特异性地阻滞肿瘤抗原的生物活性的抗体的制作方法
【专利说明】特异性地阻滞肿瘤抗原的生物活性的抗体 【技术领域】
[0001] 本发明涉及特异性地结合KAAG1的单克隆抗体及其抗原结合片段和它们用于治 疗某些疾病的用途，所述用途包括诊断、预防和治疗与卵巢癌有关的恶性肿瘤。本发明也涉 及该些抗体用于诊断、预防和治疗不同的其它癌症类型的用途。 【【背景技术】】
[0002] 在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌占美国妇女中最高的肿瘤相关死亡率（Jemal等 人，2005)。它是美国妇女癌症相关死亡的第四大主要原因（Menon等人，2005)。美国癌症 学会（AmericanCancerSociety)估计在2005年共有22, 220个新病例，并将16, 210例死 亡归因于该疾病炬onome等人，2005)。在过去的30年中，统计数字保持大致相同--大 多数出现卵巢癌的妇女将死于该疾病（化ambers和Vanderhyden，2006)。该疾病具有1:70 终生危险，且死亡率〉60%(化311166'3和￥3]1(161'117(16]1,2006)。高死亡率是由于难^早期 检测卵巢癌，此时恶性肿瘤已经扩散至卵巢W外。实际上，〉80%的患者被诊断为晚期疾病 (III期或IV期）@onome等人，2005)。该些患者具有不良预后，该反映为<45%的5-年存 活率，尽管80 %至90 %在最初对化疗有反应炬erek等人，2000)。与早些年的20 % 5-年 存活率相比，该增加的成功至少部分地是由于最佳消胀（debulk)肿瘤组织的能力（当肿 瘤组织被限制在卵巢中的时候），该是卵巢癌的重要预后因子炬ristowR.E.，2000;Brown 等人，2004)。在诊断出早期疾病（I期）的患者中，5-年存活率范围〉90(化ambers和 Vanderhyden, 2006)。
[0003] 卵巢癌包含不同的肿瘤组，它们源自卵巢的表面上皮或表面包裹体。它们分成血 清的、粘蛋白的、子宫内膜样的、透明细胞和布伦纳（过渡）类型，对应女性生殖道器官的 不同上皮类型（化化和Kurman, 2005)。在它们中，血清肿瘤占诊断出的卵巢癌病例的~ 60%。每个组织学子类进一步分成3组；良性的、中间的（交界肿瘤或低恶性潜力（LMP)) 和恶性的，该反映了它们的临床行为（Sei血an等人，2002)。LMP占诊断出的血清肿瘤的 10%至15%，且是一个难题，因为它们表现出非典型核结构和转移行为，然而它们的侵入性 比高阶血清肿瘤明显更低。具有LMP肿瘤的患者的5-年存活率是95%，不同于晚期高阶疾 病在相同时段中的<45 %存活率炬erek等人，2000)。
[0004] 现在，卵巢癌的诊断部分地通过患者医学史的常规分析和通过进行体检、超声检 查和X-射线检查和血液学筛查来完成。已经为血清生物标志物的早期血液检测报道了 2 个替代策略。一个方案是，通过质谱法分析血清样品，W找到不明身份的蛋白或蛋白片段， 它们检测癌症的有无（Mor等人，2005 ;Kozak等人，2003)。但是，该策略是昂贵的，且不能 广泛地得到。或者，使用抗体微阵列、ELISA或其它类似方案，检测血清中是否存在已知的 蛋白/肤。称作CA-125(癌抗原-125)的蛋白生物标志物的血清检验长期W来被广泛地视 作卵巢癌的标记物。但是，尽管卵巢癌细胞可能生成过量该样的蛋白分子，一些其它的癌症 具有高水平的CA-125,所述癌症包括输卵管癌或子宫内膜癌（子宫的衬里的癌）、60%的膜 腺癌患者和20% -25%的其它恶性肿瘤患者。CA-125检验仅返回约50%的I期卵巢癌患 者的真实阳性结果，且具有80%的机会返回II、III和IV期卵巢癌患者的真实阳性结果。 另外20%的卵巢癌患者没有表现出CA-125浓度的任何增加。另外，升高的CA-125检验可 能指示与癌症无关的其它良性活性，诸如月经、妊娠或子宫内膜异位症。结果，该检验对于 仍然可治疗的早期疾病的检测而言具有非常有限的临床用途，表现出<10%的阳性预测值 (PPV)。即使给CA-125附加超声筛查，PPV仅提高至约20%化ozak等人，2003)。因而，该 检验不是有效的筛查检验。
[0005] 尽管具有提高的该疾病的病原学知识、侵入性细胞减数手术和现代组合化疗，死 亡率仅有微小变化。差结果已经归因于：（1)缺少用于早期疾病检查的适当筛选检验，W及 在该阶段仅微弱的症状显现--经常只有在进展至晚期后才能做出诊断，在此时癌症的 腹膜扩散会限制有效的治疗，和（2)经常出现对标准化疗策略的耐受性，该限制了患者的 5-年存活率的提高。卵巢癌的初期化疗方案包括卡波笛（伯尔定）和紫杉醇（泰素）的组 合。数年的临床试验已经证实该组合在有效手术后是最有效的（在约80%的具有新诊断出 的卵巢癌的妇女中减小肿瘤体积，且40%至50%具有完全消退），但是继续研究来寻找提 高它的方法。最近的化疗剂腹部输注来祀向难W达到的细胞与静脉内递送的组合已经增加 了有效性。但是，严重的副作用经常导致不完全的疗程。一些其它的化疗剂包括多柔比星、 顺笛、环磯醜胺、博来霉素、依巧泊巧、长春碱、盐酸拓扑替康、异环磯醜胺、5-氣尿嚼巧和美 法仑。更近地，临床试验已经证实，与全身性静脉内化疗相比，顺笛的腹膜内施用会提供生 存优势（Cannistra和McGuire, 2007)。接受化疗的具有早期疾病的妇女的优良存活率会为 开发提高卵巢癌检测的策略的研究工作提供坚固的理论。此外，新的卵巢癌有关的生物标 志物的发现，会导致用于卵巢癌的将来治疗的、具有最小副作用的更有效的治疗策略的发 展。
[0006] 尽管在卵巢癌的理解和治疗方面存在该些最近的进步，化疗的应用总是伴有严重 的不良反应，该限制了它们的应用。结果，对更特异性的策略（诸如组合抗原组织特异性和 单克隆抗体的选择性）的需要，会允许显著减少脱祀相关的（off-target-associated)副 作用。单克隆抗体用于治疗卵巢癌的应用正在开始出现，具有日益增多的数目的进行中的 临床试验（Oei等人，2008 ;Nicodemus和berek, 2005)。该些试验中的大多数已经检查了 与放射性同位素（诸如纪-90)缀合的单克隆抗体的应用，或祀向在其它癌症类型中已经鉴 别出的肿瘤抗原的抗体的应用。一个该样的实例是贝伐单抗的应用，它祀向血管内皮生长 因子炬urger，2007)。存在非常少的卵巢癌特异性的抗原，它们目前处于作为单克隆抗体的 治疗祀标的研究中。一些实例包括称作B7-H4的蛋白（Simon等人，2006)和更近的叶酸受 体-a巧bel等人，2007)的应用，后者最近已经进入II期临床试验。
[0007] 最初从源自组织相容性白细胞抗原-B7肾癌细胞系的cDNA文库克隆出肾相关 抗原1 (KAAG1)，作为呈递给细胞毒性T淋己细胞的抗原肤（VandenEynde等人，1999 ; Genebank登记号Q9UBP8)。发现含有KAAGl的基因座编码2个基因，它们在两个方向转录到 相反链上。发现有义链编码该样的转录物，其编码称作DCDC2的蛋白。该些作者的表达研究 发现，KAAG1反义转录物是肿瘤特异性的，且在正常组织中表现出非常少的表达，而DCDC2 有义转录物普遍表达（VandenEynde等人，1999)。KAAG1转录物在癌症、尤其是卵巢癌、肾 癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和黑素瘤中的表达，公开在公布的专利申请号PCT/CA2007/001134 中。VandenEynde等人也观察了在肾癌、结直肠癌、黑素瘤、肉瘤、白血病、脑肿瘤、甲状 腺肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀脫肿瘤、肺癌和头和颈肿瘤中的RNA表达。最近，通 过连锁不平衡研究得到的有力遗传证据发现，VMP/DCDC2/KAAG1基因座与诵读困难有关 (Schumacher等人，2006 ;Cope等人，2005)。该些报告之一指向DCDC2标志物作为诵读困 难患者的原因，因为该蛋白在皮质神经元迁移中的功能与经常表现出异常神经元迁移和成 熟的该些患者的症状相一致（Schumacher等人，2006)。 【
【发明内容】
】
[000引本发明涉及KAAG1在肿瘤细胞中的表达。本发明也涉及特异性的抗-KAAG1抗体 和抗原结合片段W及可用于治疗、检测和诊断癌症的试剂盒。所述抗体和抗原结合片段可 W更具体地用于治疗、检测和诊断其中肿瘤细胞表达KAAG1的癌症，诸如卵巢癌、皮肤癌、 肾癌、结直肠癌、肉瘤、白血病、脑癌、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、膀脫癌、肺癌W 及头和颈癌。
[0009] 本发明在其一个方面提供了分离的或基本上纯化的抗体或抗原结合片段，它们能 特异性地结合肾相关抗原1 (在SEQIDNO. :2中定义的KAAG1)或KAAG1变体。
[0010] 更具体地，且根据本发明的一个实施方案，所述抗体或抗原结合片段可W结合位 于KAAG1的氨基酸30和氨基酸84之间的结构域。
[0011] 根据本发明的另一个实施方案，所述抗体或抗原结合片段能结合包含在KAAG1的 氨基酸1-35内的表位。
[0012] 根据本发明的再一个实施方案，所述抗体或抗原结合片段能结合包含在KAAG1的 氨基酸36-60内的表位。
[0013] 根据本发明的再一个实施方案，所述抗体或抗原结合片段能结合包含在KAAG1的 氨基酸61-84内的表位。
[0014] 本发明的抗体或抗原结合片段尤其能特异性地结合分泌型KAAG1，目P，其中已经 切掉信号肤的KAAG1形式。
[0015] 本发明的抗体或抗原结合片段尤其能结合KAAG1的胞外区域。
[0016] 该样，本发明包括诊断和/或治疗抗体或抗原结合片段，其具有对分泌型KAAG1或 KAAG1的胞外区域的特异性。本发明也包括具有与本发明抗体相同的表位特异性的抗体或 抗原结合片段。通过测定它是否结合本文所述抗体结合的表位，和/或通过与已知结合所 述表位的抗体或抗原结合片段进行竞争试验，可W鉴别候选抗体。
[0017] 因此，本发明的另一个方面提供了分离的抗体或抗原结合片段，其能与本文所述 的抗体或抗原结合片段竞争。
[0018] 本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括能诱导表达KAAG1的肿瘤细胞或表达 KAAG1变体的肿瘤细胞的杀死（消除、破坏、裂解）（例如，WADCC-依赖性的方式）的那些。
[0019] 本发明的分离的抗体或抗原结合片段也包括特征在于它们的减少表达KAAG1的 肿瘤细胞的扩散的能力的那些，W及特征在于它们的减少或损害表达KAAG1的肿瘤的形成 的能力的那些。
[0020] 当KAAG1在表达KAAG1的肿瘤细胞的表面处表达时，所述抗体或抗原结合片段可 能是特别有效的，且可W具体地用于祀向特征在于不依赖于销着生长的表达KAAG1的肿瘤 细胞。
[0021] 本发明涉及具有本文所述特征的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体 和人抗体（分离的）W及抗原结合片段。还一起包括该样的抗体或抗原结合片段，其包括 单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体之间的轻链和/或重链的置换。
[0022] 本发明的抗体或抗原结合片段因而可W包含人恒定区的氨基酸和/或人抗体的 框架氨基酸。
[0023] 术语"抗体"是指完整抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语"抗体"也包括多特 异性的抗体，诸如双特异性的抗体。人抗体通常由2个轻链和2个重链组成，每个链包括可 变区和恒定区。轻链可变区包含3个侧接框架区的CDR，在本文中鉴定为CD化1、CD化2和 CD化3。重链可变区含3个侧接框架区的CDR，在本文中鉴定为CDRH1、CDR肥和CDR册。
[0024] 本文使用的术语"抗原结合片段"是指抗体的一个或多个片段，所述片段保留结合 抗原（例如，KAAG1、分泌型KAAG1或其变体）的能力。已经证实，抗体的抗原结合功能可 W由完整抗体的片段来执行。在术语抗体的"抗原结合片段"中包括的结合片段的实例包 括；（i)F油片段，即由Vh、C讯Ch满构域组成的单价片段；（ii)F(油'）2片段，即包含2 个通过较链区中的二硫键连接起来的F油片段的二价片段；（iii)由Vh和Chi结构域组成 的Fd片段；（iv)Fv片段，其由抗体的一条臂的V郝VH结构域组成；(V)dAb片段（Ward等 人，（1989)化Uire341:544-546)，其由Vh结构域组成；和（Vi)分离的互补性决定区（CDR), 例如，VhCDR3。此外，尽管Fv片段的2个结构域\和￥?由分开的基因编码，使用重组方 法，可W通过合成连接物连接它们，所述合成连接物使它们成为单个多肤链，在该个单个多 肤链中V許日Vh区配对，W形成单价分子（称作单链Fv(scFv);参见例如，Bird等人（1988) Science242:423-426 ;和Huston等人（1988)Proc.化tl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。 该样的单链抗体也意图包括在术语抗体的"抗原结合片段"内。此外，抗原结合片段包括结 合-结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含：（i)与免疫球蛋白较链区多肤融合的结合结构域 多肤（诸如重链可变区、轻链可变区或通过连接肤与轻链可变区融合的重链可变区），（ii) 与较链区融合的免疫球蛋白重链C肥恒定区，和（iii)与C肥恒定区融合的免疫球蛋白重 链C