一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及能特异性识别HBsAg空间表位的单克隆抗体及其 应用。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV)是一种呈广泛性分布、危害较为严重的 一种传染性病毒之一，全球已经有将近20亿的人曾经感染过HBV，持续性病毒感染的人达 到了 3~4亿人。我国是一个HBV感染的大国，持续感染患者达到1亿以上。随着预防免 疫接种和高效价免疫球蛋白的应用，在选择压力下，人群中感染HBV变异株的比例越来越 高。HBV变异株可能降低抗体检测的敏感性以及预防接种的有效性。因此，病毒变异给HBV 预防和治疗带来了很大的困难。鉴于缺少可特异性识别HBsAg空间表位的特异性抗体，针 对HBV变异株免疫原性的研究尚不充分。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有不足，提供一株能特异性识别HbsAg特定空间表位的单 克隆抗体。
[0004] 本发明的另一目的是提供能够分泌该单抗的杂交瘤细胞。
[0005] 本发明的又一目的是提供该单抗的应用。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] -株杂交瘤细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年9月16 日，保藏编号为CCTCC N0:C2014151。
[0008] 一种能够特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点构成的空间表位的 单克隆抗体，由所述的保藏编号为CCTCC N0:C2014151的杂交瘤细胞分泌。
[0009] 保藏编号为CCTCC N0:C2014151的杂交瘤细胞在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的 应用。
[0010] 本发明所述的单克隆抗体在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的应用。
[0011] 本发明所述的杂交瘤细胞的制备方法：
[0012] (1)构建DNA疫苗：密码子优化SEQ ID NO. 1所示的HBsAg氨基酸序列的编码序 列（HBsAg-Wt)，获得基因序列SEQ ID N0. 2;将SEQ ID N0. 2所示的优化的HBsAg基因序列 克隆入真核表达载体PJW4303的Hindlll/BamHI酶切位点间得到DNA疫苗HBsAg-Opt，用于 小鼠体内免疫和体外转染293T收集抗原进行单克隆抗体的筛选；
[0013] (2)用DNA疫苗免疫小鼠，提取脾细胞与骨髓瘤细胞融合或的杂交瘤细胞；
[0014] (3)按照以下方法对上一步获得的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行筛选：
[0015]①定点诱变SEQ ID N0. 2所示的优化的HBsAg基因，将其克隆到真核表达载体 PJW4303的Hindlll/BamHI酶切位点间，制备HBsAg基因变异表达质粒（22株）；将HBsAg 基因变异表达质粒（22株）分别转染293T细胞，进一步在体外进行表达并收集抗原，用于 筛选HBsAg特定表位的单克隆抗体；
[0016] ②HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，10天后取上清进行ELISA检测；选择0D值在 1. 0以上，并且孔内细胞形态及活力好的孔位进行下一步的筛选；
[0017] ③利用步骤①中制备的HBsAg变异株表达上清对杂交瘤所分泌的单克隆抗体的 位点特异性进行检测，筛查识别空间表位的单抗。
[0018] 其中，定点诱变SEQ ID N0. 2所示的优化的HBsAg基因的表达产物分别在SEQ ID NO. 1 所示氨基酸序列的第 118、120、122、123、126、130、133、141、142、143、145、146、147、 154、155、18U204等氨基酸残基处发生了点突变。
[0019] 有益效果：
[0020] 按照哺乳动物的密码子偏好原则，本专利优化编码HBsAg基因的DNA序列，并制备 DNA疫苗，其益处有二：（一）DNA疫苗在体内转录翻译生成蛋白质，有利于保存抗原空间表 位；（二）密码子优化提高了 DNA疫苗的蛋白质表达效率，克服了 DNA疫苗免疫原性弱的缺 陷。
[0021] DNA疫苗常规接种方式有皮下注射、肌肉注射等等。不同于常规接种方法，本专利 应用大剂量瞬时尾静脉注射方法，DNA疫苗第一时间进入肝脏，目的基因体内转染的靶器官 主要是肝脏。本专利的体内转染方式能有效模拟HBV感染肝脏的过程。
[0022] 为有效获得HBsAg空间表位的单克隆抗体，本发明定点诱变HBsAg表达疫苗，并在 体外生产并获得变异蛋白22株，通过对HBsAg特定表位的单克隆抗体检测结果进行比对分 析，确定其中一株能特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点氨基酸构成的空 间表位，获得特异性识别fffisAg空间表位的单克隆抗体。
[0023] 识别HBsAg空间表位的单克隆抗体，可用于进一步用于探索HBsAg空间结构以及 监控人群HBV感染后HBsAg变异规律。
[0024] 识别HBsAg空间表位的单克隆抗体，尚可以用于进一步改造成治疗性抗体，如人 源化抗体，用于紧急预防和治疗HBV感染。
【附图说明】
[0025] 图1优化基因密码子序列偏好性
[0026] 图2变异株氨基酸序列比对
[0027] 图3 HBsAg-Opt核酸疫苗免疫效价监测结果，M表示免疫接种（第1周、第3周及 第5周）；
[0028] 在每次免疫1周后应用ELISA检测HBsAb滴度
[0029] 图4单克隆抗体5H2检测HBsAg野生型及突变株检测结果
[0030] 图5免疫印迹（Western blot)鉴定抗体5H2
[0031]图 6 5H2 检测
[0032] 1 :Marker，2:HBsAg_wt 转染上清，3:pW4303 转染上清
[0033] 生物材料保藏信息
[0034] 杂交瘤细胞株HbsAg_5H2,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武 汉，武汉大学，保藏日期为2014年9月16日，保藏编号为CCTCC N0:C2014151。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1
[0036] 按照哺乳动物的密码子偏好，利用http://www. jcat. de在线软件对SEQ ID NO. 1 所示的HBsAg氨基酸序列的编码序列（HBsAg-Wt)进行密码子优化，得到优化的HBsAg基因 序列SEQ ID N0. 2,并将其克隆入真核表达载体pJW4303的Hindlll/BamHI酶切位点间得到 HBsAg的DNA疫苗HBsAg-Opt，应用于小鼠体内免疫和体外转染293T收集抗原进行单克隆 抗体的筛选。
[0037] 同时以HBsAg-Opt序列为模板，通过PCR方法进行定点诱变，并将突变序列克 隆入真核表达载体PJW4303的Hindlll/BamHI酶切位点间得到HBsAg基因变异表达质粒 HBsAg-Mut (表1 :引物）；进一步在体外293T细胞中进行表达并收集抗原，用于筛选HBsAg 特定表位的单克隆抗体。
[0038] 表1 HBsAg突变株引物
[0039]
[0040]
[0041] 实施例2单抗筛选用抗原的生产
[0042] 1)转染前一天接种293细胞6x 105到六孔板中，每孔3ml完全培养基。
[0043] 2)在37°C和5% C02的孵箱里培养细胞，在转染当天板内的细胞密度在40-80% 之间。
[0044] 3)稀释 2 y g 的待转染质粒（HBsAg-Wt，HBsAg-〇pt 以及 HBsAg-Mut)到 100 y 1 培 养基中（不含血清、蛋白、抗生素），上下颠倒混匀。
[0045] 4)加入20 y 1 PolyFect转染试剂到上一步的质粒溶液中，吹打5次。
[0046] 5)将转染试剂和质粒的混合物放在室温孵育5-10分钟。
[0047] 6)在孵育间隙，将培养板内的培养基移去，加入新鲜的培养基1. 5ml。
[0048] 7)加入0. 6ml的培养基，到转染混合物种，上下吹打数次后。立刻移入细胞培养板 中，轻轻的转动培养板混匀板内的培养基。
[0049] 8)转染后8小时换成无血清培养基，继续培养72小时，收集所有培养上清，超滤后 备用。
[0050] 实施例3杂交瘤的制备
[0051] (1)骨髓细胞来源和维持培养、免疫的动物来源；
[0052] SP2/0由江苏省人民医院感染科赠送，常规保种冻存。
[0053] 免疫鼠选择：免疫种类为：Balb/c，雌性，8周龄：体重：20g ;购自扬州大学动物中 心。每次免疫6只，2只空白对照。
[0054] (2)免疫接种过程；
[0055] 免疫方案：提取HBsAg-Opt质粒，定量后调整浓度为lmg/ml，10 yg/mice瞬时尾静 脉注射方法进行免疫，共5次，间隔4周，最后一次免疫两周后取脾细胞融合。每一次免疫 接种后一周监测抗原表达水平，可见免疫后小鼠HBsAg抗体滴度逐周升高（图3);小鼠处 死前，免疫小鼠血清滴度多1 :128000(表2)。
[0056] 免疫方法：
[0057] 每只小鼠需要总体积（ml)=鼠体重（g) X0. 1+0. 1ml (转染试剂）；
[0058] 10 y 1体积的质粒到体重为20g的小鼠；
[0059] 试剂配置如下：
[0060]
[0061] 将目的质粒10ul加入到无菌的5ml离心管中，加入需要的体内转染试剂混勾，在 三十分钟内快速（20秒）注射入小鼠尾静脉。
[0062] (3)两种细胞的融合步骤和条件；
[0063] 3. 1脾细胞制备
[0064] 1)最后一次免疫两周后，颈椎脱臼处死小鼠。
[0065] 2)将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
[0066] 3)把脾放入5ml含有1 % FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红细胞。
[0067] 4)轻轻挤压脾，形成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
[0068] 5) 200目筛网过滤，去除使大块的结缔组织，把细胞悬液移入离心管中。
[0069] 6)以1%FCS-1640充满离心管，并以500g离心10min (与此同时应开始制备骨髓 细胞）。
[0070] 7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
[0071] 8)重复(6)、(7)步骤。
[0072] 9)计数细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查活细胞数。
[0073] 3. 2骨髓瘤细胞：
[0074] 1)融合前约一周时复苏、增殖。
[0075] 2)取约2X 107对数生长期的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g)lOmin，
[0076]