FACS将表达这些转移的重链和报告基因gfp的经转 导的细胞进行扩展富集。扩展之后，将细胞经受二次转导。这时，IgL(245)-LIB-IRES-YFP 文库被转移，之后跟随采用FACS对表达YFP以及人类轻链的细胞进行扩展和富集。所得到 的群落由一种全人类抗体组成，该抗体展示出一种所限定的、由1624-5细胞表达的人类抗 体文库，含有最大159’ 250克隆的复杂度。图16 本图显示在确保转导的条件下如何用IgH-IRES-GFP和IgL-IRES-YFP文 库进行一种两步转导，这在大多数经转导的细胞中产生多肽链的克隆表达。将1.5X106个
151624-5鼠A-MulV转化的前B细胞悬浮于Iml的组织培养基中，该培养基添加了不同量的载 体颗粒上清液(以1 1、1 5、1 20,1 50,1 IOOU 200稀释)，这些细胞含有对 应地编码了 IgH和IgL链文库IgH-LIB-IRES-GFP或IgL-LIB-IRES-YFP的重组逆转录病毒 载体，这已经在图15中进行了说明。为了确保这些经转导的细胞中有大多数细胞接受了整 合到该宿主细胞基因组中的单拷贝的转移载体，感染之后4天使用FACS分选将展示出低于 10%的基因转移效率(Μ0Ι <0.1，如通过偶联的GFP或YFP报告基因的表达所检测)的细 胞进行富集。将细胞扩展6天，并且经受第二次转导，这是采用已经包装着抗体的轻链编码 区的载体颗粒、如以上所述以1 5稀释来进行的。在此，使用转导IgL-LIB-IRES-YFP文 库的载体颗粒来感染选择用于重链表达的GFP阳性细胞，并且反之亦然。感染之后4天，使 用FACS将表达GFP和YFP的经转导的细胞进行富集。第二次转导后，大约20%的细胞显 示GFP和YFP表达。为了确保每个细胞仅发生单一载体的整合，富集了大约三分之一的这 些群落，这显示在第二轮中所转导的报道基因的仅仅低的或中等的表达(约8%)。图17 通过FACS、使用表达一种抗-IL-15参比抗体的前B细胞群进行定IL-15染 色滴定，从而限定允许最佳的IL-15抗原染色条件用于逆转录细胞展示实验的最佳条件。 这种染色操作(如在实例7中详细披露)包括如所指示的、以两个不同浓度的多克隆的、生 物素酰化的抗-IL-15 二抗在2. 5 μ g/ml-0. 1 μ g/ml范围内滴定IL-15抗原，这是通过FACS 用抗生蛋白链菌素PE偶联物进行检测的。使用抗-IgK L chain-APC抗体对表面Ig+细胞 进行复染。如所见，以0. 1或0. 5μ g/mlIL-15抗原的浓度、并且使用3 μ g/ml的二抗的多 克隆抗-IL-15抗体实现了最佳的IL-15染色。图18 表达前B细胞系的一种抗IL-15参比抗体(PC =阳性对照)的FACS鉴定 的分析，这种细胞系以不同的稀释被刺入到表达抗体的前B细胞的多样抗体文库中，这是 通过使用在图17中展示并且确定的优化的IL-15染色条件来进行的。左上方图片显示出 用IgH和IgL链文库的组合所转导的对照前B细胞的Ig κ L链-APC/IL-15双重染色，该组 合的产生已经显示在图16中(NC=阴性对照物)。右上方的图片显示了用编码一种参比 IL-15抗体的IgH和IgL链的逆转录病毒表达载体(PC=阳性对照)所转导的前B细胞的 Ig κ L链-APC/1L-15双重染色，如在实例7中详细地披露。这些NC细胞的FACS图显示出 Ab文库转导的细胞中有大约50 %是表面-Ig+的，如通过抗-Ig κ L链-APC染色所检测。然 而，没有表面Ig+的细胞展示出与IL-15相结合。相反，PC细胞(其中超过90%的细胞表 达了表面Ig，一种特异性IL-15抗原结合)通过χ轴上的一种特异性信号是清楚的。如所 预期，PC细胞上表面Ig的表达越高，这种特异性的IL-15信号的偏移就越明显，这就产生 了表面Ig+/IL_15结合细胞的对角线染色模式，该模式通过一种椭圆形的门(gate)得到突 出显示，正如所指示。底部的图片(显示出在五种不同稀释的、被刺入到表达NC随机抗体 文库的细胞群中的PC细胞中对表面-Ig和IL-15-结合的双重FACS染色)，显示了表达一 种特异性抗-IL-15参考抗体的PC细胞可以按照接近刺入该NC细胞库的PC细胞的百分数 的频率检测到。图19 从一个多样抗体文库中通过逆转录细胞展示对IL-15反应性细胞群进行富 集的概念性证据，如在实例7中详细披露。上方的图片显示了对于GFP/YFP表达的FACS染 色(y轴)(指示了 Ig逆转录病毒载体转导的细胞的频率)，以及IL-15/抗-IL-15-bio (χ 轴)(指示了特异性的IL-15染色)。左上方的图片显示了未经转导的对照前B细胞(NC =阴性对照物)的双色FACS分析，中上部的图片显示了使用一种抗-IL-15参比抗体作为阳 性对照物(PC)所转导的前B细胞的双色FACS分析。右上方的图片显示了一群细胞的相同 的双色FACS染色，这些细胞已经用一条IgH单链进行转导，该Ig单链编码了逆转录病毒载 体，该逆转录病毒载体编码了参比抗-IL15抗体的IgH链与一个多样的、大于7X IO4的不同 的IgK L链文库的结合。因此，这种IgL链改组的文库潜在地含有大于7X IO4的不同的抗 体，并且可预期地甚至通过对表达抗体的、以及IL-15反应性的细胞进行非常窄的门控(如 在右上方FACS图中指示)，可以检测到非常少的IL-15反应性细胞(在此为2. 42%，由于 该门控靠近阴性群落，如所指示)。通过组织培养将所富集的群落进行扩增，并且将完全相 同的染色操作和FACS分选重复三次，正如在下方的三个FACS图片中针对在完全相同条件 下的三种FACS染色所显示。如所见，连续地富集/细胞扩增循环产生一群细胞，这些细胞 对于阳性抗体表达几乎是100%的，并且与初始的PC细胞系相比对IL-15反应性甚至具有 更高的阳性。这些数据清楚地显示通过反复进行FACS分选和扩展，使用三轮连续的逆转 录细胞展示可以将一个高抗原反应细胞群从几乎不能检出的抗原反应细胞群中成功地富 集成一个基本上100%抗原反应性的细胞群。图20 该图展示并且证实在从3倍IL-15抗原富集的细胞群中进行单细胞分选 之后所建立的24个单独的细胞克隆中的4个代表性细胞克隆的特异性IL-15抗原反应性， 如图19中所说明。这4个选出的细胞克隆被命名为克隆F、H、V以及W，并且所有克隆在 GFP/YFP阳性细胞上都显示出特异性的IL-15反应性，这指示了经稳定转导的、编码Ig的逆 转录病毒载体。如所预期，较高的GFP/YFP表达细胞(表达较高的抗体水平)显示出较高的 IL-15特异性，这在Ig/IL-15双重染色中产生了特征性的对角线染色信号。所有细胞克隆 都显示出特异性的IL-15反应性，如通过在染色中忽略IL-15抗原所证明的，这导致IL-15 特异性的反应性减少(未示出)。这些数据 提供了以下概念性证据逆转录细胞展示是从 最初显示几乎不能检出的抗原反应性细胞群中以高频率获得抗原反应性细胞克隆的一种 有效方法。图21 该图为对抗原反应性细胞进行的成功的逆转录细胞展示富集提供了第二 个概念性证据，这是通过以在初始细胞群中的一种最低限度的IL-I β反应性细胞群为起 点、使用连续三轮逆转录病毒细胞展示细胞富集/组织培养扩增、展示了将IL-I β抗原 反应性细胞成功地富集成一种基本上40%抗原反应性细胞群来进行的。在此提供了对于 GFP/YFP表达(指示抗体表达)的双重染色以及IL-I β反应性。上方的FACS染色是针对 未经转导的前B选择细胞(作为对照物=NC，左上)、以及使用逆转录病毒载体(编码了一 种抗人类IL-I β特异性参比抗体SK48-E26)共转导的细胞(作为阳性对照物=PC，右上) 来提供的，如所指示。底部的图片显示了对一种抗体文库的抗体表达以及IL-I β反应性进 行的FACS染色，这是在1、2和3轮逆转录细胞展示富集之前(0倍富集)以及之后、通过将 具有超过2X IO5个单独的IgL链克隆的一个多样IgL链文库与SK48-E26参比抗体的IgH 链进行改组来进行的，如所指示并且如在实例8中详细地披露的。这些数据为使用第二种 抗原提供了 一种独立的概念性证据，即逆转录病毒细胞展示表达和富集对于从最初几乎不 能检出的水平来富集一个抗原特异性细胞群是一种有力的手段。图22 该图显示了通过逆转录细胞展示所鉴定的一种新颖抗体的IL-I β抗原反 应性的确认，如在实例8种详细披露的。在这种三倍富集的细胞群(示于图21)，通过单细胞分选已经建立了 24个单独的细胞克隆。在这些24个细胞克隆中，12个克隆具有一条新 颖的IgL链，被称为LCB24，如在实例8中所披露。当所克隆的、并且序列表征IgL和IgH链 的逆转录病毒表达载体被再次转导到初始的选择细胞系中时，通过FACS分析了 IL-I β特 异性参比抗体SK48-E26的共表达的新颖LCB24Ig κ L链IgH链以及IgH链的IL-I β特异 性(参见实例8)。这些FACS染色图显示了通过双色FACS对抗体表达(经由GFP/YFP)以 及IL-I β反应性进行的分析，如所指示。如所预期，在未经转导的选择细胞中没有检测到 IL-I β反应性(NC =阴性对照物，左)，然而在表达参比抗体SK48-E26的IgH和IgL链的阳 性对照细胞中检测到一种清楚的IL-I β特异性染色(中)。一种类似的IL-I β特异性信 号在表达抗体的选择细胞中是可检出的，这些选择细胞转导了 SK48-E26参比抗体IgH链载 体、以及由IL-I β特异性逆转录病毒展示细胞克隆所克隆的新颖的完全人类LCB24Ig κ L 链(右)。图23 与由LCB24IgkL链/SK48-E25IgH链所编码的新颖抗体的IL-15缺乏交叉反 应性的确认。左侧这两个FACS染色图显示了对于IL-15FACS染色测定的阴性对照物和阳 性对照物，如所指示(NC=阴性对照物、未经转导的选择细胞，PC=阳性对照物、使用编码 了一种抗-IL-15参比抗体的IgH和IgL链载体所转导的选择细胞)。右侧这两个FACS染 色图显示在表达抗体的细胞(这些表达抗体的细胞编码了由SK48-E26IgH和LCB24IgL链 组成的新颖抗体)上没有IL-15反应性，或者在表达这种初始的SK48-E26IgH/IgL组合的 细胞上没有IL-15反应性。这证明这种新颖的、由SK48-E26IgH和LCB24IgL链组成的抗 体不仅对IL-I β是特异的，而且它对其他蛋白(像IL-15)大体上没有交叉反应性(或粘 性)。图24 该图展示了通过三轮连续的逆转录细胞展示细胞富集/组织培养扩增、来 自一种抗体文库的抗生蛋白链菌素_APC-Cy7抗原反应性细胞的成功富集，该抗体文库是 如在实例9中所披露通过将一种多样IgH链文库与一种多样的IgL进行改组而产生。抗生 蛋白链菌素_APC-Cy7反应性细胞是通过三轮连续的高速细胞分选、之后跟随细胞培养扩 增进行富集的，如所指示。针对这种抗生蛋白链菌素-APC-Cy7抗原的、表达抗体的细胞的 结合特异性是通过在存在(下方图片)和缺少(上方图片)该抗原时分析这些顺序地富集 的细胞群的FACS图来证明的。这为在缺少任何参比抗体时、通过逆转录细胞展示进行的特 异性抗原的有效富集提供了一种概念性证据，这可以用于链改组方法。图25 对于针对该抗生蛋白链菌素-APC_Cy7串联染料的Cy7荧光染料的特异性 反应性，在该图中所呈现的数据为在图24中所披露的3倍逆转录细胞展示富集的细胞群 的特异性提供了证据。为此，通过FACS对未经转导的选择细胞、表达一种IgH/IgL链文库 组合的未富集的细胞、以及一种三倍抗生蛋白链菌素-APC-Cy7富集的细胞群分析了抗体 表达(由GFP/YFP荧光进行指示)以及对于不同的抗生蛋白链菌素_荧光染料偶联物的 反应性，如所指示。这种三倍抗生蛋白链菌素_APC-Cy7富集的细胞群只与抗生蛋白链菌 素-APC-Cy7相结合，而不结合抗生蛋白链菌素-APC或抗生蛋白链菌素_APC_Cy5. 5，并且 抗生蛋白链菌素-APC-Cy7的非特异性染色对于这些选择细胞、或表达一种多样抗体文库 的选择细胞而言也是不可检出的。这就为从表达一个多样抗体文库的细胞中对特异性抗体 进行有效的并且高度特异的逆转录细胞展示富集、而无需来自抗原特异性参比抗体的抗体 IgH或IgL链提供了的概念性证据。
图26 共享同样IgH链的、通过逆转录细胞展示所鉴定的两种新颖的人类抗体显 示出于抗原抗生蛋白链菌素_APC-Cy7的特异性结合。如在实例9中所披露的，在三轮逆转 录细胞展示富集之后，可以从单一分选的细胞克隆中鉴定出两种不同的IgH链序列(HC49 和HC58)以及两种不同的IgL链序列(LC4和LC10)。在这个图中，对IgL链LC4和LClO 与HC49和HC58的所有可能配对进行检查，测定对于靶抗原抗生蛋白链菌素_APC_Cy7的 反应性。为此，将编码了不同IgH和IgL链的逆转录病毒表达载体的组合转导到选择细胞 中，如在实例9中指出的并且如在实例9中所披露。如所展示，新颖抗体HC58/LC4和HC58/ LClO (这两者共享相同的IgH链)展示了与抗生蛋白链菌素-APC-Cy7抗原的特异性结合， 然而由HC49/LC4和HC49/LC10编码的抗体没有显示出显著的结合活性。这两种新颖的抗 体克隆与抗原抗生蛋白链菌素_APC-Cy7的特异性结合在再次转导进入选择细胞时提供了 结论性的证据可以的是如在此所披露的使用逆转录细胞展示用于在复杂的抗体文库中鉴 定稀少的抗体结合物(antibody binder)。术语在此方便地指出其中在此使用的“和/或”应当被理解为这两种明确的特征或组 分各自(具有或没有另一个)的具体披露。例如，“A和/或B”应当非理解为(i)A，(ii)B 以及(iii)A和B各自的具体披露，就如同各自在此逐个列出一样。亲和力饱和通过抗原刺激的B淋巴细胞所产生的、抗原驱动的改进抗体结合特 异性的高调控的免疫过程，主要发生在生发中心。该过程是由体细胞超突变引起的，这种超 突变主要靶向到一些抗体的可变区的编码区上(这些抗体与这种选择性扩展以及B淋巴细 胞的存活相关联)，产生了更高亲和力的抗体。抗体该术语说明了一种免疫球蛋白，无论是天然的、还是部分或全部合成产生 的。该术语还覆盖了包括一种抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白质，像来自(例如)骆 驼或美洲驼的只有重链的抗体。一种全长抗体包括两个完全相同的重链(H)和两个完全相 同的轻链(L)。在它的单体形式中，两个IgH和两个IgL链装配成一种对称的Y型二硫键连 接的抗体分子，该抗体分子具有通过IgH和IgL链的可变区的组合所形成的两个结合域。抗体可以被分离、或通过从自然来源纯化而获得，或者还通过基因工程、重组表达 或通过化学合成而获得，并且然后它们可以含有并非由胚系免疫球蛋白基因编码的氨基 酸。一种全人类抗体包括人类重链和轻链，例如来自人类物种的可变区和恒定区。一种嵌 合抗体包括来自一种脊椎动物物种的可变区结构域与另一种脊椎动物物种的恒定区结构 域的组合。一种嵌合抗体的恒定结构域通常是衍生自一种或多种人类抗体的。通过将非人 类抗体的CDR移植到人类起源的IgH和IgL可变区的框架区中可以产生人源化的抗体。抗体片段已经显示一种全抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的例 子是(i)由VL、VH、CL以及CHl结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CHl结构域组成的Fd 片段；(iii)由一种单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv) dAb片段，它是由一个 VH或VL结构域组成的；(ν)分离的CDR区；(vi) F (ab' ) 2片段，包括两个连接的Fab片段 的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中一个Vh结构域和一个八结构域是通过一个肽 连接物连接的，该肽连接物允许这两个域相关联以便形成一个抗原结合位点；(viii)双特 异性单链Fv 二体；以及(ix) “双抗体”，通过基因融合所构建的多价或多特异性片段。Fv、 scFv或双抗体分子可以是通过将连接Vh和\结构域的二硫桥进行结合而稳定的。还可以
19制备包括接合到一个CH3结构域上的scFv的最小抗体。结合片段的其他例子是Fab'(通 过在重链CHl结构域的羧基端加入几个残基将其与Fab片段相区别，这些残基包括来自抗 体铰链区的一个或多个半胱氨酸)，以及Fab' -SH(它是一种Fab'片段，其中恒定区的一 个或多个半胱氨酸残基才有一个游离的巯基基团)。在一些情况下，一条重链或轻链也可以 被认为是一种抗体片段。正如普通技术人员应该容易理解的，以上所有的抗体片段都展示 了衍生出所述片段的全天然抗体的至少一种功能，并且因此被称为“功能”片段。抗原可以通过免疫球蛋白(或抗体)的可变结构域进行结合的任何生物分子或 化学实体。结合蛋白该术语定义了彼此相结合的一对分子的一种蛋白。一种结合蛋白的结 合配偶体通常被称为一种配体。一种结合对的蛋白可以是自然衍生的、或全部或部分地合 成产生的。该对分子中的一种蛋白在它的表面具有一个区域、或一个腔，该区域或腔与该对 分子的另一种蛋白的一个特定的空间和极性组织结构相结合、并且因此与其互补。结合对 的类型的例子是抗原_抗体、生物素_抗生物素蛋白、激素_激素受体、受体_配体、酶_底 物。本发明优选地涉及抗原-抗体类型的反应。互补决定区(OTR)该术语是指一种免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。⑶R 是以下区域，这些区域处于与抗体直接建立接触的一种免疫球蛋白的三维结构中。一种抗 体典型地包含3种重链⑶R和3种轻链⑶R。这些⑶R通常是抗原受体的最为多样化的部 分。结构域一种生物分子的一种结构部分，其特征为一种特定的三维结构(例如，结 构相关的免疫球蛋白的可变区或恒定区结构域，例如Ig-样结构域，它们可以在免疫系统 的许多分子中发现，它们属于所谓的Ig-超家族)。生发中心在外周淋巴器官(例如，淋巴结或脾)中的一种能够区分的组织学结 构，其中在抗原呈递细胞之间以及在不同的淋巴细胞群之间发生同源相互作用，导致抗原 反应性淋巴细胞的增殖性扩展、连同由抗原反应性B淋巴细胞产生抗体的亲和力突变以及 类别转变重组。胚系构型基因和基因座的未重排的构型(当它们是从亲本遗传得到时，并且当 它们将通过该胚系传到另一代时)。在体细胞中发生的DNA重组事件(像例如，在淋巴细胞 中的V(D) J重组)导致了重新改组或在某些基因座上遗传信息的缺失、并且因此导致来自 该胚系构型的基因的改变。前B淋巴细胞前B淋巴细胞的特征是表达了特定的前B细胞特异性基因(像例 如，入5和\_和\_2基因)，以及表达了参与V⑶J重组的前淋巴样特异性因子(例如， RAG-URAG-2)。此外，前B淋巴细胞的特征是在这两个重链等位基因上DJh的存在、或在至 少一个免疫球蛋白重链等位基因上至少一AVhDJh重排的存在，尽管这些轻链基因座仍然 处于未重排的胚系构型，这样使得这些前B细胞不能表达完全的抗体。初级淋巴组织在小鼠以及人类的体内造血干细胞发育成淋巴细胞所处的器官， 例如骨髓、胸腺、以及在胚胎期间、肝脏。“准胚系”(“Quasi-germline”)构型V、可任选地D、以及J基因片段的人工安排， 其中位于侧翼的重组信号序列从胚系免疫球蛋白基因座中克隆进入到人工基因构建体中， 这样在此类人工基因构建体中V、可任选地D、以及J基因片段的安排仍允许通过V(D) J重组过程将这些基因片段位点特异性地重组到一个可变编码区中。体细胞突变在体细胞中的一种过程，该过程导致将点突变引入基因组的特异性 区域内。当该过程以高频率(每次细胞分裂每个碱基对大于10_4次突变)发生时，它被称 为体细胞超突变。V(D) J重组这是用于产生抗体以及T细胞受体多样性的方法，并且是产生功能性 抗体基因所采用的方法。它涉及多种基因片段的重新安排(这些片段编码了免疫球蛋白的 重链和轻链蛋白)，并且它仅发生在淋巴细胞中。进行转染/转染在真核细胞的背景中，这是将核酸序列引入真核细胞的过程，通 常是与使用化学和/或物理的方法相关联的。进行转化/转化在真核细胞的背景中，这是使细胞无限增殖化用于建立一种连 续增殖的细胞系的过程。转导经由重组病毒的产生将DNA递送到脊椎动物细胞中的过程。为此，表达针对 病毒颗粒的结构蛋白的一种包装细胞系转染了一种重组的病毒DNA构建体，该病毒DNA构 建体包括用于将这种病毒DNA构建体包装到这些病毒结构蛋白中的调节元件。通过这种方 法，产生了重组病毒，这些重组病毒可用于感染(哺乳动物)靶细胞，这导致将所克隆的遗 传信息引入该重组病毒基因组中。载体/构建体一种人工产生的核酸序列，该核酸序列可以用于在不同的生物体 以及物种之间穿梭多种核酸元件，并且该核酸序列可以进一步用于扩布、扩增并且保持基 因组信息。详细说明<0}抗体、或免疫球蛋白，是最普遍的结合蛋白类型，它们已经被证明对于治疗性和诊 断性应用是特别有用的。治疗性抗体已经发展成为商业上最为成功的一种生物药类别，并 且在开发以抗体为基础进行治疗的新颖并且有效的方法方面存在着持续的兴趣(Baker， 2005)。抗体由两条完全相同的重链(H)和轻链(L)糖蛋白组成，这些糖蛋白是经由二硫 键共价连接的(图2a)。每条免疫球蛋白重链(IgH)和轻链(IgL)多肽包括一个N端可变 域(该可变域在不同的抗体之间是不同的)，以及一个C端的恒定域(该恒定区在属于相同 免疫球蛋白亚型(同种型)的不同抗体之间是完全相同的)(图2a)。IgH和IgL链可变结 构域的组合产生了一种抗体的抗原结合口袋、并且决定了它的特异性，然而这些恒定域确 定了一种抗体的免疫效应子功能。免疫球蛋白在它们的可变结构域中的变异性是源自以下 事实:VH和\结构域是由多个基因片段编码的，这些片段被称为V(可变区)、D(多变区)、 以及J(连接区)基因片段。在B淋巴细胞分化过程中，在每个细胞中随机选出一个V、一 个D (只存在于IgH链基因座上)以及一个J基因片段，并且对其进行位点特异性重排以便 产生针对Vh和\结构域的编码区。这种位点特异性基因重组过程仅发生在前体淋巴细胞 中，并且被称为V (D) J重组(Grawunder et al.，1998)(也参考图2b和2c)。基因片段的重 排是由重组活化基因(RAG)和2的产物所介导的。由于大量的V、D、以及J基因片段，以及 在基因片段连接时的不精确，每天通过由免疫系统产生的数百万的B淋巴细胞可以产生不 同V区特异性的巨大表达谱(Grammder et al.，1998)。因为免疫球蛋白重链基因座含有 V、D和J基因片段，针对一种抗体的Vh结构域的编码区要求两个连续的V (D) J重排，然而这些免疫球蛋白基因座缺乏D基因片段、并且该\编码区是通过V至J的重排而产生的(图 2c)。因此，通过在IgH链的⑶R3区中的V(D) J重组所产生的连接多样性比仅由针对这些 IgL链的重排事件所产生的⑶R3连接多样性更多。此外，在早期B细胞分化阶段(在这一 阶段发生IgH链基因重排)，表达了末端酶脱氧核苷酸转移酶(TdT)，它能够在D至J以及 V至D的连接上(所谓的N-序列多样性)添加非模板的核苷酸，额外地将这种IgH链⑶R3 表达谱多样化。相比之下，这种IgL链的CDR3表达谱(该表达谱是在B细胞分化过程中当 V至J的基因片段随后连接时形成的)在TdT表达主要被向下调节时(Li et al. ,1993)在 某种程度上具有更少的复杂性。除了在Vh和\编码区中产生⑶R3多样性之外，IgH和IgL 这两者的链表达谱可以在一种T细胞依赖性免疫反应的过程中、由在成熟B细胞中触发的 体细胞超突变过程进一步被多样化(Papavasiliou & Schatz，2002)。这些体细胞突变是 特异性地靶向Vh和\编码区的，并且是由B细胞系特异性酶活化诱导的胞嘧啶核苷脱氨酶 (简写为AID，参见Papavasiliou & Schatz，2002)介导的。作为在免疫过程中发生的体细 胞超突变的结果，表达对抗该免疫原的更高亲和力抗体突变体的细胞在通常发生于生发中 心的免疫过程中被阳性选择出，并且引起了产生更高亲和力抗体的细胞的富集。这些抗体 现在还在⑶R 1和2中累积突变，这是被称为该抗体表达谱的亲和力突变的一个过程。通过 顺式调控基因元件或基序的存在，特别是位于邻近所重排的V1^P \编码区中的IgH和IgL 链基因座的增强子元件的存在，这种AID介导的多样性以及特异性靶向到这些V1^nt编码 区得到显著性地增加(Bachl & Olsson, 1999) ο除了经典的全长治疗性抗体之外，额外的结合蛋白形式(包括全人类抗体片段， 例如所谓的Fab片段(图2a)、单链Fv片段(图2a)、纳米抗体，仅由Vh单域组成，等等)也越 来越多地被开发作为治疗性和诊断性试剂。然而，对于本领域普通技术人员应该清楚的是， 此类功能性抗体片段可以通过基于蛋白的标准的生物化学方法、或通过常规的分子生物学 方法容易地由全长抗体衍生，条件是一种令人希望的全长抗体的编码信息是可获得的。传统上，定向对抗感兴趣的一种分子或表位(抗原)的单克隆抗体是通过对应地 免疫小型实验室动物、或家畜(例如，小鼠、大鼠、兔、或山羊和驴)而产生。反复免疫之后， 将这些动物取血用于从它们的血清中分离多克隆抗体、或者为了产生单克隆抗体将这些动 物处死以便从次级淋巴样器官(像，淋巴结或脾)中分离淋巴细胞。将分离的淋巴细胞与 无限增殖的骨髓瘤细胞进行融合用于产生杂交瘤，随后将这些杂交瘤亚克隆并且筛选展示 出所希望的功能特性(像例如，与一种特定的抗原或靶标相结合)的单克隆抗体的分泌。从抗体工程化处理的第一个突破(被称为由K0hler和Milstein进行的用于产生 所谓的单克隆抗体的杂交瘤技术研究(K5hler& Milstein，1975))开始，经历了相当长的 时间单克隆抗体才可以用于治疗人类疾病。抗体进入临床缓慢的主要原因是最初与使用啮齿动物抗体用于治疗人类患者相 关联的挫折。如果将此类抗体输注到患者的免疫系统中，免疫系统将这些啮齿动物的抗 体识别为一种外来的蛋白并且对这些抗体产生一种免疫应答，包括产生中和抗体(被称为 HAMA =人-抗-小鼠抗体应答)。HAMA应答可以导致半衰期的显著性降低、以及由此的所 用抗体疗效的降低，并且若免疫系统对所注射的非人类蛋白反应过度则可能甚至导致严重 的副反应。因此，具有很大的医学和商业兴趣的是开发出与人类抗体更加相似的治疗性抗体。首先，这是借助于对现有的啮齿动物抗体进行基因工程化处理而实现的，引起了嵌合抗 体或人源化抗体的开发(Clark，2000)。嵌合抗体是通过使用标准的基因工程和克隆技术、 将一种啮齿动物抗体的可变结合域与一种人类抗体的恒定区相融合而产生的。相比之下， 人源化抗体是仅通过将来自一种啮齿动物抗体的一个可变结构域的互补决定区(CDRs)转 移到一种人类抗体的可变区框架上而产生的，这也是通过标准的分子生物学技术完成的。 尽管产生嵌合抗体的操作是直接的，这些抗体仍含有33%的异种序列、并且对免疫原性具 有一种显著的潜力(Clark，2000)。实际上，针对一种嵌合抗体的小鼠部分的免疫应答已经 得到良好地记载，并且被称为HACA应答(HACA =人类抗嵌合抗体)。与以上所提及的相比，人源化抗体的免疫原性潜力被进一步降低。然而，基因工程 化处理人源化抗体、并且同时在CDR移植之后维持这些啮齿动物抗体的初始的结合亲和力 和特异性的方法并不是琐碎的，并且通常要求通过反复诱变和筛选循环进行广泛的额外的 优化。由于以上提及的原因，在近年来嵌合方法以及人源化方法逐渐不太被认为是选择用 于开发治疗性抗体的一种方法。远离嵌合抗体和人源化抗体、用于开发治疗性抗体的的开发还受到允许开发“全 人类”抗体(它的氨基酸序列与人类血清抗体相一致)的创新技术平台的开发的驱动。理 论上，全人类抗体被认为在人类患者中引起了最小的免疫原性和副反应。这两种建立最多的“全人类抗体”开发平台是A)人类免疫球蛋白转基因小鼠技术，其中已经将胚系人类免疫球蛋白重链和轻 链基因座的大量转基因引入到小鼠基因组中(Green & Jakobovits, 1998 Jakobovits et al.，W098/24893A2)。为了使用这些转基因小鼠用于人类抗体的开发，已经将这些转基因小 鼠品系与基因敲除小鼠品系进行杂交，这些基因敲除小鼠品系在它们的内源性小鼠免疫球 蛋白重链和κ轻链基因座中具有功能性缺失。因此，这些人类免疫球蛋白的转基因小鼠在 免疫接种时产生了大量的人类体液免疫应答，除了这些产生抗体的细胞中大约半数仍具有 内源性小鼠λ轻链这种例外，所以这些轻链对于进一步的治疗性抗体开发是无用的、并且 需要被去除。B)噬菌体展示技术，它是基于高度多样的抗体片段文库(例如像，单链Fv或Fab片 段)在大肠杆菌的噬菌体表面上的表达(展示)(Clackson et al.，1991 ；McCafferty et al.，WO 92/01047A1)。为了鉴定特异性结合物，将具有适当的复杂性、性质以及起源的噬菌 体文库结合到固定的抗原上(“淘选”)，从而富集与所固定的抗原相结合的噬菌体克隆。几 轮淘选之后，确定出所选择的结合克隆的序列。该方法的一个变体是完全无细胞的核糖体 展示技术，其中抗体片段没有在噬菌体上展示，而是在经翻译的结合物仍然“粘”到核糖体 上所处的条件下、通过体外转录和翻译进行表达的(Hanes & Plilckthun，1997)。对于噬菌 体展示或核糖体展示，一个至关重要的步骤是将结合的片段重新工程化为全长抗体，然后 将该全长抗体在脊椎动物细胞中表达。将噬菌体选择的克隆再次工程化处理成为全长抗体 形式并且脊椎动物细胞表达之后，需要对它进行分析这些抗体是否能够得到充分地表达、 以及这些初始噬菌体结合特征是否仍得到保留(在这种情况下这可能不是必须的)。尽管人类免疫球蛋白转基因小鼠以及噬菌体展示技术已经对治疗性抗体的发展 产生了很大的影响，但是这两种技术平台具有与它们相关联的优点和缺点。转基因小鼠技术的一个优点是它能够递送高亲和力抗体，这是由于在进行免疫时
23在这些小鼠体内所发生的自然亲和力饱和的缘故，并且已经证明人类抗体对来自人类转基 因小鼠的一种给定抗原的亲和力特性是可以与野生型小鼠的情况相比的。然而，与这些人 类免疫球蛋白的转基因动物相关联的几个缺点是1)如果这些转基因动物对该抗原是耐 受的，最通常是由于与内源地表达的宿主蛋白的高结构相似性，对抗此类“保守”抗原的高 亲和力抗体的产生可能变得非常困难或甚至不可能。2)与在正常的野生型动物中一样，来 自人类免疫球蛋白转基因动物的抗体是优选地对抗强抗原表位而产生的，这可以使得开发 一种对抗功能性、但是缺少治疗价值表位的抗体成为一项具有挑战性的任务。3)最后，不能 使用人类免疫球蛋白转基因动物用于现有抗体的亲和力优化。这种现象的原因是转基因动 物的产生所要求的时间期限(仅用于一种给定抗体克隆的优化)是相当长的。这种方法将 涉及产生针对一种特定抗体的两条IgH链和IgL链转基因小鼠品系，并接着会额外地要求 将这两种转基因品系与对于这两个内源性免疫球蛋白重链以及对于κ轻链表达缺陷的至 少两种敲除动物品系进行遗传回交，这是将会要求几个育种世代以及延长的时间期限的一 个过程。如以上所说明的类似限制施用于一个最近说明的基于小鼠开发的技术平台，其中 小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因座的胚系可变的(V)、多样的⑶以及连接(J)的基因片 段已经通过位点特异性基因靶向、由(部分的)人类种系V、D和J基因区替换(Murphy & Yancopoulos, WO 02/066630A1)。在这些“免疫球蛋白基因敲入”小鼠中，鼠V、D以及J基 因片段已经在小鼠胚系中经由同源重组、由人类免疫球蛋白基因重链和轻链基因座的那些 片段进行位点特异性替换。与人类免疫球蛋白转基因小鼠(这些小鼠产生了全长人类抗 体)相比，这种小鼠品系因此产生了 “反嵌合”抗体，在一个小鼠恒定区主链上带有人类抗 原结合区。噬菌体展示和/或核糖体展示方法具有成为非常快速的技术平台的可理解的优 点，因为从粘合蛋白的复杂文库中鉴定第一种结合物可以在几周内实现。然而，噬菌体展示 还与多个显著的缺点相关联。1)由于在该系统中缺少任何亲和力饱和，从一种噬菌体展示 筛选或核糖体展示筛选鉴定高亲和力结合物并不是琐碎的。为了着手解决这个问题，已经 开发了代表着超过IO12个克隆的极为复杂的噬菌体文库。但是即使使用了这些复杂文库， 初始的结合克隆通常与该抗原具有亚优化的亲和力，并且此类结合物通常仍然需要使用额 外冗长的、并且耗时的优化操作进行优化。2)在噬菌体展示中，仅表达了抗体片段(例如，
片段)，因为噬菌体基因组只能容纳相对小尺寸的分子的编码区。3)结合蛋白必 须融合到载体蛋白上(例如，噬菌体gill蛋白)。所产生的融合蛋白与它们的亲代抗体或 结合活化蛋白相比经常显示出更低的抗原反应性(H00genb00m& Chames，2000)。4)噬菌体 展示不能容易地允许对蛋白进行受控装配(这些蛋白通过形成同型多聚体和异型多聚体 形式获得了一种结合表型)，这是由于例如二聚体蛋白是通过共价连接分子被迫装配的。然 而，在工程化处理抗体的情况下，免疫球蛋白重链和轻链的适当调节的装配是必需的，因为 并不是每条抗体重链均能够与任何一条轻链配对的。5)基于细菌或基于细菌噬菌体的系统 不能提供感兴趣的展示蛋白的适当的翻译后修饰(糖基化作用、豆蔻酰化作用、以及类似 作用)，这通常负面地影响了所表达的蛋白的结合特征。6)与脊椎动物细胞相比，原核表达 导致蛋白的不同蛋白折叠，因为这种细胞质环境是与真核或脊椎动物宿主细胞显著地不同 的(例如，在氧化还原电位以及缺少分子伴侣方面)。7)随后将噬菌体展示系统进行抗原CN 101970482 A
作为以上提及的缺点的一种结果，许多噬菌体展示所选的抗体片段具有中等的亲 和力和/或可以带有结构性假象(artefact)。此外，当在脊椎动物细胞中噬菌体展示所选 的结合物被再次工程化并且表达为全长抗体时，可能发生的是噬菌体选择抗体是表达欠佳 的、或根本不能表达、或它们展示出改变的结合特征。为了着手解决人类免疫球蛋白转基因/敲入小鼠技术以及噬菌体展示的限制中 的一些限制，近来已经开发了一种可替代的技术，该技术涉及在体外对原代鼠前B细胞进 行遗传修饰(产生出表达人类抗体的细胞)、之后跟随将它们移植到缺少一种功能化B细胞 区室的免疫缺陷的受体小鼠中(Grawunder & Melchers，W0 03/068819A1)。这就导致在这 些移植小鼠中表达人类抗体的B细胞亚群的部分重建，这些小鼠随后用任何所希望的抗原 或配体进行免疫。该技术可用于开发新颖的抗体或结合蛋白，或者考虑到它们对抗一种限 定靶标的亲和力来优化现有的抗体(Grawunder & Melchers，WO 03/068819A1)。在这种方法中使用逆转录病毒表达系统是优选的，因为可以将单拷贝的表达构建 体的基因转移转移到单独的前B细胞中(Kitamura et al.，1995 ；Stitz J et al. ,2005), 并且还因为对于哪些抗体表达构建体正被用于移植小鼠中存在着彻底的选择自由(例如， 抗原预先选择的抗体文库、来自得病患者的抗体文库、或单独的抗体克隆)。因此，本技术的 一种特别的优点是它的灵活性，即它能够用于抗体的从头开发、连同用于对现有的治疗性 抗体候选者进行优选。已经说明了其他基于啮齿动物的、用于开发全长人类抗体的系统，这些系统涉 及将从人类供体分离的人类造血祖细胞移植入免疫缺陷型小鼠中(Mosier &ffilson, WO 89/12823A1)。在此类人类细胞移植的小鼠中，人类B细胞可以发育到一定程度；然而，尽管 近来改进了这种方法(Traggiai et al.，2004)，涉及人类抗体的亲和力饱和的一种令人满 意的体液免疫应答在此类“人源化小鼠”中并没有实现。此外，与在人类免疫球蛋白转基因 或“敲入”小鼠的情况一样，不能对现有的抗体进行优化。任何种类的、基于小鼠的抗体技术平台通常要求体内免疫，当与体外法比较时体 内免疫仍然是一个耗时的过程。因此，除了以上提及的有关小鼠的方法之外，近来已经开发了多种可替代的体外 技术。然而，仍然需要证明在开发高品质、高亲和力的抗体产品方面这些系统将是如何有 效的。一种体外系统是基于从患有一种特定疾病的人类患者中分离富集抗原的记忆B细 胞，这些记忆B细胞可以被分离出并接着在体外被爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化进行无 限增殖，之后跟随针对抗原反应性EBV细胞系进行筛选(Lanzavecchia，WO 04/76677A2)。 在概念上类似、但在方法学上不同的是以下方法，其中首先从外周血中分离出来自带有一 种急性疾病状态的患者的产生抗体的浆细胞、并接着通过与非生产性杂交瘤相融合进行无 限增殖，之后随后针对所希望的抗体生产者进行筛选(Lang et al,W0 90/13660A2)。可替 代地，已经说明了旨在从接种的或免疫的个体中分离B细胞、之后跟随从细胞群(Lawson & Lightwood, WO 04/106377A1 ；Schrader, WO 92/02551A1)或通过单细胞 PCR (Muraguchi et al. , WO 04/051266A1)分离并且克隆特异性抗体基因的方法。然而，所有这些技术都依赖 于在人类患者中相关B细胞群落的可获得性、并且在它们的通常应用中受到相当地限制，
25并且因此主要用于鉴定抗感染治疗性抗体候选者。此外，使用任何一种基于人类B细胞的 筛选方法，亲和力饱和、或抗体的抗原定向开发、或对现有抗体进行优化都是不可能的。因此，最近已经说明了额外的可替代的体外方法，涉及使用瞬时表达系统在真核 细胞中表达和筛选重组抗体(Zauderer & Smith，WO 02/102855 A2 and Beerliet al, WO 08/055795A1)。尽管这些系统规避了转基因小鼠、噬菌体展示以及人类B细胞衍生的技术 的一些瓶颈，这些系统的特点仍然是许多限制。首先，已知的基于真核细胞的抗体表达/筛 选技术没有赋予针对重组抗体的一种稳定的表达模式，这预先排除了具有所希望的结合特 异性的表达抗体的细胞的反复富集循环。其次，已知涉及基于真核细胞的抗体表达的方法 中没有一种允许对结合物克隆的克隆表达进行控制，在治疗性抗体开发的情况下这使得鉴 定一个匹配的、具有所希望的抗原或配体结合活性的IgH链和IgL链成为一项挑战性的任 务。第三，在Zauderer和Smith (WO 02/102855A2)中所描述的技术不允许任何体外诱变、 或所表达的抗体的基因重组，该方法是一种纯粹的筛选操作。因此，结合蛋白的亲和力成熟 方面不能由该技术解决。最后，这些真核表达/筛选系统中没有一种系统是与多样抗体表 达谱的原位产生相容的，这些抗体表达谱来自采用免疫球蛋白重链和轻链V、D和J片段的 V (D) J重组机制的单独的抗体表达构建体。用于鉴定生物学活性的肽和核酸的一种可替代的方法已经由Jensen et al (EPl 041 143 A)提出。在EP 1 041 143 A中所说明的优选方法包括一个起始的筛选操作，其 中可以将大量的逆转录病毒载体引入细胞中，这样单独的细胞能够表达大量的不同的RNA 或肽。随后将显示一种表型变化的细胞分离，并且可以通过PCR将该克隆中的逆转录病毒 DNA分离。然后可以将这种PCR产物用于再次转染病毒包装细胞以产生其他的逆转录病毒 载体。然后，可以将这些逆转录病毒载体用于转导不同的细胞，并且最终在第二个克隆步骤 之后可以对这种活性物质进行鉴定。通过输入生物学活性的肽或核酸，这种方法实质上导 致细胞表型的非直接变化。这是与本发明的方法相反的，由此这些逆转录病毒转导的构建 体直接编码了该筛选所指向的结合蛋白，优选抗体。还应当注意到，在EP 1 041 143 A中 所说明的肽和核酸在大小方面是与由本发明的方法所鉴定的抗体或抗体片段差异很大的。用于基于逆转录病毒基因组筛选的另外的方法在WO 03/083075A2 (Bremel等人) 中列出。该方法涉及了表达并且筛选对未经表征的基因和蛋白进行编码的基因组DNA序 列。在此说明了 一个过程，其中一个细胞系用一种逆转录病毒表达构建体进行转导，这样一 种基因组DNA病毒被插入到该细胞系的基因组中(作为一种原病毒)，并接着直接分析来自 这种前病毒多肽的表达。这种方法没有提供对于富集该细胞系的机会、也没有对于分离的 机会，并且在分析之前进行了所表达的多肽的鉴定，它将从由Bremel和合作者所开发的高 通量筛选的技术中减去。一个最近公布的来自Beerli和合作者的专利申请(WO 08/055795A1)说明了用于 分离人类抗体的一种筛选平台，它使用了辛德毕斯病毒表达系统。这个平台的一个基本特 征是产生起始文库，其中将对一种感兴趣的抗原特异的B细胞从人类供体的外周血单核细 胞(PBMC)中直接分离出。从这个B细胞库中产生了重组的抗原反应性scFv文库，并且通过 使用辛德比斯病毒表达系统、通过哺乳动物细胞表面展示进行筛选。与噬菌体展示相类似， 这个系统的缺点之一是需要对感兴趣的scFvs重新进行工程化处理，并且在脊椎动物细胞 中表达为全长IgG。这个过程可以是与在转化时感兴趣的抗体的亲和力缺失相关联的，因为这些抗体可能在脊椎动物细胞中没有很好地表达和/或可能展示出改变的结合特征。相比之下，在此披露的本发明包括独特的并且极为有力的多种方法的组合，这些 方法用于结合蛋白(优选抗体或其片段)的开发和优化。与基于小鼠的技术相比，在此披 露的本发明的主要优点是在抗体的优化和从头开发方面的彻底灵活性、以及在短时间内鉴 定特异性结合物的速度。因为本发明的所有方面已经在体外得到实现，对于开发对抗抗原 的抗体不存在限制，这些抗原在不同物种中是高度保守、或在实验动物中可能是有毒的。与基于噬菌体展示技术相比，在此披露的本发明的主要优点是这些结合蛋白(特 别是抗体)能够在脊椎动物细胞中、并且优选在B淋巴细胞环境(即，抗体的天然宿主细 胞)中表达为全长抗体，确保大多数天然的以及适当的蛋白折叠、正确的翻译后修饰、以及 对于重链和轻链配对的质量控制。与人类B细胞方法相比，所披露的发明的关键性优点是考虑到开发对抗任何所希 望的目标的抗体的彻底灵活性、对现有抗体进行亲和力优化的可能性、对于哪种类型的抗 体表达于该系统中进行选择的彻底自由(富集抗原的、人造的、来自患者的、在IgH和IgL 链改组的条件下，等等)。与其它基于真核细胞的、涉及到基于质粒的表达构建体或非整合的病毒载体的表 达系统相比，所披露的“逆转录细胞展示”发明的关键性优点是稳定的、持续的并且克隆的 表达可以通过使用逆转录病毒基因转移技术来实现。在这些靶细胞中稳定的、持续的并且 克隆的表达重组抗体允许抗原特异性或配体特异性细胞的反复富集循环，包括分离并扩展 单克隆细胞用于鉴定这些抗体基因的可能性。然而，在此披露的本发明额外地允许额外产 生遗传多样性，这是当原位逆转录病毒转导进入脊椎动物宿主细胞时、通过采用V(D)J重 组的淋巴细胞特异性机制或采用体细胞超突变的方法用于进一步诱变结合蛋白来进行的。因此，与在本领域内已知的、用于开发治疗性抗体的已知技术相比，在此披露的逆 转录细胞展示的方法提供了独特的新颖的并且有力的、针对以前存在的技术所具有的许多 明显限制的解决方案。在此披露的本发明可以广泛应用于表达、筛选并且鉴定与感兴趣的一种配体或抗 原进行特异性结合的结合蛋白。尽管本发明可以用任何结合蛋白(包括但不限于单体的、 同型多聚体或异型多聚体膜结合型受体(像T细胞受体、细胞因子受体、或趋化因子受体)， 而且用其他支架蛋白进行，根据本发明优选的结合蛋白是全长抗体，其中全人类抗体是特 别优选的。然而，应当理解，一种抗体的任何(功能)片段(包括但不限于单链Fv片段 (SCFV) ,Fab片段、F(ab’)2、VH或\单域、单一的重链或轻链、或它们的任何组合，具有任何 天然发生的或人工工程化处理的修饰)可以用于实现本发明。对于全长抗体，本发明特别 适用于抗体结合区的任何种类的人工工程化处理或设计的修饰，例如通过定位诱变或定区 诱变、来自不同抗体的自然发生的序列的融合、CDR序列的随机化、DNA改组、易错PCR、仅通 过说明提及一些方法。根据本发明用于表达结合蛋白的一种优选的方法是使用逆转录病毒载体介导的 脊椎动物宿主细胞转导。逆转录病毒载体的使用已经在基因治疗领域中研究了许多年。例如，为了工程 化处理可以靶向到特异性细胞类型上的腺病毒伴随病毒(AAV)载体，Perabo等人(W0 03/054197A2)已经在对于与初级细胞受体相结合至关重要的一个位点上将编码靶肽的随机序列插入到病毒衣壳基因中，并且产生AAV文库，这些文库在这种病毒衣壳的背景中展 示了这些肽。由培养环境所提供的选择性压力借助于这些病毒克隆在传染过程中实现每个 步骤的能力(即结合、摄入、脱壳、核转位、复制、以及基因表达)驱动这种选择。通过使用 这种技术，产生了有效地转导白血病细胞的载体。尽管这种技术可以用于产生病毒突变体 (这些病毒突变体感染了之前对抗由野生型AAV进行的感染的靶细胞)时，它没有提供体外 产生的多样的结合蛋白集合。这样，与本领域中已知的、用于在真核和/或脊椎动物宿主细胞中表达重组蛋白 的任何其他方法相比，在本申请中所说明的、用于表达结合蛋白的方法具有几个关键性的 优势。1)重组的逆转录病毒构建体稳定地整合到该宿主细胞基因组中。并且由此提供 了该结合蛋白的一种稳定并且持续的表达表型。2)通过使用适当比例的逆转录病毒颗粒 与靶细胞(被称为“感染复数”(MOI))，优选地以等于或小于0. 1的MOI进行，可以控制这 种逆转录病毒的转导，这样逆转录病毒转导的细胞中大多数细胞得到了遗传修饰，这是仅 通过一种重组逆转录病毒构建体整合到该宿主细胞基因组中导致至少一种希望的结合蛋 白的克隆表达来进行的。因为结合蛋白的克隆表达显著地促进了单独的结合蛋白的鉴定和 克隆，所以这个方面代表了本发明的一种优选的实施方案。然而，在一个可替代的实施方案 中，还可以使用逆转录病毒、以大于0. 1的MOI来实现本发明。尽管以上提及的逆转录病毒转导的优点是逆转录细胞展示的基础，在脊椎动物宿 主细胞中重组结合蛋白的表达还可以通过替代性方法来实现，这些方法像例如但不限于 瞬时或稳定的DNA转染、RNA转染、或通过转移基于DNA的病毒载体(像基于腺病毒或基于 痘病毒的载体)_尽管以上提及的替代性方法中没有一种允许在脊椎动物宿主细胞中的一 种可以容易控制地、稳定地并且克隆地表达的结合蛋白。用于实现本发明的优选的脊椎动物宿主细胞是B淋巴细胞系的细胞，特别是前体 B淋巴细胞，这些前体B淋巴细胞通常缺少内源性抗体表达，但它表达了有利的辅助蛋白 (像例如用于适当的蛋白折叠以及抗体装配的分子伴侣)，或有助于抗体分子(像例如B细 胞特异性Iga或Igi3蛋白)膜沉积的辅助膜蛋白。在脊椎动物宿主细胞中通过逆转录病毒转导来表达重组蛋白的原则是一种已建 立的方法，并且涉及重组逆转录病毒载体的构建，这些重组逆转录病毒载体相对较小(有 待加入的重组DNA的最大尺寸8-10kB)，并且它们可以通过标准的细胞生物学方法作为质 粒载体进行克隆和操作，逆转录病毒RNA基因组可以从这些质粒载体中进行转录。野生型 逆转录病毒基因组仅含有三个基因，gag、pol和erw，它们对应地编码了这些核心蛋白(一 种逆转录病毒整合酶、蛋白酶、RNA酶)、以及一种逆转录酶，以及多种包膜蛋白(图3a)。此 外，这个逆转录病毒基因组含有顺式调控序列，像用于将该逆转录病毒RNA基因组包装到 病毒颗粒中所要求的Psi ( Ψ)序列、用于逆转录病毒转录终止的一种polyA信号、以及最后 的含有所谓的5’ -和3’ -长末端重复(LTR)启动子元件以及用于逆转录病毒整合到该宿 主细胞基因组中的信号(图3a)。为了构建重组逆转录病毒，将一种野生型逆转录病毒的 gag、p0l和env编码区替换为用于感兴趣基因的任何表达盒，包括相关的顺式调控元件(像 启动子或增强子)(图3a)。为了将此类重组逆转录病毒基因组稳定地整合到一个宿主基 因组中，需要将含有一个逆转录病毒基因组的质粒载体瞬时或稳定地转染到一种所谓的逆
28转录病毒包装细胞系(PCL)中，该细胞系以瞬时或稳定的方式表达由gag、pol和env反式 编码的病毒结构蛋白，并且因此允许将这种重组病毒基因组(转移载体)包装到没有复制 能力的逆转录病毒颗粒中(图3b)。这些逆转录病毒颗粒允许对靶细胞进行单独一轮感染 (转导)(图3b)。使逆转录病毒颗粒进入靶细胞是由Env蛋白与该靶细胞上的一种特异性 受体的特异性相互作用介导的。因此，Env蛋白的本质决定了这些逆转录病毒颗粒到表达 该同源受体的特异性宿主细胞的趋向性。亲嗜性逆转录病毒局限于啮齿动物细胞，兼嗜性 逆转录病毒可以感染不同的物种(包括啮齿动物和人类细胞)，并且泛嗜性逆转录病毒可 以感染具有细胞膜的任何复制性细胞，因为细胞进入是经由存在于所有真核细胞膜上的结 构而发生的。具有多种不同趋向性的逆转录病毒载体颗粒还可以使用其他病毒的(例如， 长臂猿白血病病毒(GaLV)、囊泡性口炎病毒(VSV)或HIV和SIV)的异源包膜蛋白、或甚至 细胞膜蛋白来产生，仅通过说明一种被称为“假型化”技术来提及一些。进入细胞后，一种 逆转录病毒可以将病毒基因组递送到宿主细胞中，其中这些病毒蛋白介导了将该基因组逆 转录到cDNA中并且最终将它稳定地整合到宿主细胞基因组中，允许将递送的基因进行稳 定表达(图3b)。在本发明的一个优选的实施方案中，亲嗜性MLV颗粒用于介导基因转移到 鼠B细胞中。然而，本领域的任何普通技术人员应当理解用任何其他包膜蛋白或跨膜蛋白 假型化的任何感染性逆转录病毒载体可以用于实现本发明，条件是它在任何适当的靶选择 细胞中介导了转导(这种细胞独立于它们亲代供体物种、细胞类型)或它们对介导载体细 胞进入的一种同源受体的表达。为了实现逆转录病毒载体介导的基因转移，可以从稳定表达或瞬时表达的转移载 体的包装细胞的细胞培养上清液中收集含有载体的逆转录病毒颗粒(含有重组逆转录病 毒基因组的转录本、或转移载体)(图3b)。这可以在本领域中的普通技术人员已知的广阔 的科学试验方案范围内以及它们的变体中实现。本发明优选的实施方案包括1)使用穿过 一种适当的过滤器或一个离心步骤(将包装细胞与载体颗粒分开)来制备含有无细胞的逆 转录病毒颗粒的上清液。随后，通过共孵育一段可变的时间期限或通过进行所谓的“旋转感 染”将这些逆转录病毒颗粒制备物用于转导脊椎动物宿主细胞。这里，靶细胞悬液与含有逆 转录病毒颗粒的介质相混合，并且进行低速离心(图3b)。2)可替代地，通过一种膜(该膜 允许逆转录病毒颗粒通过、但是不允许包装细胞通过)将靶细胞与包装细胞进行的共培养 (能够使这两个细胞群进行细胞_细胞接触或分离)是可以进行的，从而能够使靶细胞进行 转导。作为用于逆转录病毒转导的宿主靶细胞，本方法的一个优选的实施方案是使用来 自啮齿动物的B淋巴细胞系细胞，这些细胞不表达内源性鼠免疫球蛋白，并且它们可以用 嗜亲性宿主范围的逆转录病毒进行转导。这种B淋巴细胞系的细胞具有以下优点它们已 经表达了 B细胞特异性Iga和Igi3蛋白，这些蛋白对于细胞表面表达以及膜结合型全长 免疫球蛋白的锚定是有利的。在这一方面，由免疫球蛋白阴性血浆细胞所衍生的细胞(像 例如骨髓瘤细胞，作为举例，但不限于Sp2/0、NS0、X63和Ag8653)通常缺少用于膜免疫球蛋 白沉积的辅助Iga和IgP蛋白。在这些情况下并且在任何其他脊椎动物宿主细胞中(其 中Iga和IgP蛋白是不表达的)，仍可以采用该方法，条件是当转染或转导针对Iga和 Ig^的表达载体时赋予了 Iga和IgP蛋白的表达(对于本领域内的普通技术人员而言 的一种标准过程)。因此，当异位表达Iga和Igi3这两种蛋白时，该方法可以用任何脊椎动物宿主细胞系来实现，条件是产生了具有适当趋向性的逆转录病毒颗粒，它们能够转导 所述脊椎动物宿主细胞系。为了说明清楚，在此披露的创新可以用任何脊椎动物宿主细胞 来实现，条件是泛嗜性逆转录病毒颗粒(例如，但不限于具有VSV的G蛋白假型颗粒)与一 种宿主细胞结合使用，该宿主细胞已经被修饰为异位地表达免疫球蛋白锚定分子Iga和 Ig^。这种B淋巴细胞系的优选细胞是例如但不限于来自任何脊椎动物物种的前B淋 巴细胞、B-白血病细胞或B-淋巴瘤细胞，以及可以通过组织培养生长很长时间的原代前B 细胞。前B淋巴细胞可以代表用于逆转录病毒表达免疫球蛋白的理想的宿主细胞，因为大 多数此类细胞系不表达内源性免疫球蛋白。具体地，因为鼠前B细胞系可以容易地从转化 了艾贝尔逊白小鼠白血病病毒(A-MuLV)的任何小鼠品系中获得。然而，原代长期增殖的前 B细胞、连同A-MuLV转化的前B细胞表达了前B细胞特异性蛋白VpreB和λ 5，这些蛋白在 一起形成了所谓的替代轻链，这种替代轻链在缺少常规轻链时可以形成免疫球蛋白重链与 替代轻链的前B细胞受体复合物。因为所希望的是表达由重组重链和轻链组成的免疫球蛋 白，前B细胞是优选的，这些细胞缺乏替代轻链组分的表达，包括λ 5、或VpreB 1、或VpreB2 基因(单基因敲除、双基因敲除或三基因敲除)的基因产物。因为已知替代轻链可以与异 源重链相结合，所预期的是替代轻链的表达可能在不同程度上干扰IgH/IgL对的筛选，但 由于通常在前B细胞中替代轻链蛋白的表达水平很低，该方法还可以使用表达替代轻链组 分的野生型前B细胞来实现。总之，表达Iga和IgiK并且不表达内源性免疫球蛋白的任 何脊椎动物细胞系可以用作靶宿主细胞用于本方法，其中替代轻链缺陷型前B细胞是用于 实现本发明的优选宿主细胞。有待表达、筛选并且鉴定的优选结合蛋白是全长抗体，并且在氨基酸序列方面是 全人类免疫球蛋白。然而，应当理解，在脊椎动物细胞中能够进行细胞表达的任何结合蛋白 可以经受筛选、并且根据所披露的方法选择特异性配体或抗体结合。例如，此类结合蛋白可 以包括来自任何脊椎动物物种的抗体的片段，像例如单链Fv、Fab片段(图2a)或Vh或\ 单域、或一条重链或轻链，优选地按照能够在细胞表面膜上进行沉积的方式进行表达。这可 以例如通过融合到其他I型跨膜蛋白的膜锚定分子上、使用GPI-锚定结构域、或本领域已 知的其他方法来实现。而且，该方法还可以适用于其他膜结合型蛋白，例如但不限于单体或 多聚体细胞因子受体、或二聚体T细胞受体、以及类似受体。逆转录病毒表达免疫球蛋白重 链和轻链是优选通过顺序地转导针对重链和轻链的单独的逆转录病毒表达构建体而实现 的。然而，本发明还能够通过进行靶细胞共转导而实现，其中使用了针对IgH和IgL链的单 独的逆转录病毒构建体。单独表达来自不同逆转录病毒载体的IgH和IgL链提供了以下优 点编码了多样的免疫球蛋白重链集合的逆转录病毒载体集合可以与编码了多样的免疫球 蛋白轻链集合的逆转录病毒表达载体集合进行随机组合。这种所谓的重链和轻链改组可以 产生高度多样性的不同的免疫球蛋白结合特异性，甚至当重链和轻链集合的总数受到限制 时(例如，IO4条不同的重链，随机与IO4条不同的轻链组合，理论上产生IO8种不同的抗体 特异性)。IgH和IgL链载体的集合的改组优选地用一种单边改组进行，即一种抗体的多肽 链是编码一种单独的抗体链的单独构建体。然而，应当理解，逆转录病毒IgH和IgL链表达也是可以实现的，条件是这两种蛋 白是在同一个逆转录病毒主链上编码的(见以下)。以其最容易的构型，通过将重链和轻链cDNA克隆到一个空的逆转录病毒载体中赋予了重链和轻链的表达，其中表达是由5’LTR的 启动子活性驱动的并且适当的RNA加工是由3’LTR序列介导的(图3a)。这些重链构建体应 当优选地含有它们内源性跨膜编码区，从而允许这些重组免疫球蛋白的最佳膜沉积。然而， 对于本领域普通技术人员，应该清楚的是其他跨膜蛋白的跨膜区域也可以与抗体的恒定区 相融合，从而确保所表达的经修饰的免疫球蛋白的表面沉积。特别地，在表达抗体片段、或 表达非免疫球蛋白结合蛋白的背景中，膜结合型蛋白的不同跨膜区对于细胞表面表达这些 结合物可以是有利的。然而，细胞表面表达抗体或其片段是本发明的一种优选的实施方案，这些生物分 子还可以被替代性地表达为可溶的、分泌型蛋白，这样使得在流动相中进行这种抗体的检 测。这种形式的表达可能是有利的，条件是筛选单独的生产者克隆以及结合物涉及一种要 求可溶性抗体的测定，或者条件是该测定是在半固体介质中进行的，其中一种测定允许对 单细胞克隆上的表达水平和结合特异性进行定量。用于重组免疫球蛋白的表达载体可以用 于编码所有已知的免疫球蛋白重链和轻链同种型，这在全人类抗体的情况下允许表达IgM、 IgD、IgG1, IgG2, IgG3、IgG4, IgA1, IgA2 以及 IgE 抗体，这些抗体含有 IgK 链或 IgX 轻链。 在针对人类重链和轻链的所有逆转录病毒表达载体中，优选的是只有一条人类重链以及轻 链的可变编码区可以使用独特的限制性内切酶(像例如，但不限于HindIII和EC047III) 进行替换，如在逆转录病毒抗体表达载体的示意性图中所描绘(4a和4b))。这将允许在逆 转录病毒表达载体中容易地克隆和替换可变编码区(使用V区文库或单独的V区编码区)， 与针对免疫球蛋白重链和轻链的恒定编码区形成阅读框(in-frame)。这种只交换可变区 结构域的方案(旨在产生编码了一种单一特异性的表达载体、或旨在产生一个结合蛋白集 合)应该是有利的。在这个方面，可以表达全长抗体，这些抗体含有由不同物种所衍生的可 变区结构域和恒定区结构域(嵌合抗体)。通过将针对感兴趣的结合蛋白或基因的一个cDNA编码区插入到一种“空”逆转录 病毒表达载体主链中可以构建最简单的针对结合蛋白的逆转录病毒表达载体(图3a)。即 使在缺少允许直接检测所转导的细胞的任何选择标志物和/或筛选标志物(例如，增强的 绿色荧光蛋白，EGFP)时，本发明是可以实现的，因为稳定表达来自这些逆转录病毒载体的 结合蛋白的细胞是可以基于这些结合蛋白的稳定表达(以分泌形式或以膜结合形式)而进 行鉴定和分离的。然而，在逆转录病毒表达载体中所包括的不同的特征是优选的。第一个 是驱动这些重组结合蛋白表达的一个强组成型或诱导型的启动子元件，它直接位于该编码 cDNA区的上游。(图4a，b)。这些启动子可以是例如但不限于组成型启动子(像立即早期 CMV启动子、β-肌动蛋白启动子、EF-I α启动子)、或诱导型启动子(像四环素或任何其他 抗生素可诱导的启动子)，通过加入或去除四环素或其他抗生素以及其衍生物(例如多西 环素)可以使这些启动子向上调节或者向下调节表达。在这些逆转录病毒表达构建体中所 包括的诱导型启动子元件是另一个优选的实施方案，因为已知在一些逆转录病毒表达载体 主链中5’ LTR启动子或甚至强组成型启动子可能被沉默。除了启动子元件，一个优选的实施方案是在这些逆转录病毒表达构建体中包括标 志物基因，这些标志物基因随后允许对稳定地逆转录病毒转导的宿主细胞进行选择和/或 监测、而无需检测这些重组结合蛋白(图4a，b)选择和/或筛选标志物对于这种优选的两 步逆转录病毒转导科学试验方案(涉及到顺序地转导免疫球蛋白重链和轻链逆转录病毒表达载体)是特别有用的。在一个两步转导的科学试验方案中，一种脊椎动物宿主细胞首 先转导了至少一种逆转录病毒表达构建体(该构建体编码了一种或多种第一免疫球蛋白 多肽链)，并且在第一次稳定地表达至少一种多肽链之后，用至少一种逆转录病毒表达构建 体(该构建体编码了相应的其他一种或多种免疫球蛋白多肽链)进行第二次转导，然后允 许产生一种完全抗体或抗体集合。如果使用一种选择或筛选标志物用于选择或筛选成功 的第一次转导事件，非常有用的是对至少两种逆转录病毒表达构建体的共转导频率进行优 化，这些构建体编码了一种多聚体结合蛋白的单独的链(例如抗体)。因此，使用选择和/ 或筛选标志物是强烈优选的。赋予抗生素抗性的、用于选择哺乳动物细胞的选择标志物包括但不限于例如，针 对嘌罗霉素、新霉素、潮霉素B、霉酚酸、组氨醇、博来霉素、以及腐草霉素抗性的基因。为 了表达由单独的逆转录病毒构建体编码的多亚基蛋白(例如抗体)，优选地将不同的多肽 链的表达与不同的选择标志物相连接，从而允许对稳定转导地相应表达构建体进行分开选 择。允许监测逆转录病毒转导到宿主细胞中的标志物基因包括但不限于将自身荧 光赋予所转导的细胞的基因，像例如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白 (EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)以及红色荧光蛋白(RFP)。可替代地，可 以使用细胞表面标志物，例如CD7或其截短的变体、CD34或其截短的变体、或低亲和力神经 生长因子受体。在一个优选的实施方案中，这些抗生素选择标志物、荧光标志物或细胞表面 标志物的表达是与经由所谓的内部核糖体进入序列(IRES)的重组结合蛋白的表达相偶联 的，在脊椎动物细胞中这些序列允许对来自一个单一启动子元件的两种基因进行偶联共表 达(图4b)。然而，本领域内的普通技术人员还可以通过从在逆转录病毒构建体中含有的一 种单独的表达盒(由一种额外的启动子元件驱动)表达一种选择和/或标志物基因来实现 本发明。为了从单独的逆转录病毒载体中表达多亚基蛋白(像免疫球蛋白)，优选的是将不 同的结合蛋白链连接到不同的选择和/或筛选标志物上，从而允许分开监测这些不同的表 达构建体的稳定转导。在该重组结合蛋白的表达是由如以上概述的一种单独的启动子驱动的情况下，还 可以将任何选择或筛选标志物基因克隆到5’ LTR的下游、以及5’ LTR和Ψ包装信号的下 游，这样它的表达是由5’ LTR启动子来驱动的(参见图3和4)。如以上所提及的，本发明的一个优选的实施方案是在B淋巴细胞系的细胞中(优 选地在前B淋巴中)表达重组抗体或其片段。因此，进一步优选通过启动子和增强子的组 合来驱动重组抗体的表达，该组合已知在B细胞系的细胞中赋予了选择性的高水平表达。 此类启动子/增强子组合可以是例如但不限于免疫球蛋白κ轻链启动子、κ-内含子和 3’ κ增强子的组合、或免疫球蛋白重链、重链内含子和3’ α增强子的组合。免疫球蛋白 κ轻链启动子、κ内含子和3’ κ增强子组合的组合是优选的(图4a，b)，因为已知该组 合允许在B细胞系细胞中高水平表达免疫球蛋白链，并且因为顺式调控基因元件的这种组 合能够以一种调控的方式(由活化的B细胞特异性酶AID (活化诱导的胞苷脱氨酶)所介 导)向抗体的编码区促进体细胞超突变，这是本发明的一个实施方案，如以下进一步详述。然而，本领域内的普通技术人员应该意识到为了实现本发明在逆转录病毒载体中 表达一种特定的重组抗体是可以受到顺式调控启动子/增强子元件以及允许在所希望的脊椎动物宿主细胞中在细胞表面膜上或以分泌形式表达该抗体的编码区的任何组合的影 响。尽管本发明的一个优选的实施方案是从单独的逆转录病毒表达构建体中表达多 亚基结合蛋白(例如抗体)(图4a和b)，本发明还是可以实现的，条件是多亚基结合蛋白的 不同蛋白链的表达是在相同的逆转录病毒表达构建体上连接的。在免疫球蛋白的情况下， 这可以通过(但不限于)来自一种启动子的重链和轻链的表达以及通过IRES序列将针对 重链和轻链的编码区分开而实现的。在这种替代方案中，优选将该重链直接克隆到该启动 子的下游以及IRES的轻链下游，因为与该IRES上游的基因相比已知IRES之后的一个基因 通常在某种程度上以更低的水平进行表达。因为轻链是较小的分子，预计的是实现了经由 IRES连接所表达的重链和轻链的一种更好的化学当量表达，条件是轻链表达是经由IRES 控制的。可替代地，一种二聚体结合蛋白(例如抗体)的两条链的共表达可以通过将两种 单独的表达盒克隆到一个单独的逆转录病毒主链中来实现，这样就分开地控制了每条单个 的结合蛋白链的表达。作为这种方法的替代方法，还有可能的是通过使用将转录活性赋予 至相反方向的双向启动子将两种不同结合蛋白链的表达连接到相同的载体中。后一种选 择具有潜在的优点，即不发生启动子干扰(它在邻近位置上负面地影响了启动子的表达水 平)。应该强调的是，独立于具有两个结合蛋白编码区(例如，免疫球蛋白的重链和轻 链)的逆转录病毒载体的详细的基因组织结构，该方法允许将结合蛋白对的单一逆转录病 毒基因转移到靶细胞中，这允许促进了二聚体结合蛋白的克隆表达的控制、并且与两步逆 转录病毒转导的科学试验方案相比减少了用于产生一种表达结合物的细胞群的时间限度。除了顺式调控基因元件(像启动子和增强子)、以及可选择的或可筛选的标志物 基因(像抗生物抗性标志物)、以及编码自身荧光蛋白的基因之外，可以在不同的背景中将 针对免疫球蛋白重链和轻链的编码区克隆到逆转录病毒表达载体中。在本发明的一个优选的实施方案中，将免疫球蛋白重链和轻链编码区作为连续的 cDNA序列克隆到逆转录病毒表达构建体中，包括适当的表面表达和/或分泌所要求的引导 序列。针对此类具有增强子元件的表达载体的基本设计的实例在图4a中描绘。优选地，这 些重链编码了人类Yl重链同种型以及轻链κ轻链同种型，然而应当理解可以使用人类或 其他脊椎动物物种的任何其他重链和轻链同种型以实现本发明。在此类逆转录病毒cDNA 表达载体中，优先的是在可变编码区与恒定编码区之间的接合处包括一种独特的限制性内 切酶，这将允许仅替换Vh和\编码区以便改变所表达的抗体的特异性、或这允许插入多个 Vh和\编码区用于在靶细胞中表达多样的逆转录病毒抗体文库。在一个优选的实施方案 中，在Vh-CyI和V^CK边缘引入的限制性内切酶位点是一个EC047III位点(图4a，b)， 它没有改变所表达的重链的氨基酸组成并且只能导致在恒定κ编码区的第一个位置上的 一个保守的苏氨酸向丝氨酸的氨基酸的改变，这不影响逆转录病毒表达的人类IgG1分子的 结合特性。作为含有异源的、优选处于cDNA构型的全人类抗体的编码信息的逆转录病毒构 建体的一种替代方案，可以使用在基因组结构中含有编码区的逆转录病毒表达载体，其中 在胚系中发现了针对免疫球蛋白重链和轻链的典型的外显子-内含子结构。因为当逆转录
33病毒颗粒包装时逆转录病毒载体将被转录为mRNA，表达构建体的这种组织结构要求这些编 码区的转录组织结构沿相反的方向移动到该逆转录病毒基因组的5’ LTR的转录起始位点， 因为否则该逆转录病毒转移载体将已经被剪接，此时在转导并且将重组的构建体稳定地整 合到靶细胞中之前该外显子_内含子结构会丢失。然而，这些构建体提供了抗体可以被表 达为膜结合型抗体或分泌型抗体表达的功能性，这取决于用于转导的靶细胞的本性、以及 靶细胞在针对所分泌的抗体的内部终止密码子上终止转录的能力、或通过可替代地剪接针 对所分泌的抗体的终止密码子上游的一个剪接供体的能力以便剪接膜结合型免疫球蛋白 的跨膜外显子受体的能力。本发明的一个优选的方面是产生并且使用针对人类抗体或任何异源抗体或其片 段的逆转录病毒表达构建体，其中该重链和/或轻链的可变编码区仍然需要在这些靶细胞 中通过V (D) J重组的过程从处于“准胚系”构型的V、可任选地D、以及J基因片段进行装配。 此类表达载体的基本设计的图示描绘于图4b中，它仍然具有不可重排的构建体的特征，即 针对重链和轻链的“胚系” V-D-J或V-J盒可以被独特的限制性内切酶位点替代，包括优选 的在J-元件编码区的3’边缘的EC047III。在这些载体中含有的这些V、D和J元件其侧 翼是已知为针对重组活化基因(RAG)I和2的识别基序的保守的重组信号序列(RSS)。当 RAGl和RAG2在任何脊椎动物细胞中共表达时，此类载体将位点特异性地重组V、可任选地 D以及J基因片段从而产生对应地编码抗体重链和轻链的可变结构域的Vh和\区。RAG-I 和RAG-2基因的表达，以及由此的V(D)J重组活性通常限定为早期前体淋巴细胞。因此，优 选地使用前体淋巴细胞来实现本发明自动地提供了用于V(D) J重组的活性。然而，已知当 RAG-I和RAG-2过量表达时，可能导致任何体细胞脊椎动物细胞系适合用于V(D) J重组，并 且因此本领域中任何普通技术人员也可以使用任何非前体淋巴细胞系、通过提供RAG-I和 RAG-2的异位表达来实现本发明的这个方面。作为一种可替代的方案，甚至可以使用RAG-I 或RAG-2缺陷型细胞系，其中RAG-I或RAG-2缺陷是通过过量表达相应的RAG基因或其一 种片段来互补的。此类V(D) J可重排的构建体具有以下优点从稳定地转导到一种脊椎动物宿主细 胞中的一种单一逆转录病毒表达构建体中，可以经由RAG-I和RAG-2介导的V(D)J重组产 生多样的抗体特异性表达谱。尽管已知V、D和J基因元件的连接涉及到很大程度的不精确性，这种不精确显著 地导致在Vh和\互补决定区(OTR) 3中发现的多样氨基酸序列，优选的是使用V-D-J-C y 1 和V-J-C κ逆转录病毒构建体的集合，该集合代表几种V区家族，D和J元件，从而增加在 所提供的胚系基因片段序列的水平上已有的变异性。尽管如此，优选使用逆转录病毒构建 体(允许体细胞装配由V(D)J重组过程所介导的V、可任选地D、以及J基因片段)当转导 原位进入前体淋巴细胞时允许产生可变域结合区的大多样性，这样可以从单一的或有限数 量的构建体产生多种的IgH和IgL链集合。通过不精确地连接V、D和J基因片段所产生的多样性是通过前体淋巴细胞特异性 表达的基因末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的存在而显著地增加的，这种酶是仅有的能够将 核苷酸加入到3，DNA末端、而无需一条互补的模板DNA链的DNA聚合酶。为了增加连接的 多样性，优选的是使用具有高内源性TdT表达水平的细胞、或可替代地通过本领域中已知 的方法在用于逆转录细胞展示的靶宿主细胞中异位地表达TdT。
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本发明的另一个实施方案是使用含有超过一个的V、或D或J基因片段的V (D) J可 重排逆转录病毒构建体，这样通过V(D) J重组过程可以将不同的V、D和J基因片段用于不 同的来自相同构建体的重排的克隆中。将多种不同的V、D和J基因片段结合到此类构建体 中仅仅是由逆转录病毒载体接受DNA的总能力所限制的，这种能力据报道最大在8-lOkb的 范围内。尽管使用了能够进行V(D)J重组的逆转录病毒构建体(图4a，b下方图片)用于 表达异源抗体或其片段是本发明的一个方面，清楚的是经由这种方法产生一个多样表达谱 主要局限于在免疫球蛋白重链和轻链的CDR3区中产生多样性，与在早期B淋巴细胞增殖过 程中产生的一种一抗表达谱的特征非常类似。适应性的免疫系统的真质标记(hallmark)是它的亲和力饱和抗体可变域的能 力，这是基于可变域编码区的体细胞超突变的。体细胞超突变已知被活化诱导胞苷脱氨酶 (AID)这种酶强烈地增强。高水平的体细胞超突变额外地取决于来自免疫球蛋白基因座 的顺式调控增强子元件的存在，并且有益的作用已经被最清楚地描述用于IgK内含子和 3’ κ增强子元件的组合。因此，本发明的一个方面是通过本领域中已知的方法、组成型或 诱导型地使用含有这些顺式调控元件的逆转录病毒以便在内源性或异位地表达AID酶的 靶细胞中逆转录病毒地表达此类免疫球蛋白表达构建体。在能够进行体细胞超突变的逆转录病毒构建体的背景中以及在表达AID的宿主 细胞的背景中使用“逆转录细胞展示”在转导到表达AID的宿主细胞中之后允许对一种抗 体进行进一步原位多样化。本发明的这些方面的组合概括为在适应性免疫系统中所发生的所有分子和遗传 事件(被称为从一种或有限数量的含有有限数量的V、D和J基因片段的构建体中产生一种 一抗抗体表达谱)、以及额外的AID介导的用于抗体的抗原结合可变域的编码区的体细胞 超突变。针对所希望抗原的更高亲和力抗体结合物的特异性选择是可以通过逆转录细胞、 经由通过基于标准FACS的技术所检测的增加与所选择的希望的抗体、之后跟随高速制备 型细胞分选强抗原结合物来实现的。由此可将强结合物将选择性地分离，并且由逆转录病 毒载体编码的抗体基因可以通过本领域内已知的标准分子生物学方法(包括但不限于基 因组PCR以及RT-PCR)从所选的细胞或细胞克隆进行再分离、克隆和测序。在一个优选的实施方案中，最终的细胞分选步骤是以单细胞分选来进行的，允许 这种克隆分离并且抗原反应性细胞克隆的最终扩展，这促进了来自所选择的结合物的同源 IgH就IgL链对的编码区的克隆和序列测定。若希望，富含FACS的细胞可以通过培养进行扩展、并且可以再次任选地经由抗原 结合并且重复高度反应性细胞的高速细胞分选，可任选地重复使用的一个过程，直到达到 了所希望的染色强度以及由此对于一种所希望的抗原的结合特异性(图1)。抗原反应性细 胞的这种选择性富集和体外扩展模拟了在T细胞依赖性免疫反应中所发生的更高亲和力 结合物的选择性结果。应当注意到，高速细胞分选仪辅助富集抗原反应性细胞仅仅是实现本发明的一种 优选的方法，但是也可以采用针对抗原活性来选择并且分离细胞的其他方法(像例如但不 限于淘洗法)，其中细胞结合到固定在一种固体支撑物的抗原上。此外，可能的是通过显微操作的方法将抗原反应性细胞富集，这些显微操作的方法例如但不限于在微孔板中或作 为细胞克隆在半固体培养基中在有限稀释条件下使细胞生长，这允许特异性抗原染色和/ 或标记细胞克隆、并且它们通过显微镜辅助方法的鉴定之后跟随手动和/或机械手辅助挑 选抗原反应性克隆。本发明的另一个实施方案是在诱变条件的存在下(特别是将突变特异性地靶向 可变抗原结合域的编码区)进行抗原_反应性细胞的抗原_选择/FAS-分选/扩展的反复 循环。通过这种方法在每一轮细胞增殖中产生了原位产生的更高亲和力突变体。当细胞分 选时以及在逆转录细胞展示时将显示增加的抗体结合进行富集时，可以选择性地富集和扩 展更高亲和力突变体。靶向抗体可变区域的超突变率是通过在表达抗体的细胞中过量表达 AID酶而实现，特别是当这些表达构建体含有顺式调控启动子和多个增强子元件时(包括 但不限于已知为抗体可变区提供AID介导的体细胞超突变的免疫球蛋白κ内含子以及 3’ κ增强子元件(图4a和b))。尽管这种方法可以内源地或异位地使用组成型表达AID 的细胞来实现，本发明的一个方面使用了 AID表达载体，其中使用诱导型启动子(例如但不 限于四环素和/或强力霉素诱导型启动子系统(Gossen & BUjard，1992))可以诱导并且再 次关闭AID表达，其中一种感兴趣的基因表达是由侧翼为原核tet-操纵子的串联重复的最 小CMV启动子控制的，并且它是可以使用HSV-VPie-Tet-抑制子进行诱导或抑制用于表达， 该融合蛋白结合到tet-操纵子上是由四环素或四环素衍生物变构控制的。在以下非限制性的实例中，本发明得到了更详细地地解释。实例1对应地克隆含有潮霉素B和嘌罗霉素抗生素药物筛选标志物的全人类免疫球蛋 白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(IgL)的逆转录病毒表达载体如之前所提及，本发明可以与逆转录病毒表达载体一起来实现与不同设计的蛋白 的结合(与例如图4a_c相比)。作为可以用于实现本发明的载体设计之一的一个实例，在 此说明了逆转录病毒表达载体的详细的克隆策略，允许表达全人类IgG1/ κ L抗体，并且使 用抗生素抗性标志物来选择在靶细胞中稳定维持的这些载体。a)构建针对人类免疫球蛋白重链(IgH)的逆转录病毒表达载体作为构建逆 转录病毒人类免疫球蛋白重链表达载体的一个起始点，使用可商购的逆转录病毒载体 pLHCX (BD-Clontech, Mountain View, CA)(图 5a)。pLHCX 含有一种由该逆转录病毒主链的 5’ LTR启动子驱动的潮霉素B抗性标志物基因。此外，pLHCX含有CMV立即早期启动子，之 后跟随简单的多克隆位点(MCS)用于有待表达的感兴趣基因的插入。此外，pLHCX主链在 CMV启动子的上游含有一个方便的独特的BglII限制性酶切位点(图5a)，额外的基因元件 可以克隆到该酶切位点中。本发明的一个优选的实施方案是使用EC047III限制性内切酶用于将人类Vh编 码区框内克隆到这些人类恒定的Yl重链编码区中，因为可以将这个特定的限制性酶切位 点引入\和CyI编码区之间的接合处，而不改变所表达的IgH链的氨基酸组成。然而， pLHCX在Ψ包装信号中含有一个EC047III限制性内切酶位点(图5a)，这将排除直接使用 EC047III用于以上提及区克隆策略。为了将这个不方便的EC047III限制性内切酶位 点从pLHCX载体主链中去除，执行以下第一个预备克隆步骤，如在图5a中所详述。通过定 点诱变将Ψ包装信号中的EC047III位点去除，这是使用一种商业性Quikchange 试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)将Eco47III识别序列AGCGCT的第三个C核苷酸替换为A、使 用提供令人希望的突变的特异性引物对、根据制造商的说明书来进行的。所修饰的载体被 命名为pLHCX-ml，并且已证实在该V(Psi)包装信号中这种单碱基对的取代不影响所修饰 的载体pLHCX-ml的逆转录病毒转导效率(数据未显示)。已经平行地将编码人类C γ 1恒定区(具有或没有跨膜编码区Ml和M2)的cDNA 克隆到pLHCX-ml主链中。使用人类外周血淋巴细胞的cDNA作为模板、以及正向和反向引 物 Seq-IDl、Seq_ID2、Seq_ID3 (见以下)通过 RT-PCR 将 C γ l_m 和 C γ l_s DNA 片段扩增。 为了对这种膜结合形式的人类Ig进行RT-PCR扩增，使用了 Seq-IDl和Seq_ID2的引物组 合，并且为了克隆分泌型人类IgG，使用了 Seq-IDl和Seq_ID3的引物组合。这些正向和反 向PCR扩增引物对应地含有HindIII和ClaI限制性酶切位点，允许将这些PCR扩增的片段 定向克隆到pLHCX-ml中CMV启动子的独特的HindIII和ClaI位点下游(图5a)。该正向 PCR扩增引物额外含有用于将Vh区框内融合到这些恒定区的一个内部的EC047III位点，而 不改变这些已表达的全长IgG1重链的氨基酸组成。反向PCR扩增引物Seq_ID2和Seq_ID3 含有额外的内部NotI位点，这些位点允许在该编码区的下游直接对这种构建体进行限制 性内切酶酶解用于一般进行克隆的目的，例如交换编码该恒定区的区域用于表达不同的Ig 同种型。Seq-IDl 5' -GATC AAGCTTAGCGCT TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC-3‘HindIII/Eco47III引物Seq_ID2被用作一种反向引物用于分泌型人类IgG1连同Seq-IDl的PCR扩 增，并且含有一种独特的NotI位点(加下划线)用于克隆目的。Seq-ID2 5' -GATC ATCGATGCGGCCGC' TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3 ‘Clal/NotI引物Seq_ID3被用作一种反向引物用于膜结合型人类IgG1连同Seq-IDl的PCR扩 增，并且含有一种独特的NotI位点(加下划线的)用于克隆目的。Seq-ID3 5' -GATC ATCGATGCGGCCGC TAGGCCCCCTGCCTGATCATGTTC-3 ‘Clal/NotI将得到的PCR产物(对于分泌型人类CYl大约1. Okb，以及对于膜结合型 人类CyI大约1.2kb)用HindIII和ClaI限制性内切酶进行酶解，并且平行地定向 克隆到适合的限制性酶切位点pLHCX-ml中，对应地得到质粒pLHCX-ml-C y 1-s和 pLHCX-ml-CY 1-m(还参见图5b)。然后，使用独特的限制性内切酶HindIII和Ec047III将 Vh链区域框内克隆到分泌型或膜结合型人类C y 1的编码区，侧翼为Vh区片段(图5b)。这 些限制性内切酶的组合在所有7种人类V基因片段家族的人类Vh编码区中极少被发现。为了构建一种全人类IgGl重链表达载体，将来自一种之前鉴别的全人类抗体、 对NIP-卵白蛋白特异的一种人类Vh编码区作为一种HindiII-Eco47III片段插入到 构建体 pLHCX-ml-C γ Is 禾口 pLHCX-ml-C Y Im 中，对应地得到质粒 pLHCX-ml-VHC γ Is 禾口 pLHCX-ml-VHCy lm(图5c)。在Seq_ID4中提供了 NIP-卵白蛋白特异的人类抗体的Vh编 码区，包括前导序列以及5，-HindIII和3，Eco47III克隆位点。应当注意到，两种额外的 C核苷酸已经加到该起始-ATG的上游用于改进的翻译(一种Kozak-共有序列的近似)Seq-ID4
AAGCTT CCATGGAGTTTGGGCTcAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAATGGTCGACCACGCGGAAAGCTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCT AGCGCT在Seq_ID4中将用于克隆的HindIII和Ec047III限制性酶切位点加下划线。该 前导序列的起始ATG在位置9开始。尽管在图5c中描绘的这些人类IgG1重链表达载体已经足以实现本发明、并且足 以与逆转录病毒IgL链表达载体相组合进行逆转录细胞展示，将体细胞超突变靶向Vh编码 区的功能性要求存在该免疫球蛋白轻链或重链基因座的某些顺式调控增强子元件。当已 知该κ轻链基因座的的κ内含子和3’ κ增强子元件能够将体细胞超突变靶向到位于一 种活性启动子的下游的V区时，已经按照以下方式额外地修饰这些基本的逆转录病毒人类 Ig重链表达载体PLHCXml-VHCglm和pLHCXml-VHCgls (图5c)以便含有κ内含子和3，κ 增强子元件。鼠κ内含子增强子(KiE)的序列位于一个大约2. 3kb长的基因间区域中， 该基因间区域位于Jk 5元件和恒定κ编码区之间，该鼠κ内含子增强子的序列可以由 NCBI-Genbank输入V00777得到。这种核心κ iE在该基因间区域中仅含有约0. 5kb，并且 它的序列可以由NCBI Genbank输入X00268得到。从J κ 5到C κ的全部2. 3kb片段(包 含该κ iE区)含有一个内部的BglII位点，排除了使用该限制性内切酶用于将一种PCR扩 增的基因组片段克隆到pLHCX-ml-VHC γ 1-s和pLHCX-ml_VHC γ l_m载体中。然而，在该区 域中没有内部的BamHI限制性内切酶片段，因此允许将一种侧翼为BamHI位点的基因组PCR 片段克隆到BglII线性化载体pLHCX-modl-VHC y Is和pLHCX-ml-VHC γ Im中(图5c)。已 经构建了以下载体，这些载体含有两个在Jk 5与Ck之间、全长大约2. 3kb的基因间区域 (这是使用正向和反向引物Seq_ID5和Seq_ID6、通过从小鼠基因组DNA中对该基因组片段 进行PCR扩增来进行的)，两者都含有额外的BamHI限制性酶切位点(加下划线)用于克隆 到pLHCX-ml-VHC γ 1和pLHCX-ml-VHC y Im的独特的BglII限制性酶切位点，对应地得到质 粒 pLHCX-ml-VHC γ Is- κ iE 禾口 pLHCX-ml-VHC γ Im- κ iE (图 5d)。Seq-ID5 5' -GATC GGATCC GTACACTTTTCTCATCTTTTTTTATGTG-3 ‘BamHISeg-ID6 5' -GATC GGATCC CTGAGGAAGGAAGCACAGAGGATGG-3‘BamHI除了插入含有来自小鼠κ轻链基因座的基因组片段、完整的约2. 3kb κ iE之外， 还已经将含有核心κ iE的一种更短的约0. 8kb基因组PCR片段(V00777的位置3634-4394， Seq-ID7)克隆到 pLHCX-ml-VHC y l_s 禾Π pLHCX-ml-VHC y l_m 的独特的 BglII 位点中(未 显示)。在Seq_ID8和Seq_ID9中描绘了用于该基因组DNA片段的PCR扩增的正向和反向 PCR引物。
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Seq-ID7 5’ GAAAAATGTTTAACTCAGCTACTATAATCCCATAATTTTGAAAACTATTTATTAGCTTTTGTGTTTGACCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTATTTAAGGACCCTTTAAAACTCTTGAAACTACTTTAGAGTCATTAAGTTATTTAACCACTTTT
AATTACTTTAAAATGATGTCAATTCCCTTTTAACTATTAATTTATTTTAAGGGGGGAAAGGCTGCTCATAATTCTATTGTTTTTCTTGGTAAAGAACTCTCAGTTTTCGTTTTTACTACCTCTGTCACCCAAGAGTTGGCATCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGAGGCCATCTGGCAGTTGCTTAAGATCAGAAGTGAAGTCTGCCAGTTCCTCCAAGGCAGGTGGCCCAGATTACAGTTGACCTGTTCTGGTGTGGCTAAAAATTGTCCCATGTGGTTACAAACCATTAGACCAGGGTCTGATGAATTGCTCAGAATATTTCTGGACACCCAAATACAGACCCTGGCTTAAGGCCCTGTCCATACAGTAGGTTTAGCTTGGCTACACCAAAGGAAGCCATACAGAGGCTAATATCAGAGTATTCTTGGAAGAGACAGGAGAAAATGAAAGCCAGTTTCTGCTCTTACCTTATGTGCTTGTGTTCAGACTCCCAAACATCAGGAGTG
TCAGATAAACTGGTCTGAATCTCTGTCTGAAGCATGGAACTGAAAAGAATGTAGTTTCAGGGAAGAAAGGCAATAGAAGGAAGCCTGAGAATATCTTCAAAGGG-3，Seq-ID8 5' -GATC GGATCC GAAAAATGTTTAACTCAGCTAC-3‘BamHISeq-ID9 5' -GATC GGATCC CCCTTTGAAGATATTCTCAGGCTTCC-3 ‘BamHI还将含有基因组PCR片段的大约0. 8kb片段的核心κ iE作为一种BamHI酶解的
PCR片段均克隆到载体pLHCX-ml-VHC y l_s以及pLHCX-ml_VHC y 1-m的独特的BglII限制 性酶切位点中(没有在此显示)。所贮藏的鼠3’ κ增强子元件的序列能够以NCBI-Genbank参考号X15878寻回，并 且该序列包含在一种808bp基因序列中，该基因序列位于该小鼠基因组中恒定的κ编码区 的大约8. 7kb下游。鼠3’ κ增强子不含有一个内部的ClaI位点，并且因此分别使用正向和反 向PCR引物Seq-IDlO和Seq-IDl 1从小鼠基因组DNA进行PCR扩增，该增强子含有额 外的ClaI限制性酶切位点用于克隆到逆转录病毒载体pLHCX-ml-VHC y ls-3' κ E和 pLHCX-ml-VHC y lm_3，κ E 的独特的 ClaI 位点中(图 5d)。Seq-IDlO 5' -GAGA ATCGAT AGCTCAAACCAGCTTAGGCTACAC-3‘ClaISeq-IDl 1 5' -GAGA ATCGAT TAGAACGTGTCTGGGCCCCATG-3‘ClaI这产生了编码二者中任何一种Ig重链的最终的Ig Y旧链表达载体
pLHCX-ml-VHC y ls-3' κ E- κ iE 和 pLHCX-ml-VHC γ lm_3，κ E- κ iE (图 5e)，这些 Ig 重链 在IgL链的共表达时对应地导致分泌型人类IgG1抗体的产生或导致膜结合型人类IgG1抗 体。
这两种载体均额外地在Ig Y ^链表达盒的上游和下游含有κ iE以及3’ κ E顺式 调控元件，将体细胞高度突变提供给这些经表达的Ig Y ^链的Vh区。b)克隆针对人类IgK轻链的逆转录病毒表达载体作为构建允许针对逆转录病毒的整合来进行抗生素筛选的、逆转录病毒的 人类免疫球蛋白轻链表达载体的一个起点，已经使用了可商购的逆转录病毒载体 pLPCX(BD-Clontech, Mountain View, CA)(图6a)。该载体含有提供嘌罗霉素抗性的一种 抗生素选择标志物，该标志物由该逆转录病毒主链的5’ LTR启动子驱动的。尽管在设计上 与pLHCX主链类似(参见实例la)，pLPCX含有两个Ec047III位点以及具有多个限制性酶 切位点的一个MCS，但是在CMV启动子的上游缺少方便的独特的BglII位点(图6a)。为了从pLPCX载体主链去除EC047III限制性内切酶、并且同时为了在CMV启动子 的上游引入一种独特的BglII限制性内切酶，进行以下预备克隆步骤第一步，通过定点诱 变将在PLHCX包装信号中的EC047III位点去除，这是使用一种商业性Quikchange 试剂 盒(Stratagene，La Jolla, CA)将Ec047III识别序列AGCGCT的第三个C核苷酸替换为A、 使用提供令人希望的突变的特异性的引物对、根据制造商的说明书来进行的(图6a)。已 证实在该V(Psi)包装信号中这种单碱基对的取代不影响这些已突变的载体的逆转录病 毒转导效率(数据未显示)。这种经突变的载体被命名为pLPCX-ml (图6a)。为了获得完 全没有EC047III位点、并且额外包括位于CMV启动子上游的一个独特的BglII位点的一个 pLPCX载体主链，将来自pLPCX-ml的一个Ascl-Ncol片段(其中已经由克列诺酶将NcoI酶 解的DNA末端填满)克隆到一个AscI-BlpI酶解的pLHCX主链中，其中BlpI酶解的DNA末 端已经由克列诺酶填满(图6b)，由此产生一种被命名为pLPCX-m2的载体，其中基本上只有 PLHCX的潮霉素B基因已经被pLPCX的嘌罗霉素抗性标志物替换(图6b)。为了构建化1^1^连表达载体，使用正向引物和反向引物5叫-1012和5叫-1013(对 应地含有HindIII和ClaI限制性酶切位点)将恒定的κ轻链编码区从人类外周血淋巴细 胞cDNA中进行PCR克隆，用于定向克隆于pLPCX-m2中(图6b)如在部分a.)中所说明，正 向引物Seq_ID12额外含有一个EC047III位点，允许将％编码区框内融合到这种恒定的κ 轻链编码区中，仅导致在人类恒定的κ轻链的第一个位置上一个保守的苏氨酸到丝氨酸 的氨基酸取代。该反向引物含有一个额外的内部NotI位点从而有助于以后的克隆操作，像 例如恒定的κ编码区的交换。 Seq-ID 12 5' -GATC AAGCTTAGCGCT CTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC-3‘HindIII/Eco47IIISeq-ID 13 5' -GAT ATCGATGCGGCCGC CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3‘Clal/NotI将5，端侧翼为HindIII/EC047III位点、并且在3，端侧翼为Notl/Clal位点的这 种恒定的κ轻链编码区插入到pLPCX-m2中产生质粒pLPCX-m2_C κ。为了构建一种完整的人类IgK L重链表达载体，将来自一种之前鉴定的全人类抗 体、对NIP-卵白蛋白特异的一种人类V κ编码区作为一种HindIII-EC047III片段插入到 构建体pLPCX-m2-CK中。(图6c)在Seq_ID14中提供了含有前导序列以及5’ -HindIII 和3’ EC047III克隆位点的NIP-卵白蛋白特异性人类抗体的Vk编码区。应当注意到，两 种额外的C核苷酸已经加到该起始-ATG的上游用于改进的翻译(一种Kozak-共有序列的近似)Seq-皿4 :5，_AAGCTT CCATGGATATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAG
TCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTcAACAGAGTTACAGTACCCCCACTTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCA AGCGCT -3 ’在Seq-IDH中将用于克隆的HindIII和Eco47III限制性酶切位点加下划 线。该前导序列的起始ATG在位置9起始。将这种HindIII-EC047III片段插入到 HindIII-Eco47III 线性化的 pLPCX-m2_C κ 中得到表达构建体 pLPCX-m2_V κ C κ (图 6c)。尽管这种逆转录病毒κ轻链表达载体已经足以实现本发明、并且足以通过与逆 转录病毒Ig重链表达载体共表达进行逆转录细胞展示，遵循着与用于Ig重链表达构建体 相同的克隆策略已经克隆了还含有κ iE和3’ κ E元件的额外载体。因此，将小鼠的κ iE插 入到CMV启动子上游的pLPCX-m2-V κ -C κ中的独特的BglII位点中，作为一种大约2. 3kb 基因组的、用引物Seq_ID5和Seq_ID6对扩增的BamHI酶解的PCR片段(参见以上所述)， 或者作为一种大约0. 8kb基因组的、用引物对Seq_ID8和Seq_ID9扩增的BamHI酶解的PCR 片段(参见以上所述)。在此仅描绘了将这种含有大约2. 3kb基因组的小鼠κ Ε的片段克 隆至Ij pLPCX-m2-V κ C κ 中，产生质粒 pLPCX-m2-V κ C κ - κ iE (图 6d)。最后，并且与在以上实例la中所说明的构建含有KiE和3’ κΕ的IgH链逆转录 病毒表达载体相类似，将鼠3’ κ E作为一种用引物对Seq-IDlO和Seq-IDll扩增的、ClaI 酶解的基因组PCR片段插入到该κ轻链编码区下游的独特的ClaI限制性位点上，以便产 生逆转录病毒表达载体pLPCX-m2-V κ -C κ - κ iE_3，κ E (图6d)。类似于含有κ iE和3’ κΕ元件的IgH链表达载体，这种载体现在含有将体细胞 超突变提供给克隆到该构建体中的任何一个Vκ编码区所要求的所有顺式调控元件(见以 下)。实例2产生一种过量表达活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的细胞系已经证明经活化的B细胞特异性蛋白活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)是一种独特的 反式激活性因子，该因子是要求的并且足以向任何脊椎动物细胞系提供一种体细胞超突变 表型。在表达AID的细胞中，可以将体细胞超突变特异性地靶向转录活化的基因座，条件是 它们被安排在顺式调控增强子元件的正确环境中，特别是该免疫球蛋白κ轻链基因座的 KiE和3’ κΕ元件的正确环境中，。为了获得稳定表达AID的细胞系，首先按照以下方法 构建一种编码鼠AID的逆转录病毒表达构建体。使用高保真Pfx聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)从全部小鼠的脾cDNA中对鼠 AID cDNA进行PCR扩增，这是根据制造商的说明书、使用正向和反向PCR引物Seq_ID15和 Seq_ID16(包含用于将该PCR扩增的片段连接到适合的载体中的额外的XhoI克隆位点)来
41进行的。此外，该正向引物在XhoI位点下游以及鼠AID ORF的起始ATG密码子的上游含有 额外的两种C核苷酸(斜体字突出显示)，以便近似于一种Kozak翻译初始序列并且由此确 保适当地翻译所克隆的cDNA。 Seq-ID 15 5' -AAT CTCGAG CCATGGACAGCCTTCTGATGAAGCAAAAG-3‘将所得到的620bp的RT-PCR产物用XhoI酶解，并且连接到用XhoI酶解的、并且 用碱性磷酸酶处理的PLPCX(来自BD-Clontech (Mountain View, CA))上。通过诊断型限制 性内切酶的酶解来确定含有以正确方向插入的连接产物。通过DNA测序证实具有正确的限 制性内切酶模式、含有在正确方向上的鼠AIDcDNA插入片段的一种克隆，并且将其命名为 pLPCX-mAID (图 7)。所克隆的鼠AID cDNA的序列确切地对应于已公布的鼠AID cDNA ORF (在 NCBI-Genbank 输入 AF 132979 提供)。下一步，将10 μ g的PvuI线性化的pLPCX-mAID构建体在环境温度下、通过 以300V、960yF进行电穿孔转染到再次悬浮于800μ普通RPMI培养基中的5Χ106个 FA-12AbelSOn转化的前B细胞中。将转染的细胞再次悬浮于20ml含有FCS的生长培养 基中，并且以200 μ 1/孔铺板于10个96孔板中。转染后48小时，通过向该培养基中加入 2 μ g/ml嘌罗霉素抗生素将稳定转染的细胞选择出。转染后10至14天后，几十个嘌罗霉素抗性集落是可检测到的，并且将选出的克隆 转移到含有2 μ g/ml嘌罗霉素的新鲜的培养基中。将这些嘌罗霉素抗体克隆进一步扩展， 并且如制造商所推荐、使用一种商业性抗小鼠AID抗体、通过ECL蛋白印迹法对选出的多个 集落测试鼠AID蛋白的表达(见图9a)。正如所预期的，一个特异性AID蛋白带在大约80%的所分析的FA_12_AID转染细 胞克隆中是可检测到的，并且显示表观分子量为25kD。从这个结果得出结论获得了组成 型过量表达该鼠AID蛋白的几种细胞系。实例3证明在含有顺式调控κ iE和3’ KE元件的逆转录病毒人类免疫球蛋白表达构建 体中靶向一种该报告基因的体细胞超突变下一步，证明了在逆转录病毒表达构建体中的人类抗体可变区(正如在本发明中 所披露)是用于AID介导的体细胞超突变的靶标。为此，产生了一种报告基因构建体，其中 一种人类IgH链的V-区ORF被替换为一种突变的EGFP0RF，其中已经将一种终止密码子引 入到一种RGYW序列基序的背景中，该基序已知是用于体细胞超突变的一个热点(Bachl & Olsson,1999)。将该终止突变引入到EGFP ORF的密码子107处，将一种酪氨酸密码子变成一种 TAG终止密码子。此外，对密码子108进行修饰，由此在所突变的EGFP序列中产生一种新颖 的诊断型SpeI限制性位点，这样使得当密码子107中的终止突变发生回复突变时，SpeI位 点会被破坏，由此促进了回复突变体的鉴定和表征。引入到EGFP ORF的序列修饰描绘于图 IOa中，全部的经突变的EGFP ORF在图IOb中提供。Seq-ID16
XhoI
-AATA CTCGAG TCAAAATCCCAACATACGAAATGCATC-3 XhoI
按照以下方式构建了用于证明体细胞超突变的报告基因构建体从作为一种模板的质粒pIRES-EGFP(BD_Clontech，Mountain View, CA)，使用高 保真 Pfx-聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA)、以及正向引物 Seq_ID17 和 Seq_ID18(各 自均含有额外的HindIII和EC047III限制性酶切位点，允许用一个EGFP ORF替代 pLHCXml-VHC y _s_ κ Ε-3，κ E中的Vh-区)将该EGFP ORF进行PCR扩增。该正向引物在 该ATG起始密码子的上游含有额外的两种C核苷酸(以斜体字突出显示)，它近似于一种 Kozak翻译起始共有序列并且确保在这种正确的ATG起始密码子处适当地起始翻译。Seq-ID17 5' -CGC AAGCTT CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3‘HindIIISeq-ID18 5' -TAG AGCGCT CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG-3‘Eco47III将737bp的Pfx扩增的EGFP PCR片段直接克隆到pCR4-Topo载体中，这种 pCR4-Topo 载体是一种 Zero-Blunt PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的一部分， 产生pCR4-Topo-EGFP载体(图11)。下一步，将pCR4-Topo-EGFP的一种证实序列的克隆在 EGFP ORF的密码子107和108处进行突变，正如图10中所描绘，这是根据制造商的说明书 使用一种Quikchange 试剂盒(Stratagen^La Jolla,CA)、使用提供这些令人希望的突变 的特异性引物对来进行的，由此产生质粒pCR4-Topo-EGFPmut。使用限制性内切酶HindIII和Ec047III、通过双限制性内切酶酶解、从该质粒回 收pCR4-Topo-EGFPmut的序列经证实的突变的EGFP ORF0将酶解的片段连接到HindIII和 Eco47III双消化质粒pLHCXml-VHC γ-S-κ Ε-3' κ E (图5e)中，并且连接到不含有增强子 元件的HindIII和Eco47III双酶解质粒pLHCXml-VHCY-s (图5c)中。由此，在两种载体 中这些Vh编码区被替换为经突变的EGFP 0RF，它们被框内融合到这些Cy1区上，得到报告 质粒 pLHCXml-E (mut) -C y -s_ κ iE_3，κ Ε、以及对照报告质粒 pLHCXml-E (mut) -C γ -s (图 11)。将两种质粒转导到抗嘌罗霉素FA-12AID转染子克隆3 (表达AID)和作为对照物 的5(无AID表达)中。转导后24小时开始在2mg/ml潮霉素B筛选下培养转导的细胞，并 且在培养6、8和10天后分析这些细胞分析绿色自身荧光细胞的出现。只有在该实验中(其 中在具有 KiE 和 3，κΕ 的背景中(gp，使用质粒pLHCXml-E(mut)-Cγ-s-κiE-3，κ E)、 并且在FA-12AID转染子中表达一种突变的EGFP报告构建体，其中AID表达可以通过蛋白 质印迹法检出的(即，FA-12AID转染子克隆3))，当一种稳定态频率为大约0.2% (图9b) 的绿色细胞可以有FACS检测出时在培养6、8和10天之后才可以检测出绿色自动发荧光细 胞。在这些对照实验中(无AID表达，和/或在这些构建体中不存在增强子元件，数据未显 示)没有一项实验在该实验的10天持续期间内能够检测到绿色细胞。在已经长成足够的细胞之后，从这种0. 2%的EGFP阳性群中将192个单细胞分选 到两个96孔板的各个孔中，并且通过FACS对来自这些单分选克隆的100个克隆分析绿色 荧光。在所分析的100个克隆中，95个克隆展示出一种同质(homogenous)的荧光模式，在 强度方面与在这些单分选的细胞中检测到的荧光相类似，例如在大约IO2对数荧光(FA-12 细胞的对照细胞的自动荧光仍然在IO1对数荧光水平以下，通过阈值线指出)。4个克隆展 示出一种不同的荧光模式，其中对于EGFP表达而言大约半数的细胞是阴性、并且半数的细
43胞是阳性。所分析的100个克隆中只有一个在实践上没有展示出EGFP荧光，尽管该克隆也 是稍微高于背景的自动荧光水平。具有异质的并且阴性的EGFP模式的这5个克隆可能是 由于将病毒整合体的EGFP表达(部分地)位置沉默逆转录，或这些结果可能是由于单细胞 分选的假象。尽管如此，在大多数克隆(95%)中，EGFP表达是可清楚地检出的。使用克隆 引物Seq_ID17和Seq_ID18、通过PCR来分析这些克隆中的24个克隆，以便从这些稳定转导 的细胞再扩增这种EGFP基因。与来自含有经突变的EGFP ORF的报告载体的一种PCR产物相反，来自表达EGFP 克隆的24个PCR产物中没有一种可以用SpeI限制性内切酶进行酶解，这提示在经突变的 EGFP ORF的密码子107中TAG终止突变的回复突变(数据未显示)。通过DNA测序已经分析了这些PCR产物中的10个，证实了所有这10个克隆含有 引入到该EGFP ORF中的RGYW基序中G核苷酸的一个G-> C突变，正如之前在文献(Bachl & Olsson, 1999)中所述。这证明依赖于顺式调控基因元件(像KiE和3’ κ E元件)的存在、并且依赖 于AID表达，可以将升高水平的体细胞突变以及由此的诱变靶向到一种活性启动子下游的 DNA区，并且因此在所披露的逆转录病毒表达构建体的背景中靶向到人类抗体链的Vh编码 区。就在这些κ iE和3’ κ E构建体中评估AID依赖的体细胞突变的水平而言，所估计 的突变率是在大约3X 10_5次突变/bp/代的范围内。该值仍然较低，因为在体内已经报道 的体细胞超突变率可以达到高达10_4次或甚至10_3次/bp/代的比例。尽管如此，所检测的 突变率仍然显著地高于在脊椎动物细胞中报道的背景突变率(该突变率估计是在10_8次突 变/bp/代的范围内)。因此，得出结论高体细胞突变率以一种增强子和AID依赖的方式 特异性地靶向所披露的逆转录病毒构建体中一种活化启动子的下游区域，从而允许在基于 通过AID表达介导的体细胞超突变的体内诱变条件下使用逆转录细胞展示。实例4通过使用能够进行V(D)J重组逆转录病毒表达载体来证明人类抗体编码区的原 位产生a)在IgH链表达之前对要求V(D) J重组的一种逆转录病毒人类重链(IgH)表达载 体进行克隆。作为来自在实例1中所说明的cDNA表达载体的逆转录病毒表达重链(H)和轻链 (L)的一种替代性方法，已经构建了一种不同的逆转录病毒IgH链载体类别，其中通过将V、 D和J片段分成“准胚系”构型来对这种可变的编码区进行编码，该构型仍然需要在表达之 前通过V(D) J重组过程进行装配。V(D) J重组介导了位点特异的但稍微不精确的V、D和J 基因片段的装配，这样当原位转导进入V(D)J重组活性细胞(像例如，前B细胞)时可以从 一种单一的表达构建体中产生多样的V编码区。为此，已经逐个地从衍生自去除B细胞的人类外周血单核细胞(PBMC)的基因组 DNA将胚系Vh3. 30、DhL 26和JH3基因片段进行PCR克隆。选定用于胚系V、D禾Π J基因片 段的扩增的PCR引物，这样使得将包括保守的重组信号序列(RSSs)、以及额外的干扰性DNA 序列的侧翼DNA序列包含在内，允许适当地装配V、D和J基因片段。所有PCR扩增子是使 用校正热稳定的DNA聚合酶PfX(Invitrogen，Carlsbad, CA)而产生的，并且最初被亚克隆到一种pSC-BPCR克隆载体中(Stratagene，La Jolla, CA)，在这两种情况中均是根据制造 商的说明书进行的。通过DNA测序证实了亚克隆到pSC-B中的PCR片段，并且只有一些片 段才可以仅用于进一步克隆，条件是该DNA序列已经是序列证实的。
为了对一个胚系的人类Vh3. 30片段进行PCR扩增，使用了 DNA引物Seq_ID19和 Seq-ID20,它们含有BamHI和NheI限制性酶切位点(如所指示)，允许进一步亚克隆这种 PCR克隆的DNA片段。Seq-ID19 5' -ATTT ggatcc CACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCG-3‘BamHISeq-ID20 5 ‘ -CCC GCTAGC TCCTGACAGGAAACAGCCTCCATCTGCACCT-3 ‘NheI通过这种方法，获得了具有侧翼DNA的、含有胚系VH3. 30基因片段的623bp长度
的一种PCR扩增子(Seq_ID21)，见图11a。Seq-ID21 5’ attt GGATCC CACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGATTCATGGAGAAATAGAGAGACTGAGTGTGAGTGAACATGAGTGAGAAAAACTGGATTTGTGTGGCATTTTCTGATAACGGTGTCCTTCTGTTTGCAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACA
CGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACAGTGAGGGGAAGTCATTGTGCGCCCAGACACAAACCTCCCTGCAGGAACGCTGGGGGGAAATCAGCGGCAGGGGGCGCTCAGGAGCCACTGATCAGAGTCAGCCCTGGAGGCAGGTGCAGATGGAGGCTGTTTCCTGTCAGGA GCTAGC ggg3，下一步，使用引物对Seq_ID22和Seq_ID23 (对应地含有限制性内切酶NheI和 XhoI位点)实现了含有人类DHl. 26片段、具有侧翼基因组DNA的一种人类基因组DNA片段 的PCR扩增(图11a)。Seq-ID22 5' -GGAgctagc GGGCTGCCAGTCCTCACCCCACACCTAAGGT-3‘NheISeq-ID23 5' -GGG ctcgag TCCTCACCATCCAATGGGGACACTGTGGAGC-3 ‘XhoI通过这种方法，获得了含有胚系DHl. 26基因片段、具有侧翼DNA的336bp长度的
一种 PCR 扩增子(Seq_ID24)。Seq-ID24 5 ’ gga GCTAGC GGGCTGCCAGTCCTCACCCCACACCTAAGGTGAGCCACAGCCGCCAGAGCCTCCACAGGAGACCCCACCCAGCAGCCCAGCCCCTACCCAGGAGGCCCCAGAGCTCAGGGCGCCTGGGTGGATTCTGAACAGCCCCGA
GTCACGGTGGGTATAGTGGGAGCTACTACCACTGTGAGAAAAGCTATGTCCAAAACTGTCTCCCGGCCACTGCTGGAGGCCCAGCCAGAGAAGGGACCAGCCGCCCGAACATACGACCTTCCCAGACCTCATGACCCCCAGCACTTGGAGCTCCACAGTGTCCCCATTGGATGGTGAGGA CTCGAG ccc33 ’最后，使用引物对Seq_ID25和Seq_ID26 (对应地含有限制性内切酶SalI和XbaI/ HindIII位点)实现了含有人类JH3片段、具有侧翼基因组DNA的一种人类基因组DNA片段 的PCR扩增，正如所指示(图Ila)。 Seq-ID25 5' -GG GTCGAC CCCTGCCTGGGTCTCAGCCCGGGGGTCTGTG-3‘SalISeq-ID26 5 ‘ -TAT TCTAGA ATAT AAGCTT. GCCATCTTACCTGAAGAGACGGTGACC-3 ‘XbaI HindIII通过这种方法，获得了含有胚系JH3基因片段、具有侧翼DNA的239bp长度的一种 PCR 扩增子(Seq_ID27)。Seq-ID27 5 ’ gga GTCGAC CCCTGCCTGGGTCTCAGCCCGGGGGTCTGTGTGGCTGGGGACAGGGACGCCGGCTGCCTCTGCTCTGTGCTTGGGCCATGTGACCCATTCGAGTGTCCTGCACGGGCACAGGTTTGTGTCTGGGCAGGAACAGGGACTGTGTCCCTGTGTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCG
TCTCTTCAGGTAAGATGGCT AAGCTT atat TCTAGA tata3 ’已经将这三个DNA片段Seq_ID21、Seq_ID24和Seq_ID27顺序地克隆到一种穿梭 载体中，该穿梭载体含有独特的BamHI、NheI、XhoI和XbaI限制性酶切位点，这样使得含有 基因片段VH3. 30、DHl. 26和JH3的盒可以经由适合的限制性内切酶位点、通过这些DNA片 段的顺序连接进行装配。将Seq_ID21作为一种BamHI-NheI片段连接到BamHI-NheI线性 化穿梭载体中，然后将NheI-XhoI酶解的片段Seq_ID24连接到NheI-XhoI线性化穿梭载体 中，该穿梭载体已经含有Seq_ID21，并且最后，将SalI-XbaI酶解的片段Seq_ID27连接到 XhoI-XbaI线性化的、已经含有克隆的Seq_ID21和Seq_ID24的穿梭载体中，从而在一种穿 梭载体中产生一种人造的VH3. 30-DH1. 26-JH3盒(图Ila)。然后，将含有该人工装配的VH3. 30、DHl. 26以及JH3基因片段的整个“准胚系” 盒克隆到逆转录病毒载体MigRl (Pear et al. 1998)中，该载体MigRl已经含有已经克 隆到MigRl载体的独特的BglII和HpaI位点中的人类μ H链(Seq_ID28，见以下)编码 区(构建体MigRl-muH，图lib)。在MigRl_muH中将VH编码区与恒定的μ H链编码区分 开的一种独特的XhoI位点(在Seq_ID28的中间部分以黑体印刷突出显示)可以用于将 VH3. 30-DH1. 26-JH3盒框内连接到恒定的μ H链编码区上，而不影响在过渡形式JH到这种 恒定的编码区的氨基酸序列。Seq-ID28 5’ AGATCT ACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCGATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCCGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCT
GGAATGGGTCTCAGCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCC
TGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGATACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGT CTCGAG CGCTAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCTGCCTCGCACAGGACTTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCTGGAAATACAAGAACAACTCTGACATCAGCAGCACCCGGGGCTTCCCATCAGTCCTGAGAGGGGGCAAGTACGCAGCCACCTCACAGGTGCTGCTGCCTTCCAAGGACGTCATGCAGGGCACAGACGAACACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACCCCAACGGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCCGAGCTGCCTCCCAAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGGCTTCTTCGGCAACCCCCGCAAGTCCAAGCTCATCTGCCAGGCCACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGCGCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGGACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAGAGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAGAGCGACTGGCTCAGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAATGCGTCCTCCATGTGTGTCCCCGATCAAGACACAGCCATCCGGGTCTTCGCCATCCCCCCATCCTTTGCCAGCATCTTCCTCACCAAGTCCACCAAGTTGACCTGCCTGGTCACAGACCTGACCACCTATGACAGCGTGACCATCTCCTGGACCCGCCAGAATGGCGAAGCTGTGAAAACCCACACCAACATCTCCGAGAGCCACCCCAATGCCACTTTCAGCGCCGTGGGTGAGGCCAGCATCTGCGAGGATGACTGGAATTCCGGGGAGAGGTTCACGTGCACCGTGACCCACACAGACCTGCCCTCGCCACTGAAGCAGACCATCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACAGGCCCGATGTCTACTTGCTGCCACCAGCCCGGGAGCAGCTGAACCTGCGGGAGTCGGCCACCATCACGTGCCTGGTGACGGGCTTCTCTCCCGCGGACGTCTTCGTGCAGTGGATGCAGAGGGGGCAGCCCTTGTCCCCGGAGAAGTATGTGACCAGCGCCCCAATGCCTGAGCCCCAGGCCCCAGGCCGGTACTTCGCCCACAGCATCCTGACCGTGTCCGAAGAGGAATGGAACACGGGGGAGACCTACACCTGCGTGGTGGCCCATGAGGCCCTGCCCAACAGGGTCACCGAGAGGACCGTGGACAAGTCCACCGAGGGGGAGGTGAGCGCCGACGAGGAGGGCTTTGAGAACCTGTGGGCCACCGCCTCCACCTTCATCGTCCTCTT
CCTCCTGAGCCTCTTCTACAGTACCACCGTCACCTTGTTCAAGGTGAAATGAGCGGCCGCTTTACGC GTTAAC 3，在该插入片段的5’和3’末端的BglII-HpaI限制性酶切位点也对应地用黑体印 刷突出显示并且加下划线，并且指示转化为MigRl载体主链(Pear et al. 1998)。为了替代在MigRl逆转录病毒主链中含有的Seq_ID28中的V-编码区(该逆转录 病毒主链具有VH3. 30-DH1. 26-JH3 “准胚系”盒)，这种大约1. Ikb的VH3. 30-DH1. 26-JH3 片段需要使用一种含有BglII正向引物以及一种含有XhoI反向引物(对应地为Seq_ID29和Seq_ID30)通过PCR进行再次扩增(图Ila)。
Seq-ID29 5' -G AGATCT CACCATGGAGTTTG-3Seq-ID30
BglII
■ATCTTACCT CTCGAG ACGGTGA-3 XhoI将得到的大约1. Ikb的PCR片段用BglII和XhoI进行酶解，并且被连接到含有 BglII-XhoI线性化的μ H链的MigRl载体中，由此得到能够进行V-D-J重组的逆转录病毒 表达载体 pVDJ-muH-MigRl (图 lib)。b)在转导到前B细胞中时证明在产生多样序列的逆转录病毒V-D-J载体中发生的 真正的V(D)J重组。作为一种概念性证据，为了证明适合的V(D) J重组可以发生在含有处于“准胚系” 构型的V、D和J基因片段的逆转录病毒载体中，将载体pVDJ-muH-MigRl连同一种逆转录病 毒IgL链表达载体共转导到A-MuLV-转化的前B细胞系230-238中，如实例Ib中所说明。 只有若一种V(D) J重组事件发生在pVDJ-muH-MigRl构建体上从而导致这些V、D和J基因 片段的框内重排时，才可以在这些双转导的细胞的细胞表面上表达一种全长的人类IgM抗 体。通过IRES偶联的EGFP标志物基因的共表达，可以监测pVDJ-muH-MigRl载体的转导效 率。正如在图12(a)中可以看到，用至少pVDJ-muH-MigRl构建体(转导效率是44. 7% )转 导的非常少的0. 04%的细胞群在细胞表面上展示可检出的IgM表达，正如通过用一种抗κ 轻链抗体的FACS染色所测量。值得注意的是，实际上在不用pVDJ-muH-MigRl构建体转导 的细胞群中没有检测出表达IgM的细胞(图12 (a)中下右四分之一图)，这证明了这种染色 的特异性。可以在图12(a)的上右四分之一图中检出的这些稀少的表达IgM的细胞已经使用 一台FACS-Aria高速细胞分选仪(BD，Franklin Lakes, NJ)、通过制备型细胞分选得到分 选，并且已经通过组织培养扩展8天，以便将这些细胞扩增用于这些逆转录病毒整合体的 表征。用于EGFP表达(指示整合的pVDJ-muH-MigRl构建体)以及扩展8天之后表面IgM 的FACS图显示出可能的极少的克隆扩展的细胞，这些细胞在细胞表面上展示出IgM并且含 有pVDJ-muH-MigRl构建体(正如通过绿色荧光所测量，图12 (b))。已经分选了图12 (b)的 FACS图的上右区中能够区分的细胞群，并且已经从汇集的细胞群中制备了基因组DNA。使用与VH上游和JH区下游的pVDJ-muH-MigRl构建体相结合的引物、通过诊断型 PCR来分析基因组DNA。正如所预期，这些诊断型PCR产生了两个具有几乎相同强度的分离 的条带(指示非重排的V、D和J基因片段(大约1. 2kb片段))、以及一种更小的大约0. 5kb 片段(指示V (D) J重组的基因片段)(数据未显示)。对较大的PCR条带进行测序证实这 种PCR扩增子表示仍然处于“准胚系”构型的未重排的V-D-J盒。在IgM阳性细胞中这些 未重排的构建体仍然是可检出的，条件是这些细胞用超过一种构建体进行转导，其中不是 所有的这些构建体可以接近用于V(D)J重组。当对这种PCR产物进行测序时，这种较小的 PCR扩增子不产生一种独特的序列、并且需要将其亚克隆到pSC-BPCR克隆载体中用于单独 的PCR片段的PCR序列分析。在所分析的6种质粒中，2种含有完全相同的真正的V(D) J重组序列，它们显示出 由V(D) J重组进行位点定向连接的V、D和J基因片段的所有特征性特点，包括在编码区的
48核苷酸缺失以及由前体淋巴细胞特异性酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的非模板序 列(N-区)的加入(图12(b))。由克隆225的序列所表示的这两种回收的序列(图12b)已经是对于含有逆转录 病毒表达载体的V、D和J基因片段能够在前B淋巴细胞中经受V(D) J重组的坚实证据，因 为对于显示出一种真正的V(D)J重组事件的所有信号的这些序列怎样可以通过其他方式 而产生还没有其他解释，即使在这一点上的效率似乎是低的。得出结论当在前体淋巴细胞 的逆转录病毒转导的背景中V⑶J重组的效率增加时，可以从有限量的含有处于“准胚系” 构型的V、D和J基因片段的逆转录病毒载体中产生多样的抗体序列集合。实锣Ij 5鉴定并且表征用于逆转录细胞展示的适当的选择鼠B细胞系a)在B细胞系中内源性抗体的表达可能潜在地阻碍了它们在逆转录细胞展示中 作为选择细胞(selector cell)的使用，因为内源性小鼠免疫球蛋白链与重组的完全抗 体链的配对也许会负面地影响它们的细胞表面展示，或可能导致具有不可定义的结合特 异性的混合型人-鼠免疫球蛋白的表达。因此，使用与FITC相偶联的抗鼠IgM重链抗体 (Southern Biotech)，对在文献中所说明的一组Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)转化的鼠 前B细胞系组检查内源性IgM重链(μ H)的细胞内表达。这些细胞包括谱系40Ε1、230-238、 204-1-8 (Alt et al.，1981)、18-81、18-81 亚克隆 8-11 (Rosenberg & Baltimore 1978)、来 自RAG-2缺陷小鼠的63-12(在此被称为FA-12)细胞(Sinkai et al.，1992)、以及来自三 个替代轻链敲除的小鼠的1624-5、1624-6 (Shimizu et al.，2002)。遵循制造商的说明书、 使用Fix/Perm-试剂盒(Caltech)将这些细胞进行透化处理。如在图14中所描绘，细胞系 FA-12、40E1，以及18-81亚克隆8_11、1624-5以及1624-6，显示对于细胞内IgM染色的最小 信号或没有信号，将它们称作用于逆转录细胞展示的适合的选择细胞。b)因为逆转录细胞展示是基于逆转录病毒载体介导的基因转移，使用含有一种绿 色荧光蛋白(GFP)标志物基因(图13)的亲嗜性MLV衍生的载体颗粒进一步对这组A-MuLV 转化的前B细胞系检查了它们对逆转录病毒转导的敏感性。使用一种载体制备物、以0. 5 的MOI转导了 1 X IO5个细胞，该制剂已经包装着报道基因GFP、包括通过有限稀释之前滴定 18-81亚克隆8-11前B细胞的转移载体LEGFP-Nl (Clontech)。如以下所说明产生了载体 颗粒。通过旋转感染进行转导，实质上使用离心、在1. 5ml-Eppendorf管中以3. 300rpm并 且30°C下持续3小时。转导后两天，通过确定表达GFP的细胞的频率(通过FACS分析)来 分析基因转移。未处理的、天然靶细胞充当阴性对照物。如在图13中所展示，只有初始的 18-81细胞显示出非常低的允许MLV载体转导(< 10% )。所有其他细胞系显示出小于或 等于40%的基因转移效率。值得注意的是，在本实验中使用FA-12、40E1以及1624-5细胞 基因转移效率是最高的，并且达到大于50%。合起来，FA12、40E1以及1624-5细胞被发现为最适合用于逆转录细胞展示，考虑 到两个指标a)低内源性鼠免疫球蛋白表达或没有该表达，以及b)对逆转录病毒转导的敏 感性。然而，因为所希望的是表达由重组的重链和轻链组成的免疫球蛋白，B细胞是优选的， 这些细胞也缺乏替代轻链组分(可以从入5，或￥ 1~动1，或￥ 1~动2基因表达)，因为那些可 以竞争在野生型前B细胞中与重组的轻链相关联的重链的。因此，预期由替代轻链三元敲 除小鼠获得的1624-5细胞是用于进一步的逆转录细胞展示技术的最适合的细胞。然而应
49当理解，任何其他细胞系(包括在此分析的那些额外的细胞系，这些细胞系满足没有/低内 源性免疫球蛋白表达、以及逆转录病毒转导能力的指标)可以用于实现在此披露的方法。实例6产生克隆地并且稳定地表达的完全人类抗体文库的选择细胞为了产生已经包装着转移载体(编码了完全人类抗体链及其文库)的载体颗粒、 以及随后将它们用于鼠B细胞系的转导，通过以下方法进行感染实验。转染前16至24小 时，将人胚肾 293T-HEK 细胞在 IOml 的 Dulbeccos ModifiedEagle Medium(DMEM)以 2X106 个进行铺板，每个IOcm组织培养皿中添加10%胎牛血清(FCS)以及L-谷氨酰胺。制备 了 5yg 的对应的转移载体 IgL(245)-LIB-IRES-YFP 和 IgH(650)-LIB-IRES-GFP(编码 了重链或轻链的文库，这些重链或轻链通过一种IRES与GFP或YFP表达相连接，图15)、 3 μ g的pVPack-GP (—种具有MLV的gag以及pol基因的表达构建体)以及2. 5 μ g的 ρVPack-Eco ( 一种包括单嗜性MLV的env基因表达构建体，均来自STRATAGENE)的混合物， 并且用30 μ 1的在Iml无血清的DMEM中Fugene (Roche)进行孵育，并且在室温下静置15 至30分钟。然后，将这种Fugene/DNA混合物轻柔地加入到接种于IOcm培养皿的293T-HEK 细胞中。将编码重链和轻链的转移载体染到分开的瞬间包装细胞中。转染后48小时，从瞬间包装细胞收集含有载体颗粒的上清液，并且将其在 3，OOOrpm下离心以去除污染的细胞。将1. 5 X IO6个1624-5鼠B细胞悬浮在Iml的培养基 中，该培养基添加了不同数量的载体颗粒(1 1 ；1 5,1 20 ；1 50；1 100 ；1 200 稀释)，这些载体颗粒已经包装着抗体的重链或轻链的编码区。通过在1. 5ml-Eppendorf管 中以3. 300rpm以及30°C下离心3小时来进行转导。将未使用的上清液贮存在-80°C下用 于随后时间点的使用。为了确保单拷贝的转移载体已经整合到该宿主细胞基因组中，使用 FACS富集了在感染之后4天显示基因转移效率低于10% (通过GFP或YFP的表达所检测) 的细胞(图16)。将这些细胞扩展6天，并且使其经受一个第二转导操作，该操作采用之前 冷冻的载体颗粒，这些载体颗粒已经包装着如以上说明以1 5稀释的抗体的轻链编码区。 在此，使用转导轻链-IRES-YFP文库的载体颗粒来感染选择用于重链表达的GFP阳性细胞， 并且反之亦然(图15&16)。感染之后4天，使用FACS来富集表达GFP和YFP的成功转导的 细胞。在第二次转导之后，这些细胞中有大约20%显示GFP和YFP表达。为了确保每个细 胞只有单一载体的整合发生，富集了这些群落中的大约三分之一，仅仅显示了在第二轮中 所转导的报道基因的低表达或中等表达(大约8%，见图16)。实例7通过逆转录细胞展示来检测并且富集表达抗原反应性人类抗体的细胞a)作为概念性证据实验的逆转录细胞展示的一种准备，首先确定了对于在选择细 胞上逆转录病毒表达的IL-15结合抗体的最佳染色和检测条件。将共表达一种人类IgH和 IgL链文库的1624-5A-MuLV转化的前B细胞以2 1的比例与1624_5A_MuLV转化的前B细 胞相混合，这些细胞表达了逆转录病毒表达载体，这些表达载体在该细胞表面上编码了一 种人类抗IL-15抗体。将这些混合的细胞样品用不同浓度的重组人类IL-15 (0. 1至2. 5 μ g/ ml)，以及不同浓度的多克隆的、生物素酰化的抗人类IL-15抗体(1.0以及3.0yg/ml)进 行孵育(正如所指出)，该抗体最终用为抗生蛋白链菌素藻红蛋白(strep-PE)显示。为了 将展示抗体的细胞与表达非免疫球蛋白的细胞相区别，用一种抗人类IgK L-APC抗体对多个样品进行复染。如在图17的两个上右侧FACS图片中可见，使用了 0. 1和0. 5μ g/ml的 重组IL-15作为一种第一试剂、以及3. 0 μ g/ml的生物素酰化的抗人类-IL-15抗体作为一 种第二染色试剂的组合最有效地检测出IL-15反应细胞(20. 和20. 4% )。b)下一步，进行一项概念性证据实验，其中将一种对人类IL-15特异的参比抗体 刺入到表达一种多样的人类抗体文库的细胞库中，在刺入时这些插入的抗原反应性细胞已 经通过FACS进行了分析。在准备本实验时，将逆转录病毒性地表达于1624-5细胞中的抗体 文库(参见实例6)对表面Ig表达以及IL-15结合(NC)进行染色，同时使用了一种表达对 人类IL-15抗原特异的参比抗体的1624-5细胞系(PC)。对这些NC以及PC细胞系的FACS 分析示于图18，并且证明了在这些PC细胞的表面上所展示的抗IL-15参比抗体的特异性 IL-15染色。为了分析这种表达抗IL-15Ab的参比细胞系是否仍可以通过FACS进行定量检 测(条件是将这些PC细胞插入到表达一个随机的人类抗体集合的NC细胞系中)，使用以 上确定的最佳IL-15染色条件、通过FACS来对该NC文库中不同稀释的PC细胞分析特异性 IL-15结合。阴性对照细胞的FACS分析显示只有一个群落显示IL-15结合活性。相比之 下，证明了超过60%的阳性对照群落与IL-15相结合。当以10%、12. 5%、25%、37. 5%和 50%的比例将以上两个群落向混合时，观察到混合到该抗体文库细胞库中的阳性对照细胞 的百分数与显示结合到IL-15上的细胞的部分之间的相关性。因此，得出结论IL-15反应 细胞在与表达其他非特异性抗体的细胞的混合物中可以通过FACS染色进行定量地检测。c)下一步，进行了一项概念性证据实验，其中通过逆转录细胞展示富集了稀少的 IL-15反应细胞。为此，通过逆转录病毒转导一种IL-15IgH链(与GFP相偶联)，并且共转 导一种复杂集合(复杂度大约7X IO4)的人类IgK L链(与YFP相偶联)，产生了一种在 1624-5前B细胞中表达的高度多样的人类抗体集合。因此，通过对一种来自人类抗IL-15 特异性抗体的单IgH链改组一个多样的人类IgK L链集合而产生了一种逆转录细胞展示抗 体文库。使用如之前所确定的最佳条件针对IL-15反应性来对这些细胞染色。通过三轮连 续的高速FACS细胞分选、之后跟随细胞培养扩展将IL-15反应细胞富集。三轮逆转录细胞 展示富集之后，可以得到一个细胞群，该细胞群表达人类抗体并且基本上对来自一个初始 细胞群的抗原IL-15定量地染色的细胞群，在这种初始细胞群中几乎不能检测出IL-15反 应细胞。(图19)这个实验证明反复多轮的逆转录细胞展示富集可以有效地使于使IL-15 结合细胞富集。d)证实从一种3XIL-15富集的细胞库建立的单独的细胞克隆的IL-15结合特异 性(参见之前的实例)。然后，在这个经历了三次IL-15特异性逆转录细胞展示富集的细胞 库中，已经通过单细胞分选建立了 25个单独的细胞克隆。使用之前最佳的染色条件、通过 IL-15染色已经对这些25个细胞克隆表征了 IL-15特异性(参见实例7a)。作为这种IL-15 染色的特异性的一种对照物，还将所有的克隆与所有的染色试剂(除IL-15抗原之外)进 行孵育。这25个单细胞克隆中大多数展示了一种高度特异的IL-15染色模式，当IL-15抗 原从该染色反应去除后该模式消失。具有4种选定的单独的细胞克隆的代表性IL-15特异 性染色示于图19中。这些克隆的染色是从一种3XIL-15富集抗原的细胞群建立的全部25 个细胞克隆的代表(以字母顺序A至Y命名)，所有这些克隆对IL-15抗原结合检测为阳 性。在图19中提供了针对这些染色的特异性的阴性对照和阳性对照，正如所指示。实例8
51
链改组或指导进化的方法通过高速细胞分选、对编码了来自抗原选择细胞的区 域的可变区进行克隆并且证实抗原特异性来检测并且反复富集表达抗原特异性人类抗体 的细胞。如以上所说明(实例6)，产生一种细胞文库，该文库表达了复杂度大约为 1.2X105的人类IgK L链与定向对抗靶抗原人类IL-I β的参比抗体SK48-E26的重链 (Young et al. ,WO 95/07997A1)相组合的文库。含有这些链的逆转录病毒载体骨架更详细 地描绘于图4c和11中(还参见实例4)。为此，用编码了 SK48-E26IgH链、含有颗粒的转移 载体对3X106个1624-5A-MuLV转化的1624-5前B细胞进行转导，其中MOI小于0. 1。转 导一天之后，使用来自BD的FACSAria、通过标准的高速细胞分选将GFP阳性细胞富集。将 分选出的细胞在加湿的培养箱中通过组织培养进行扩展，持续五天。扩展之后，如以上所说 明(实例5)通过标准的旋转感染、用已经包装着IgK L链文库(Μ0Ι为1. 5)的颗粒对该细 胞群进行转导，并且允许这些细胞通过组织培养从转导恢复两天。两天的恢复和扩展期之 后，使用来自BD的FACSAria使用制备型细胞分选来富集5X IO5个共表达GFP和YFP的、 并且因此含有至少一个重链和一个轻链的构建体的细胞。将现在富集的用于IgH和IgL链 构建体共表达的细胞群通过组织培养再扩展四天。这次最终扩展之后，用2 μ g/ml、体积为 100 μ 1的重组人类IL-I β (R&DSystems)在冰上对表达IgH/IgL链文库的2 X IO6个细胞的 等分部分染色30分钟，之后跟随使用添加胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的 两个洗涤步骤。在用定向对抗IL-I β、并且与生物素相偶联的多克隆抗体孵育之后，将细 胞再洗涤两次，并且随后用抗生蛋白链菌素-APC染色用于检测结合抗原的细胞、以及它们 随后的富集，这是使用流式细胞仪来进行的。通过FACS进行第一轮细胞分选之后，将这些 细胞扩展五天，并且进行另一轮的抗IL-I β染色以及染色呈阳性的细胞的富集，正如以上 所说明。将这种选择重复三次(图21)。如以上所说明，针对IL-I β结合来对在三轮逆转 录细胞展示富集之后得到的细胞群进行再次染色，但这次的反应性细胞没有富集为如之前 所述的大群落，而是使用来自BD的FACSAria、借助于单细胞分选将单独的细胞克隆分选到 96孔板中。在七天的培养和扩展之后，使用所说明的科学试验方案、并且此外使用所有二级 试剂(除抗原IL-I β )作为一种阴性对照物，再次对单独的细胞克隆分析IL-I β抗原特异 性。正如所预期并且使用流式细胞仪所证实的，一些克隆显示与该靶抗原特异性结合，如在 该抗原的存在下(而不在其缺失时)由一个特异性的FACS信号所揭示(排除了这些克隆 与这些第二种检测试剂中的任何一种相结合的背景结合)。然而，一些克隆显示出一种染色 信号，不论以下抗原存在与否，该抗原指示了这些克隆与这些用于检测IL-I β反应性的二 级试剂中的任何一种进行非特异性地结合。总之，24个细胞克隆的基因组DNA被分离，并且 充当一种模板用于使用寡核苷酸Seq_ID31和Seq_ID32的、标准的基因组PCR，这些寡核苷 酸对应地与在该逆转录病毒轻链文库中编码的人类轻链的可变区的上游和下游进行特异 性地结合。Seq-ID31 5' -CCTTGAACCTCCTCGTTCGACCC-3‘Seq-ID32 5' -AGGCACAACAGAGGCAGTTCCAG-3‘从每个已分析的细胞克隆中获得了预期大小的PCR扩增子，并且将这些PCR扩增 子直接进行DNA测序分析。所分析的这24个克隆中有12个显示具有一个完全相同的、但 却新颖的Ig κ L链(被命名为LCB24)，以及正如所预期还含有SK48-E26的IgH链，如分开所确定。如所预期，表达LCB24IgL链与SK48_E26IgH链的组合的所有12个克隆都展示出 特异性的IL-I β信号，这是使用流式细胞仪进行的，如以上所提及。一种含有所扩增的新颖的LCB24IgK L链的选出的PCR扩增子被限制性内切酶 HindIII和EC047III酶解，侧翼为可变编码区(图4c)，并且将该片段克隆到具有适合的限 制性酶切位点的一种逆转录病毒Ig κ L链表达载体中，允许将LCB24&编码区与恒定的人 类κ轻链编码区进行框内融合。因此，所得到的载体编码了一种新颖的、完全的人类IgK L 链。将针对LCB24Ig κ L链的再次克隆的、并且序列证实的逆转录病毒表达载体与 IL-I β参比抗体SK48-E26的SK48E26IgH链一起转导到1624-5细胞中。在通过组织培养扩 展两天之后，使用来自BD的FACSAria、通过高速细胞分选将GFP+/YFP+细胞富集。如以所 说明，首先对得到的、表达Ig的细胞测试了它们结合IL-I β的能力。正如所预期，由LCB2 连同SK48-E26的重链的展示所介导的它们的反应性得到了证实(图22)。为了排除这种新 颖的抗体总体上是与其他抗原或蛋白交叉反应的，对表达LCB24IgL/SK48-E26IgH组合的 细胞测定了 IL-15反应性，如之前所说明。如在图23中所描绘，对于这种新颖的IgLLCB24/ HC SK48-E26抗体不能检测出对IL-15的反应性，这指示了这种新颖抗体的靶抗原特异性。 另外的对照物包括一种细胞系，该细胞系表达了一种抗IL-15特异性参比抗体(作为阳性 对照物)、以及初始的SK48-E26IL-li3抗体。尽管这种表达抗IL-15抗体的细胞正如所预 期显示出对IL-15的特异性染色，对于SK48-E26IL-1 β抗体或对于这些细胞没有检测出反 应性(图23)。总之，在一种筛选实验中鉴定了一种新颖的轻链介导的抗原特异性反应性，该实 验采用了针对一种IL-I β特异性参考抗体SK48-E26的重链进行改组的一个轻链文库。实例9对改组的IgH和IgL链文库进行逆转录细胞展示筛选。通过高速细胞分选、对编 码了来自抗原选择细胞的区域的可变区进行筛选并且证实抗原特异性来检测并且反复富 集表达抗原特异性人类抗体的细胞。如以上所说明(实例6)，产生种个细胞文库，该文库使用大约为0. 1的Μ0Ι、表达 了一种重链文库，这些重链具有大约6. 5Χ105(与GFP相偶联)的复杂度。含有这些链的逆 转录病毒载体骨架更详细地描绘于图4c以及11中(还参见实例4)。为此，使用以上提及 的、编码了含有颗粒的转移载体的IgH链文库对3 X IO6个1624-5A-MuLV转化的1624-5前 B细胞进行转导，其中MOI小于0. 1。转导后2天，使用来自BD的FACSAria、通过标准的高 速细胞分选将GFP阳性细胞富集。在对GFP+细胞进行分选之后，通过组织培养将这些细胞 再扩展两天。扩展之后，使用已经包装着一个轻链文库的颗粒对GFP+细胞群进行转导，该 轻链文库由245个完全序列组成，这些序列的特征是MOI大于1的轻链，如以上所说明。转 导之后两天，通过高速细胞分选将GFP+/YFP+双转导的细胞富集，并且通过组织培养将该 细胞群(现在在这些细胞的大多数中含有IgH和IgL这两种链文库)再扩展三天。在这之 后，用一种抗原混合物(a cocktail of antigens)(包括以上说明的inter alia SAV(抗 生蛋白链菌素)-APC-Cy7(参见实例8))对2. 5 X IO5个细胞的等分部分进行染色，并且进 行富集用于使用流式细胞仪来检测该靶抗原的反应性。平行地，使用抗IgLK特异性抗体将表达抗体IgH/IgL文库的细胞群进行染色。发现在这些细胞中有大约75%的细胞在该 细胞表面上展示人类抗体(数据未显示)。使用来自BD的FACSAria、通过高速细胞分选已 经分选出抗原反应的细胞，并且通过组织培养将富集的细胞扩展七天。如以上所说明，将同 样的染色以及细胞富集操作重复两次以上。在三轮逆转录细胞展示选择之后，对得到的细 胞群进行再次染色以便评估靶抗原SAV-APC-Cy7的结合、并且使用流式细胞仪进行分析。 如在图24中所描绘，所获得的大群落显示出与SAV-APC-Cy7相结合，这指示了成功地选择 出具有针对SAV-APC-Cy7的抗原特异性的抗体。为了评估对抗靶抗原SAV_APC_Cy7的反 应性的特异性，表达这三次富集的文库的细胞还使用抗原SAV-APC以及SAV-PerCP-Cy5. 5 进行染色(图25)。与未经转导的细胞以及充当阴性对照物的、表达未经选择的文库的细 胞相类似，这些抗原没有被这三次SAV-APC-Cy7富集的细胞结合。然而，后者的细胞再次 显示出对SAV-APC-Cy7的强反应性，这指示这些选择的细胞群的抗原特异性是定向对抗 SAV-APC-Cy7串联染料的Cy7荧光色素的。这3次富集的细胞群的基因组DNA被分离，并且充当一种模板用于使用寡核苷酸 Seq-ID31 (见以上)以及Seq_ID33的、标准的基因组PCR，这些寡核苷酸与在这些逆转录病 毒文库中编码的人类轻链和重链的编码区的上游和下游特异性地结合。Seq-ID33 5' -CGGTTCGGGGAAGTAGTCCTT GAC-3‘)获得了预期大小的重链和轻链的PCR扩增子，并且将它们分开地亚克隆到一种克 隆载体PSC-B(Stratagene)的、标准的PCR片段中，正如制造商所推荐。将具有这些已克 隆的重链和轻链区的PSC-B质粒从10个细菌克隆中分离出，这10个细菌克隆每个均来自 IgH PCR片段的亚克隆以及IgL PCR片段的亚克隆，它们都经受了 DNA测序分析。DNA测序 显示两种不同的IgH链序列(被命名为HC49、HC58)，以及两种不同的IgL链序列(被命名 为 LC4 和 LC10)。从通过HindIII以及Ec047III酶解得到的序列证实的克隆分离出含有Vh以及\ 编码区的DNA片段，因为这些限制性酶切位点在HC49、HC58、LC4以及LC 10的对应的Vh 以及Vl区的可变区(见图4c)的侧翼。将分离的HC49、HC58、LC4以及LClO的Vh以及\ 区克隆到一种逆转录病毒受体载体中，该逆转录病毒受体载体对应地具有一种人类IgK IH 链的恒定区(表达与GFP相偶联的IRES)以及一种人类IgK L链(表达与YFP相偶联的 IRES)，如以上所说明。因此，产生了逆转录病毒表达载体构建体，该构建体编码了新颖的 HC49以及HC58IgH链、LC4以及LClOIgL链的全长人类IgH和IgL链。当这些载体共转导 到1624-5前B细胞中并且扩展8天时，如之前所述使用流式细胞仪将GFP+/YFP+细胞富集。 如所说明，首先对得到的细胞测试它们结合SAV-APC-Cy7的能力。如在图26中所描绘，表 达抗体HC49/LC4以及HC/LC10的细胞的反应性没有显示出对抗SAV_APC_Cy7的显著的结 合活性。相反，容易检测到由抗体HC58/LC4以及HC58/LC10介导的反应性。这为通过基于 多样的IgH链和IgL链集合的逆转录细胞展示成功地鉴定新颖的抗原特异性抗体、而不需 要来自一种已知抗原特异性的参比抗体的一种已知IgH或IgL链提供了一种概念性证据。参考文献Alt F, Rosenberg N, Lewis S, Thomas Ε, Baltimore D(1981) “Organization and reorganization of immunoglobulin genes in A-MULV-transformed cells rearrangement ofheavy but not light chain genes"Cell 27,381-390.
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权利要求
用于分离并且鉴定至少一种核苷酸序列的方法，该核苷酸序列编码了对于令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段，所述方法包括以下步骤(a)将至少一种逆转录病毒表达构建体转导到脊椎动物宿主细胞中，该表达构建体编码了抗体或其片段；(b)将所述抗体或其片段表达于所述脊椎动物宿主细胞中；(c)基于其与所述令人希望的抗原或配体相结合的能力将表达所述抗体或其片段的脊椎动物宿主细胞富集；并且(d)对来自这些经逆转录病毒转导的并且富集的脊椎动物宿主细胞的、编码了所述抗体或其片段的所述至少一种核苷酸序列进行分离并且鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)之前进行将所述富集的脊椎动物宿主细 胞在组织培养物中扩增。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)之后进行将所述富集的脊椎动物宿主细 胞在组织培养物中扩增，在这之后将如在权利要求1中所定义的步骤(c)重复至少一次。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中以等于或小于0.1的感染复数进 行这种逆转录病毒转导。
5.根据权利要求1至4中任何一项所述的方法，其中该抗体是全长抗体。
6.根据权利要求1至4中任何一项所述的方法，其中所述抗体的片段选自下组，其组成 为重链、轻链、Vh单域、Vl单域、scFv片段、Fab片段、以及F (ab，)2片段。
7.根据权利要求1至6中任何一项所述的方法，其中这些脊椎动物宿主细胞来源于一 组物种，该组物种由下列组成软骨鱼类、硬骨鱼类、两栖动物类、爬行动物类、鸟类、哺乳动 物类，这些哺乳动物包括猪、羊、牛、马、以及啮齿动物，这些啮齿动物包括小鼠、大鼠、兔以 及豚鼠。
8.根据权利要求7所述的方法，其中这些脊椎动物宿主细胞类来源于小鼠。
9.根据权利要求1至8中任何一项所述的方法，其中这些脊椎动物宿主细胞是淋巴细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中这些淋巴细胞是前体B淋巴细胞。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中这些淋巴细胞不能表达内源抗体多肽类和 /或至少一种替代轻链组分。
12.根据权利要求1至10中任何一项所述的方法，其中这些脊椎动物宿主细胞表达了 内源性Iga以及IgP分子、或异位地表达Iga以及IgP分子。
13.根据权利要求5所述的方法，其中该全长抗体选自下组，其组成为全人类抗体、人 源化的抗体、以及嵌合抗体。
14.根据权利要求1至13中任何一项所述的方法，其中该至少一种核苷酸序列是复数 种核苷酸序列，这些核苷酸序列编码了(i)抗体重链序列以及多种抗体轻链序列，或(ii) 抗体轻链序列以及多种抗体重链序列。
15.根据权利要求1至14中任何一项所述的方法，其中该抗体包括由所述至少一种逆 转录病毒表达构建体编码的可变结合域，该表达构建体使得V (D) J重组能够进行，从而在 逆转录病毒转导时产生用于可变结合域的编码序列。
16.根据权利要求1至15中任何一项所述的方法，其中步骤(b)是在诱变条件下进行的。
17.根据权利要求1至16中任何一项所述的方法，其中编码所述抗体或其片段的至少 一种逆转录病毒表达构建体含有顺式调控启动子以及复数个增强子元件的组合，该组合允 许将AID介导的体细胞突变靶向到由该表达构建体所编码的可变结合域上，其中该启动子 以及复数个增强子元件是选自下组，其组成为(a)免疫球蛋白重链启动子、内含子增强子(ΕμΗ)以及复数个3’α增强子元件，(b)免疫球蛋白κ轻链启动子、κ内含子增强子(KiE)以及复数个3’κ增强子 (3’ κΕ)元件，(c)免疫球蛋白λ轻链启动子、λ2-4以及复数个λ 3-1增强子元件，以及(d)它们的任何一种组合。
18.根据权利要求1至17中任何一项所述的方法，其中所述抗体或其片段在这些逆转 录病毒转导的脊椎动物宿主细胞中的表达被可操作地连接到(a)至少一种抗生素选择标志物，(b)至少一种筛选标志物，和/或连接到(c)它们的组合上，其中所述抗体或其片段的表达是使用至少一种内部核糖体进入序列(IRES)偶联的。
19.根据权利要求18所述的方法，其中该至少一种筛选标志物是(i)荧光蛋白，选自下组，其组成为绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧 光蛋白(RFP)、以及蓝色荧光蛋白(BFP)；或( )细胞表面标志物，选自下组，其组成为⑶7、⑶34以及低亲和力的神经生长因子 受体。
20.根据权利要求1至19中任何一项所述的方法，其中所述抗体是二聚体，并且它从逆 转录病毒构建体的表达是由以下控制的⑴双向启动子，( )两种分开的启动子，或(iii)使用至少一种内部核糖体进入序列(IRES)以及仅有一种启动子
21.根据权利要求1至20中任何一项所述的方法，其中该富集步骤(c)是通过使用以 下方法使细胞与非结合物群体物理分离来进行的(i)荧光激活细胞分选(FACS)；( )显微操作；或(iii)对于固定抗原或配体的淘选方法。
全文摘要
本发明披露了用于在体外在脊椎动物宿主细胞中产生、表达以及筛选多样的结合蛋白(例如，抗体或其片段)集合的新颖方法、用于鉴定和分离配体特异结合蛋白或抗原特异性结合蛋白的新颖方法。在此披露的这些方法允许从至少一种载体构建体表达多样的结合蛋白集合，这些载体构建体任选地可以在转移并且原位表达到脊椎动物宿主细胞中时产生多样结合蛋白集合。
文档编号C07K16/00GK101970482SQ200980107592
公开日2011年2月9日 申请日期2009年3月4日 优先权日2008年3月5日
发明者J·斯蒂茨, U·格拉旺德 申请人:4-抗体股份公司