C、d型产气荚膜梭菌抗毒素血清及其制备方法
【专利说明】c、D型产气芙膜梭菌抗毒素血清及其制备方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清及其制备方法。 (二）技术背景
[0002] 产气英膜梭菌（C.per化ingens)又称魏氏梭菌（C.welchii)，是动物肠道的常在 菌，然而，当饲养、环境条件突然改变时它能够感染致病，为一种条件致病菌。该菌能够感染 多种动物，导致坏死性肠炎和肠毒血症等复杂的症状或病理变化。产气英膜梭菌根据其分 泌的四种主要外毒素（a、0、e、〇分为A、B、C、D、E五个亚型。C型产气英膜梭菌主要 致病毒素主要是a、P外毒素，它是多种家畜肠源毒血症和"巧死症"的主要病原，如仔猪 红频和羊巧狙。D型产气英膜梭菌主要产生a、e两种外毒素，能引起黑羊、绵羊、山羊、牛 W及灰鼠等动物的肠毒血症。近年来黑龙江、青海、云南、宁夏等地均有D型菌导致牛、羊等 动物肠毒血症的报道，给畜牧业造成了严重损失。农业部将该病列为畜禽的二类传染病。
[0003] 在畜牧业养殖中，由于抗生素的使用，在选择压力下，病原不断的变异。产气英膜 梭菌的耐药谱越来越广，使得曾发挥巨大作用的抗生素在面对该些疾病时越来越无能为 力，常常让广大的养殖户遭受着极大的经济损失。抗血清又称高免血清或抗病血清，是一 种高效价、特异性抗体。
[0004] 采用C、D两个亚型的混合血清，抗体丰富，覆盖面宽，在生产中可起到很好的预防 作用。在我国，C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清并没有制备和应用的报道。故此，本发明有 创新，并能够服务于畜牧生产。 (H)
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清及其制备 方法；利用本发明制备的C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清，效价高、特异性强、无毒副作用； 可用于动物的C、D型产气英膜梭菌病的免疫，可在研究预控控制C型、D型或C、D两型产气 英膜梭菌感染引起的羊巧狙，肠毒血症等病的流行中起到重大作用。
[0006] 一种C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清，其制备方法包括W下步骤：
[0007] 1.将3ulC型产气英膜梭菌菌种和D型产气英膜梭菌菌种分别接种于血平板培养 基上复苏，再使用营养肉汤培养基增菌厌氧培养，分别得到C型产气英膜梭菌菌液和D型产 气英膜梭菌菌液。
[000引 2.将4mlC型产气英膜梭菌菌液和3mlD型产气英膜梭菌菌液加入到100ml pH7.5的产毒培养基中，在厌氧环境下振荡培养，44°C培养化高效产毒，然后4°C 4000g离 屯、15min，再用孔径0. 22ym的蔡氏滤器中过滤除菌，得到C、D型产气英膜梭菌外毒素溶 液，作为C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清的第二免疫原。
[0009] 3.在C、D型产气英膜梭菌外毒素溶液中加入其体积比0. 3%的甲醒溶液，充分振 荡混匀，37°C灭活12她，期间每隔5-化振摇一次，得到灭活好的C、D型产气英膜梭菌类毒 素溶液。按照C、D型产气英膜梭菌类毒素溶液和白油佐剂体积比1:2向灭活好的C、D型产 气英膜梭菌类毒素溶液中加入灭菌的白油佐剂乳化，得到C、D型产气英膜梭菌二价白油类 毒素疫苗，作为C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清的第一免疫原。
[0010] 4.C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清制备分为基础免疫和加强免疫；先用第一免疫 原对成年健壮的健康绵羊进行两次基础免疫；肌肉分点注射C、D型产气英膜梭菌二价类毒 素白油疫苗；再使用第二免疫原进行四次加强免疫；肌肉分点注射除菌C、D型产气英膜梭 菌外毒素溶液。按W下免疫程序进行：
[0011] 免疫程序
[0012]
【主权项】
1. 一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，其特征在于通过以下方法制备得到： 1) 将3ul C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上 复苏后使用营养肉汤培养基增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚 膜梭菌菌液； 2) 将4ml C型产气荚膜梭菌菌液和3ml D型产气荚膜梭菌菌液加入到100mL pH7. 5的 产毒培养基中，在厌氧环境下振荡培养，44°C培养5h高效产毒，然后4°C 4000g离心15min， 再用孔径0. 22 μ m的蔡氏滤器中过滤除菌，得到C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液，作为C、 D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第二免疫原； 3) 在C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液中加入其体积比0. 3%的甲醛溶液，充分振荡混 匀，37°C灭活128h，期间每隔5-6h振摇一次，得到灭活好的C、D型产气荚膜梭菌类毒素溶 液；按照⑶型产气荚膜梭菌类毒素溶液和白油佐剂体积比1:2向灭活好的C、D型产气荚膜 梭菌类毒素溶液中加入灭菌的白油佐剂乳化，得到C、D型产气荚膜梭菌二价白油类毒素疫 苗，作为C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第一免疫原； 4. C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清制备分为基础免疫和加强免疫；先用第一免疫原对 成年健壮的健康绵羊进行两次基础免疫：肌肉分点注射C、D型产气荚膜梭菌二价类毒素白 油疫苗；再使用第二免疫原进行四次加强免疫：肌肉分点注射除菌C、D型产气荚膜梭菌外 毒素溶液；具体免疫程序如下表： 免疫程序
5) 最后一次免疫IOd后静脉无菌采血，分离血清，得到C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血 清； 所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3. 7g豆粉琼脂、Ig葡萄糖和5ml绵羊 血； 所述的营养肉汤培养基成分：1〇〇毫升蒸馏水、蛋白胨lg、牛肉粉〇.3g、生理盐水 〇. 5g ； 所述的产毒培养基成分为：每100mLPBS缓冲液溶解3g胰蛋白胨、2g糊精、2g酵母浸膏 和2. 2gL-精氨酸；PBS缓冲液成分为：IL去离子水、0. 27g磷酸二氢钾（KH2P04)、I. 42g磷 酸氢二钠（Na2HP04)、8g氯化钠（NaCl)和(λ 2g氯化钾（KCl)。
【专利摘要】本发明涉及一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清及其制备方法；是将C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上复苏，再使用营养肉汤增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚膜梭菌菌液，再利用产毒培养基培养灭活，对血清进行基础免疫和加强免疫后分离得到。本发明制备的C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，效价高、特异性强、无毒副作用；可用于动物的C、D型产气荚膜梭菌病的免疫，可在研究预控控制C型、D型或C、D两型产气荚膜梭菌感染引起的羊猝狙，肠毒血症等病的流行中起到重大作用。
【IPC分类】C07K16-06, C07K16-12
【公开号】CN104829712
【申请号】CN201510202093
【发明人】柴同杰, 刘雪慧, 王海荣
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月23日