一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法

一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法，所述方法，包括如下步骤：将提取得到的肺炎链球菌荚膜多糖进行降解；降解后的肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白结合，随后制成疫苗制剂。
【专利说明】一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种疫苗的制备，特别涉及一种肺炎多糖蛋白结合疫苗及其制备方法。
【背景技术】:
[0002]肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)可引起鼻窦炎、中耳炎、气管炎和肺炎等非侵袭性感染以及脓毒症和脑膜炎等侵袭性感染，是一种引起所有年龄组高发病率和病死率的主要致病菌。在儿童呼吸系统中，肺炎发病率居第二位。世界卫生组织(WHO)调查数据显示，每年死于肺炎链球菌感染的160万人中，约有60%人群为5岁以下儿童。可见，肺炎链球菌堪称威胁儿童健康的“头号杀手”。目前，中国是全世界发病率高的五个亚洲国家之一 O
[0003]在中国的调查数据显示，由于抗生素的过度使用，目前肺炎球菌对于红霉素和青霉素等常见抗菌素的耐药性正在升高，《应高度重视儿童肺炎的预防措施)一文中提到例如血清6型对红霉素的耐药性已经达到百分之百。因此，接种肺炎球菌结合疫苗，是预防儿童患上肺炎球菌疾病的最佳方式。
[0004]目前，国内上市的肺炎球菌结合疫苗产品主要有辉瑞的7价肺炎球菌结合疫苗(PCV7)，商品名为Prevenar，包含7种血清型的肺炎链球菌，分别为4，6B，9V，14，18C，19F和23F。PCV7的使用， 降低了儿童侵袭性肺炎链球菌疾病(IB))的整体发病率。但是由于该疫苗价格昂贵，接种四针需要花费3000多人民币，这或许会使许多家长望而却步，放弃对孩子的接种。另一方面流行病学调查显示，PCV7在美国和欧洲的覆盖率为86%和74%，而在亚洲的覆盖率仅为 43% ,参见 World Health Orgnization.Pneumococcal conjugatedvaccine for childhood immunization-WHO position paper.WklyEpidemiol Recj2007，82(12): 93-104。而且广泛使用PCV7后的检测研究发现，非疫苗覆盖血清型引起的IB)发病率持续升高，例如19A，在美国，2000-2005年由19A引起的侵袭性肺炎链球菌疾病的增长超过330%。这种血清型替代可能消弱PCV7带来的益处。因此，开发价格适中并且适用中国国情的肺炎球菌结合疫苗迫在眉睫。
[0005]由于肺炎链球菌荚膜多糖分子量大多大于lOOOKDa，且粘度较大，在与蛋白结合过程中容易交联形成分子量更大的结合物凝胶，不利于分离纯化，亦不利于控制多糖蛋白结合物中的蛋白与多糖的质量比。因此，需要将纯化的荚膜多糖进行水解处理。世界专利WO 2008/079732 A2，提到可以用醋酸对18C型和3型荚膜多糖进行降解，其他专利如WO2007/071707 A2提到可以用微流体化法对多糖进行降解。但上述方法对于某些特殊的肺炎链球菌荚膜多糖的分离效果不佳，如在用醋酸对9V型和4型多糖进行酸水解过程中，导致9V型和4型多糖的抗原性丢失，表现为免疫双扩结果为阴性。
[0006]荚膜多糖的理化性质和生物活性与分子量及分子量分布有很大的关系。因此，在质量控制中，分子量是一个重要的指标。对于多糖类化合物，其分子量的描述和测定都较小分子困难得多。目前，传统的测定多糖分子量的方法是通过分子量标准品校正曲线来确定分子量大小以及分子量的分布。这些方法存在的问题在于，当所测样品的结构和性质与分子量标准品不同时，会给测定结果带来明显的误差。参见Wang W，Bo S，Li S, et al.Determination of the Mark-Houwink equation for chitosan with different degreesof deacctylation.1nt J Biol Macromolj 1991, 13:281 □本发明釆用高效凝胶体积排阻色谱(SEC)与多角度激光散射(MALLS)检测器、示差折光(RI)检测器联用增加了测定结果的准确性。该方法可以直接反应各型多糖的绝对分子量大小，不会受到实验条件的影响。操作更加简捷，提高了工作效率。
[0007]本发明的目的之一在于提供一种多价或者13价肺炎多糖结合疫苗。其中13价疫苗含有13种血清型，分别为1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，23F。较目前上市的7价肺炎结合疫苗提供更广泛的保护，而且成本经济。本发明的目的之二在于公开一种荚膜多糖的水解方法——超声降解，这种方法简便易操作，且容易线性放大，多糖回收率达到90%以上。本发明的目的之三在于应用一种荚膜多糖分子量的测定方法一多角度激光散射法，该方法简便快速，可以准确获得分子量大小以及多糖的分散度等信息；本发明的目的之四在于提供一种多糖蛋白结合物的制备方法，CDAP活化多糖，该方法简便，结合效率高。

【发明内容】
:
[0008]本发明公开了一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗，该疫苗可以是单价，也可以是多价，优选的是13价肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗，所述13价肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗，其中的肺炎链球菌荚膜多糖选自血清型为1，3，4，5，6A，6B, 7F，9V,14，18C，19A，19F，23F的肺炎链球菌产生的荚膜多糖，结合疫苗中的载体蛋白为CRM197蛋白或TT蛋白。
[0009]肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法很多，但本发明通过研究，找到一种新的肺炎链球菌荚膜多糖 蛋白结合疫苗的制备方法，所述方法，包括如下步骤:
[0010]一，将提取得到的肺炎链球菌荚膜多糖进行降解；
[0011]二，肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白的结合；
[0012]三，结合疫苗的纯化。
[0013]其中，所述提取得到的肺炎链球菌荚膜多糖是根据现有技术进行制备或从市场上购买得到，如通过培养肺炎链球菌，灭活，提取灭活的肺炎链球菌荚膜多糖以及对其进行纯化的方式得到。
[0014]其中，所述肺炎链球菌荚膜多糖的降解方法，包括如下步骤:
[0015]I)将血清型荚膜多糖溶于二纯水中，制备成浓度为l_4mg/ml的溶液，低温充分溶解；
[0016]2)冰水浴中，用功率为80-100W，频率为20_40kHz的超声波处理溶液，处理时间为10-30min，冷冻干燥；
[0017]3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小，待分子量降解至目标大小为50KDa-500KDa时得降解多糖。
[0018]优选的降解方法，包括如下步骤:
[0019]I)将荚膜多糖溶于二纯水中，制备成浓度为l_2mg/ml的溶液，4°C充分溶解；
[0020]2)冰水浴中，用功率为80-100W，频率为20kHz的超声波处理溶液。处理时间为10_30min ；
[0021]3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小为80KDa_300KDa。
[0022]其中，所述肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白的结合的方法；包括如下步骤:
[0023]I)取降解后的肺炎链球菌荚膜多糖，溶解于溶液中，形成浓度为2-10mg/ml的多糖溶液；[0024]2)向多糖溶液中缓慢加入浓度为100mg/ml的CDAP( 1-氰基_4_ 二甲氨基-吡啶四氟硼酸)乙腈溶液，使得溶液中CDAP与荚膜多糖的质量比为0.5-1.5:1，维持lmin-3min ；
[0025]3)加入 0.3M NaOH调节 pH 至 9-10，维持 l_5min，加入浓度为 2-lOmg/ml 的 CRM197溶液，使得溶液中CRM197与多糖的质量比为1-1.5:1，维持pH9.5，室温反应l_2h，加入2M甘氨酸终止反应，2-8°C缓慢搅拌6-18h。
[0026]4)利用Sepharose 4FF层析介质对结合物分别进行纯化:用0.2M氯化钠溶液洗脱，收集外水附近同时具有206nm和280nm吸收的洗脱液，即为肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物，0.22um无菌过滤后，2-8°C存放；
[0027]5)将肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物和药物可接受的辅料混合，按照常规技术制备成疫苗制剂。
[0028]优选的肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白的结合的方法；包括如下步骤:
[0029]I)取降解后的肺炎链球菌荚膜多糖，溶解于二纯水、2M NaCl或者0.2M NaCl溶液中，形成浓度为2-10mg/ml的多糖溶液；
[0030]2)向多糖溶液中缓慢加入浓度为100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP与荚膜多糖的质量比为1:1，维持1.5min-2min ；
[0031]3)加入0.3M NaOH调节pH至9.5，维持l-5min，加入溶度为5mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197与多糖的质量比为1.2:1，维持pH9.5，室温反应l_2h，加入2M甘氨酸终止反应，2-8 °C缓慢搅拌6-18h;
[0032]4)利用Sepharose 4FF层析介质对结合物分别进行纯化:用0.2M氯化钠溶液洗脱，收集外水附近同时具有206nm和280nm吸收的洗脱液，即为单价结合物原液。0.22um无菌过滤后，4 °C放置；
[0033]5)将肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物和药物可接受的辅料混合，按照常规技术制备成疫苗制剂。
[0034]以上制备方法适用于本发明所述的13种肺炎链球菌荚膜多糖中的任意一种，若制备成多价疫苗，则按照比例将按照前4步制备得到的各型单价结合物混合，加入适量药用辅料，制备成多价肺炎多糖蛋白结合疫苗，必要时加入铝佐剂。对于多价疫苗，其中各型多糖的浓度为4-8ug/ml,优选的是4ug/ml。
[0035]其中，肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，可以为:
[0036]肺炎链球菌的培养，方法如下:
[0037]在发酵罐中接种单菌型肺炎链球菌菌株后，pH控制在6.5-8.0,转速50_200r/min，培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在1-10%，当发酵液菌浓(0D600nm)达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在
0.01-2%，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。[0038]肺炎链球菌荚膜多糖的提取，方法如下:
[0039]所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取中，优选的步骤是:
[0040]a、取灭活后的肺炎链球菌培养液，去除菌体、菌体碎片及培养液中的小分子成分，得浓缩液；
[0041]b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为15-35%后，2_8°C静置过夜；
[0042]C、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为60-90%后，2-8°C静置过夜；[0043]d、所得静置液离心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液复溶后，离心去除沉淀，所得上清即为粗糖溶液；
[0044]肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制，方法如下:
[0045]所得粗糖溶液，采用S印harose 4 Fast Flow分子筛排阻层析分离，按照各个型别的肺炎多糖在欧洲药典5.0版中的标准收集大分子多糖；分离后的多糖采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得肺炎链球菌荚膜多糖。
[0046]优选的制备方法为:
[0047]取肺炎链球菌某型工作种子，接种于含10%脱纤维羊血营养琼脂平板上，370C ±1°C、5%C02培养箱中培养18-24h。验证无污染物。
[0048]将上述培养物刮下，接种在数个IL (培养基装量500ml)三角瓶中，于37°C ±2°C、5%C02培养箱中培养14-20h，于此过程中监测菌体密度(600nm)。当菌体密度达到2.0-2.5时，采用平板划线和镜检方法验证无污染物发生。
[0049]将1.5L上述培养物接种到50L发酵罐(装量30L)中，培养条件:培养温度370C ±2°C，pH维持在7.2±0.2，转速100r/min。接种后，培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩空气的通气方式，溶氧量控制在1_10%，较优的3-7%，更优的5%。培养过程检测菌浓(0D600nm)o当菌浓达到0.5-1时，将通气方式改成从发酵罐的顶部通压缩空气(表面通气)的通气方式，溶氧量控制在0-2%，较优的0.1-1%，更优的0.2%。当发酵液菌浓达到2-2.5，补充600ml 50%的葡萄糖，继续培养至菌体生长的平台期，加入终浓度0.5%的苯酚灭活菌体。继而进入荚膜多糖提取工艺阶段。
[0050]肺炎链球菌荚膜多糖的提取
[0051]上述已灭活的培养液，采用15000g离心30min去除菌体及菌体碎片，上清液进一步采用微滤或深层过滤的方式去除残余的颗粒性物质。澄清后的溶液采用IOOkDa的超滤系统浓缩并去除培养液中的小分子成分，最终得浓缩液约3L。
[0052]分步醇沉:上述浓缩液边搅拌边缓慢加入预冷无水乙醇，每100ml浓缩液加入33.3ml无水乙醇，充分混匀后4°C静置过夜。15000g离心30min去除沉淀，上清继续边搅拌边缓慢补加乙醇至终浓度80%，充分混匀后4°C静置过夜。15000g离心30min收集沉淀，沉淀采用0.2M NaCl溶液600ml复溶。15000g离心30min去除沉淀得上清，即为粗多糖溶液。
[0053]分子筛排阻层析分离:上述上清采用分子筛排阻层析S^harose CL-4B(其他分子筛排阻层析填料 Sephacryl S-200、Sepharose 4 Fast Flow>Superdex 200 等也可以米用)分离，紫外检测器(波长206nm)和示差检测器监测样品峰，收集相对分子量kd ( 0.20的样品峰。分离后的多糖样品采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得精制多糖，精制多糖产量为90-120mg/L发酵液。精制多糖存于_20°C以下冰箱中。精制多糖在层析柱上的分布情况为在206nm下有较高吸收峰的情况下，280nm下吸收值(主要代表蛋白峰)非常低，可见提取的多糖具有较高的纯度。
[0054]精制多糖特征鉴定
[0055]生化鉴定项目及方法参见欧洲药典5.0 ；
[0056]采用IH-NMR对精制多糖进行结构特征分析；
[0057]采用Pnl9F特异性血清(购自丹麦国家血清研究所)利用免疫双扩散或反向电流免疫电泳对精制多糖进行鉴定；
[0058]米用分子筛排阻层析(Sepharose CL-4B或Sepharose CL-2B)测定精制多糖的相
对分子量。
[0059]本发明还提供一种利用MALLS准确测定13种荚膜多糖分子量的方法。实施过程如下:
[0060]a将超声降解后的多糖配制成浓度为l_4mg/ml水溶液，
[0061]b利用SEC-R1-MALLS联用技术以0.2M NaCl为流动相，SRT-SEC 1000A为色谱分离柱，在流速0.5 mL柱温30 °C的条件下对超声降解后多糖水溶液进行检测。检测器为多角度激光检测器(MALLS)以及示差折光检测仪(RI)。
[0062]c对降解后多糖的分子量及分子量分布的检测实验结果如下:
[0063]I 型平均分子量 Mw 为:120.3-132.3KDa, Mw/Mn=l.21
[0064]3 型平均分子量 Mw 为:84.0-120.5KDa, Mw/Mn=l.18
[0065]4 型平均分子量 Mw 为:124.4-138.2KDa, Mw/Mn=l.24
[0066]5 型平均分子量 Mw 为:104.2-153.2KDa, Mw/Mn=l.26
[0067]6A 型平均分子量 Mw 为:215.8-325.2KDa, Mw/Mn=l.20
[0068]6B 型平均分子量 Mw 为:326.3-456.3KDa, Mw/Mn=l.25
[0069]7F 型平均分子量 Mw 为:318-425.3KDa, Mw/Mn=l.21
[0070]9V 型平均分子量 Mw 为:212.7-322.3KDa, Mw/Mn=l.32
[0071]14 型平均分子量 Mw 为:231.2-321.2KDa, Mw/Mn=l.25
[0072]18C 型平均分子量 Mw 为:111.8-232.2KDa, Mw/Mn=l.22
[0073]19A 型平均分子量 Mw 为:133.7-213.2KDa, Mw/Mn=l.29
[0074]19F 型平均分子量 Mw 为:168.8-320.0KDa, Mw/Mn=l.36
[0075]23F 型平均分子量 Mw 为:182.3-236.0KDa, Mw/Mn=l.28
[0076]d所述Mw为闻分子的重均分子量，Mw/Mn表不闻分子的分子量分布。
[0077]与现有肺炎结合疫苗相比，本发明的优点是:
[0078]I，本发明较PCV7又分别增加了 6种血清型肺炎链球菌:包括1，3，5，6A，7F和19A，组成13价的肺炎多糖结合疫苗，覆盖率提高，交叉保护率提高至90%以上；
[0079]2，本发明采用的多糖降解方法，使降解后的多糖黏度降低，分子大小更加均一，有利于结合物的分离纯化以及结合物的质量控制。降解后的荚膜多糖利用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)活化多糖形成氰酯键，然后与CRM197蛋白形成共价键。该方法简单易操作、结合效率高、获得的结合物的稳定性良好。
[0080]3，超声降解13种荚膜多糖的方法，该方法简单、易操作、容易实现线性放大、回收率高、在保留多糖的抗原完整性的基础上能够使多糖的分子量分布趋于均一。能够很好的满足产业化需求。
【具体实施方式】:
[0081]实施例1
[0082]7F超声降解:
[0083]a 称取7F多糖250mg，加入二纯水，制备成浓度为2.5mg/ml的溶液，4°C过夜溶解。在冰浴中，用功率为80-100W，频率为20kHz的超声波处理溶液，处理时间为23min。
[0084]b冷冻干燥
[0085]c利用SEC-R1-MALLS联用技术以0.2M NaCl为流动相，SRT-SEC 1000A为色谱分离柱，在流速0.5 mL柱温30 °C的条件下对超声降解后多糖进行检测。检测器为多角度激光检测器(MALLS)以及示差折光检测仪(RI )。
[0086]d结果如下表
[0087]表1 7F型多糖降解前后的质量比较
【权利要求】
1.一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法，包括将提取得到的肺炎链球菌荚膜多糖进行降解；降解后的肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白结合，随后制成疫苗制剂的步骤，其特征在于，其中降解后的肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白结合，随后制成疫苗制剂，包括以下步骤: O取降解后的肺炎链球菌荚膜多糖，溶解于溶液中，形成浓度为2-10mg/ml的多糖溶液； 2)向多糖溶液中缓慢加入浓度为100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP与荚膜多糖的质量比为0.5-1.5:1，维持lmin-3min ； 3)加入0.3M NaOH调节pH至9-10，维持l_5min，加入浓度为2-10mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197与多糖的质量比为1-1.5:1，维持pH9.5，室温反应l_2h，加入2M甘氨酸终止反应，2-8°C缓慢搅拌6-18h ； 4)利用Sepharose4FF层析介质对结合物分别进行纯化:用0.2M氯化钠溶液洗脱，收集外水附近同时具有206nm和280nm吸收的洗脱液，即为单价结合物原液；0.22um无菌过滤后，2-8 °C存放； 5)将肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物和药物可接受的辅料混合，按照常规技术制备成疫苗制剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中降解后的肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白结合，随后制成疫苗制剂包括以下步骤: 1)取降解后的肺炎链球菌荚膜多糖，分别溶解于二纯水、2MNaCl或者0.2M NaCl溶液中，形成浓度为2-10mg/ml的多糖溶液； 2)向多糖溶液中缓慢加入浓度为100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP与荚膜多糖的质量比为1:1，维持1.5min-2min ； 3)加入(λ3M NaOH调节pH至9.5，维持l-5min，加入溶度为5mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197与多糖的质量比为1.2:1，维持pH9.5，室温反应l_2h，加入2M甘氨酸终止反应，2-8 °C缓慢搅拌6-18h; 4)利用Sepharose4FF层析介质对结合物分别进行纯化:用0.2M氯化钠溶液洗脱，收集外水附近同时具有206nm和280nm吸收的洗脱液，即为单价结合物原液；0.22um无菌过滤后，4 °C放置； 5)将肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物和药物可接受的辅料混合，按照常规技术制备成疫苗制剂。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CRM197蛋白可用TT蛋白代替。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将提取得到的肺炎链球菌荚膜多糖进行降解，方法如下: 1)将不同的血清型荚膜多糖分别溶于二纯水中，制备成浓度为l_4mg/ml的溶液，低温充分溶解； 2)冰水浴中，用功率为80-100W，频率为20-40kHz的超声波处理溶液；处理时间为10-30min，冷冻干燥； 3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小，待分子量降解至目标大小为50KDa-500KDa时得降解多糖。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将提取得到的肺炎链球菌荚膜多糖进行降解，方法如下: 1)将不同的血清型荚膜多糖分别溶于二纯水中，制备成浓度为l_2mg/ml的溶液，4°C充分溶解； 2)冰水浴中，用功率为80-100W，频率为20kHz的超声波处理溶液；处理时间为10_30min ； 3)利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小为80KDa-300KDa。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述疫苗制剂为多价疫苗制剂，其中的肺炎链球菌荚膜多糖选自血清型为I, 3，4，5，6A，6B, 7F，9V, 14，18C，19A，19F，23F中的几种肺炎链球菌产生的荚膜多糖。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述疫苗制剂为13价疫苗制剂，其中的肺炎链球菌荚膜多糖血清型为I, 3，4，5，6A，6B, 7F，9V, 14，18C，19A，19F，23F的肺炎链球菌产生的荚膜多糖。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备多价疫苗制剂，则将按照前4步制备得到的各型单价结合物按照比例混合，加入药用辅料，必要时加入铝佐剂，制备成多价肺炎多糖蛋白结合疫苗制剂。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，对于多价疫苗，其中结合物混和后，各单价多糖的浓度为4-8ug/ml。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，对于多价疫苗，结合物混和后，各单价多糖的浓度均为4ug/ml。
【文档编号】A61P31/04GK103830723SQ201210491658
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月26日 优先权日:2012年11月26日
【发明者】赵秋敏, 孙倩, 李军强, 金永杰, 李亚冰, 刘贺军, 曹小丹, 李静, 李剑 申请人:天士力制药集团股份有限公司