脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用，特别是设及针对脑膜炎 双球菌A、C、化35、Y血清型的四种英膜多糖的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系W 及含有该抗体的试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002] 流行性脑脊髓膜炎（流脑）已发现100余年，至今仍在不少国家流行，也是 我国冬、春季比较常见的急性呼吸道传染病。该病是由脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitides)引起的脑膜炎。据统计，每年的2~4月，"流脑"的发病率占全年的60% 左右。病人主要是15岁W下的少年儿童，特别是6个月至2岁的婴幼儿容易感染。其特点 是起病急、病情重、变化多、传播快、流行广、来势凶猛、病死率高、危害性大，所W必须切实 做好预防工作。
[0003] 脑膜炎双球菌属奈瑟氏菌属，革兰氏染色阴性，肾形，多成对排列，或四个相联。根 据本菌的夹膜多糖抗原的不同，通过血凝试验将本菌分为A、B、C、D、X(1916)、Y(1889)、Z、 ￥135(319)、2犯（1892)、山1、1(和113个血清群。^4、8、(：群为多见。脑膜炎双球菌细菌 素（meningocin)又可将A群分为4型，C群分为6型；B群分为11型，其中B群2型致病力 最强。根据其脂多糖（CP巧将脑膜双球菌分为8个LPS免疫型，与致病关系尚不清楚。
[0004] 近20年来欧美一些国家的流行菌群已由A群转变为B群和C群；我国的流行菌群 主要是A群，B群仅占少数。但带菌者WB、C群为主，今后是否会成为主要流行菌群，有待 于密切观察。
[0005] 脑膜炎双球菌是不断变迁的，在脑膜炎球菌的13个血清群中，A群B群C群Y群 和化35群引起的病例可达95%，无论是成人或儿童，对化35群流脑普遍易感。四价多糖疫 苗针对的是包括奈瑟脑膜炎球菌A、C、化35、Y的4个血清群，具有保护率高（85% -95% )、 反应率低（无全身反应和发热反应）及免疫有效期长（约2~3年）的=大优点。
[0006] 目前在国内外尚未见到快速有效特异检测脑膜炎球菌英膜多糖的化ISA试剂盒 的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供脑膜炎球菌A、C、Y、化35群英膜多糖（血清型）的单克隆抗 体、产生该抗体的杂交瘤细胞系W及单克隆抗体的应用。
[000引本发明提供一种单克隆抗体，分别W4种脑膜炎球菌英膜多糖为免疫原，免疫动 物制备获得；
[0009] 其中，4种脑膜炎球菌英膜多糖的血清型分别为A、C、Y和W135 ;所述单克隆抗体 特异性地识别A、C、Y和化35脑膜炎球菌病原体。
[0010] 所述载体蛋白为白喉毒素CRM197蛋白或破伤风类毒素TT蛋白。
[0011] 本发明制备单克隆抗体过程中，免疫使用的动物为小鼠。
[0012] 本发明提供了 8种单克隆抗体，分别是脑膜炎球菌A、C、Y、化35群多糖的单克隆 抗体。
[0013] 具体地说是分别W脑膜炎球菌结合疫苗中的A、C、Y、化35英膜多糖为免疫原免疫 小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌A、C、Y或化35群脑膜炎 球菌多糖的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由各细胞株分泌得到8种单克隆抗体。
[0014] 本发明提供的单克隆抗体能特异识别脑膜炎球菌A血清型多糖的单克隆抗体为 Clone6B7和Clone6B12;特异识别脑膜炎球菌C血清型多糖的单克隆抗体为Clone2H4和 Clone5B3;特异识别脑膜炎球菌化35血清型多糖单克隆抗体为CloneSFl和Clone4服；特 异识别脑膜炎球菌Y血清型多糖的单克隆抗体为Clone7C6和Clone3A2;
[0015] 所述单克隆抗体Clone6B7的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 1和2所示；
[0016] 所述单克隆抗体Clone6B12的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 3和4所示；
[0017] 所述单克隆抗体Clone2H4的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 5和6所示；
[0018] 所述单克隆抗体Clone5B3的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.7和8所示；
[0019] 所述单克隆抗体CloneSFl的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.9和10所示；
[0020] 所述单克隆抗体Clone4服的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.11 和 12 所示；
[0021] 所述单克隆抗体Clone7C6的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 13和14所示；
[0022] 所述单克隆抗体Clone3A2的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.15 和 16 所示。
[0023] 本发明提供了能稳定分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0024]本发明针对每种血清型各自获得的单克隆抗体具有良好的特异性，实验表明，每 种血清型的单克隆抗体与其它3种血清型的脑膜炎球菌英膜多糖抗原没有显著的交叉反 应，间接化ISA表明该些抗体具有较高的效价，因此可用于A、C、Y、化35群脑膜炎球菌英膜 多糖的检测。可W采用双抗夹屯、法，分别利用两个单克隆抗体对各型英膜多糖进行检测。
[0025] 本发明提供了上述8种单克隆抗体中任一种单克隆抗体在制备脑膜炎球菌检测 试剂盒中的应用。
[0026] 本发明提供了上述8种单克隆抗体中任一种单克隆抗体在制备脑膜炎球菌英膜 多糖A、C、Y或化35抗体检测试剂盒中的应用。
[0027] 含有上述任一种或多种单克隆抗体的药物属于本发明的保护范围。
[002引本发明提供了上述8种单克隆抗体任一种或多种单克隆抗体在制备脑膜炎球菌 预防性药物中的应用。
[0029] 本发明提供了含有上述任一种或多种单克隆抗体的检测试剂盒。
[0030] 本发明提供一种用于脑膜炎英膜多糖检测的试剂盒。
[0031] 本发明提供的检测试剂盒，其为化ISA检测试剂盒，其w特异性地识别脑膜炎球 菌A血清型多糖的一种单克隆抗体为包被抗体，W酶标记的异性地识别脑膜炎球菌A血清 型多糖的另一种单克隆抗体作为检测抗体，所述单克隆抗体为Clone6B7或Clone6B12。
[0032] 本发明提供的检测试剂盒，其为化ISA检测试剂盒，其W特异性地识别脑膜炎球 菌C血清型多糖的一种单克隆抗体为包被抗体，W酶标记的异性地识别脑膜炎球菌C血清 型多糖的另一种单克隆抗体作为检测抗体，所述单克隆抗体为Clone2H4和Clone5B3。
[0033] 本发明提供的检测试剂盒，其为化ISA检测试剂盒，其W特异性地识别脑膜炎 球菌化35血清型多糖的一种单克隆抗体为包被抗体，W酶标记的异性地识别脑膜炎球 菌化35血清型多糖的另一种单克隆抗体作为检测抗体，所述单克隆抗体为CloneSFl和 Clone4 服。
[0034] 本发明提供的检测试剂盒，其为化ISA检测试剂盒，其W特异性地识别脑膜炎球 菌Y血清型多糖的一种单克隆抗体为包被抗体，W酶标记的异性地识别脑膜炎球菌Y血清 型多糖的另一种单克隆抗体作为检测抗体，所述单克隆抗体为Clone7C6和Clone3A2。
[0035] 本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测4种脑膜炎球菌英膜多糖试剂盒中的 应用，所述4种脑膜炎球菌英膜多糖的血清型分别为A、C、Y和化35。
[0036] 本发明提供的各型英膜多糖特异的单克隆抗体分别与其它ACYW135群脑膜炎球 菌型英膜多糖无明显交叉反应，用于检测A、C、Y、化35群脑膜炎球菌英膜多糖具有高特异 性、高敏感性的优点，可W准确检测样品中各型多糖组分的水平，广泛应用于临床检测和疫 苗厂家生产疫苗过程中的质检。
【附图说明】
[0037] 图1是抗体的SDS-PA(iE电泳图，其中M是蛋白分子量标准（kDa)，本发明获得的8 种单克隆抗体，泳道1-9分别为BSA她7、她12、2拟、583、5。1、4服、7〔6、342单抗。
[003引图2所示的是脑膜炎球菌A多糖化ISA法灵敏度实验的拟合曲线。
[0039] 图3所示的是脑膜炎球菌C多糖化ISA法灵敏度实验的拟合曲线。
[0040] 图4所示的是脑膜炎球菌化35多糖化ISA法灵敏度实验的拟合曲线。
[0041] 图5所示的是脑膜炎球菌Y多糖ELISA法灵敏度实验的拟合曲线。
[0042] 具体实施方法
[0043] W下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0044] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的